分子凋亡檢測方法

Ⅰ 如何進一步證明細胞發生了凋亡

細胞凋亡的檢測細胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細胞凋亡形式，根據死亡細胞在形態學、生物化學和分子生物學上的差別，可以將二者區別開來。細胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法。一、細胞凋亡的形態學檢測根據凋亡細胞固有的形態特徵，人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態學檢測方法。1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡（1） 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。（2） 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T鹼基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。DAPI為半通透性，用於常規固定細胞的染色。

Ⅱ tunel法檢測細胞凋亡

TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)是檢測細胞凋亡的經典方法。聽樓上實驗室的同學說他們用BIODAI TUNEL法應用高活性的基因重組末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡細胞斷裂的DNA 3』-羥基（3』-OH）末端催化摻入熒光素-12-脫氧三磷酸尿苷（FITC-12-dUTP），通過檢測FITC-12-dUTP標記的DNA片段來檢測細胞凋亡。FITC-12-dUTP標記的DNA可以用熒光顯微鏡直接觀察，也可用流式細胞儀檢測。FITC-12-dUTP標記和未標記dNTP處於最佳搭配比例，這樣在進行3』-OH末端核苷酸摻入時，同一個斷裂的DNA片段末端可以有更多的FITC-12-dUTP摻入，從而提高了檢測的靈敏度，減少了背景反應

Ⅲ 細胞凋亡檢測方法有哪些

細胞凋亡的形態學檢測

1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡

(1) 未染色細胞:凋亡細胞的體積變小、變形,細胞膜完整但出現發泡現象,細胞凋亡晚期可見凋亡小體.

貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落.

(2) 染色細胞:常用姬姆薩染色、瑞氏染色等.凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態.

2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況.

常用的DNA特異性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI.三種種染料與DNA的結合是非嵌入式的,主要結合在DNA的A-T鹼基區.紫外光激發時發射明亮的藍色熒光.

Hoechst是與DNA特異結合的活性染料,儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用時用PBS稀釋,終濃度為10 ug/ml.

DAPI為半通透性,用於常規固定細胞的染色.儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用終濃度一般為10 ug/ml.

結果評判:細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期:Ⅰ期的細胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased),部分染色質出現濃縮狀態;Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊,產生凋亡小體(圖1).

3 透射電子顯微鏡觀察

結果評判:凋亡細胞體積變小,細胞質濃縮.凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的細胞核內染色質高度盤繞,出現許多稱為氣穴現象(cavitations)的空泡結構(圖2);Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;細胞凋亡的晚期,細胞核裂解為碎塊,產生凋亡小體.

Ⅳ 如何用DNA Ladder 法檢測細胞凋亡

DNA ladder法就是凝膠電泳DNA片段測定法

DNA Ladder 法檢測細胞凋亡方法如下：
1、凋亡處理：細胞經凋亡處理後，收集細胞（包括懸浮細胞），用70%乙醇-20度固定2h。
2、裂解細胞： 加400ml細胞裂解液，充分搖勻後再加蛋白酶K（10mg/ml），置65度水浴消化至少2h或過夜。
3、處理蛋白：加75ml 8mol/L KAc，4度 15min，再加750ml氯仿，充分混勻後，離心5000r/min 10min後，將上清移至一新的EP管。
4、沉澱DNA：加入750ml無水乙醇，輕柔搖勻即可見乳白色沉澱，若不明顯時可置-20度過夜，12000r/min，10min離心後，用70%乙醇洗DNA兩次。
5、溶解DNA：加50ml無菌雙蒸水，37度溶解DNA。
6、測定DNA的濃度。
7、2%瓊脂糖凝膠電泳80V 2h。

Ⅳ 怎樣鑒定細胞凋亡

細胞凋亡的檢測

細胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細胞凋亡形式，根據死亡細胞在形態學、生物化學和分子生物學上的差別，可以將二者區別開來。細胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法。

一、細胞凋亡的形態學檢測
根據凋亡細胞固有的形態特徵，人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態學檢測方法。
1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡
（1） 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。
貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。
（2） 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。
2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。
常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T鹼基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。
Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。
DAPI為半通透性，用於常規固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。
結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體(圖1)。
3 透射電子顯微鏡觀察
結果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象（cavitations）的空泡結構(圖2)；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。

二、磷脂醯絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂醯絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位於細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。
方法
1 懸浮細胞的染色：將正常培養和誘導凋亡的懸浮細胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應5min後，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測（一般不超過1h）， 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。
2 貼壁培養的細胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細胞。
3 爬片細胞染色：同上，最後用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。
結果 [圖4、圖5]
注意事項
1. 整個操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞。
2. 操作時注意避光，反應完畢後盡快在一小時內檢測。

三、線粒體膜勢能的檢測
線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發生凋亡，而線粒體跨膜電位DYmt的下降，被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件，它發生在細胞核凋亡特徵（染色質濃縮、DNA斷裂）出現之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。
線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。
方法：將正常培養的細胞和誘導凋亡的細胞加入使用終濃度為Rhodamine 123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式細胞計檢測細胞的熒光強度。
注意事項
1． 始終保持平衡染液中pH值的一致性，因為pH值的變化將影響膜電位。
2． 與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結合，降低染料的濃度，引起假去極化。

四、DNA片斷化檢測
細胞凋亡時主要的生化特徵是其染色質發生濃縮, 染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經處理後，採用常規方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA後，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然後進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。
1. 大分子染色體DNA片段的測定
細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細胞凋亡早期產生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常採用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向改變後，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向後，才能繼續向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當DNA分子變換方向的時間小於電脈沖周期時，DNA就可以按其分子量大小分開。
參考文獻 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-inced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
2． DNA Ladder 測定
方法：收獲細胞（1′107）沉澱?細胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，
2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉澱DNA，4°C過夜?14000rpm′15min?最後將沉澱溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色並照相。
結果：[圖6]
參考文獻 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507
3． 凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析
方法：收集細胞?70%冷乙醇（in PBS）4°C固定過夜?PBS洗滌，1000rpm′10min?RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min?PI（50mg/ml）染色，室溫避光15min?FACScan分析DNA亞二倍體的形成及細胞周期的變化。
結果：[圖7]
4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
優點：敏感度高，適合於檢測少量樣本，小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。

五 TUNEL法
細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、鹼性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能准確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特徵，可用於石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，並可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛採用。

六、Caspase-3活性的檢測

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在於胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：
收集細胞→PBS洗滌→抽提細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2h或4°C過夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應1~2h或4°C過夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-標記的羊抗鼠IgG或AP標記的羊抗鼠IgG室溫反應1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。
結果：[圖8-1、圖8-2]
2 熒光分光光度計分析
原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據這一特點，設計出熒光物質偶聯的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯時，AMC不能被激發熒光，短肽被水解後釋放出AMC，自由的AMC才能被激發發射熒光。根據釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌?制備細胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37°C反應1h?熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發光波長380nm，發射光波長為430-460nm）。
結果：[圖9]
3 流式細胞術分析
方法：收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌?加Ac-DEVD-AMC?37°C反應1h?UV流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數和平均熒光強度。
結果：[圖10]

七、凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析
TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發現，凋亡早期TFAR19表達水平增高並出現快速核轉位現象，伴隨著細胞核形態學的變化，持續較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發現，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早於磷脂醯絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現TFAR19高表達和核轉位。這為研究細胞凋亡早期所發生的事件，提供了一種新的技術和指標。
（一）TFAR19蛋白的細胞定位分析
材料試劑：
FITC標記的單克隆抗體，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，熒光細胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip頭，移液器。
儀器：低溫水平離心機, 37°C水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細胞計
方法：
1 懸浮細胞的染色：
（1）收獲正常和誘導凋亡的細胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。
（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應30min。
（5）加入5ml FITC標記的TFAR19單抗（終濃度為1：40），4°C反應30min
（6）熒光細胞洗液洗2次，1000rpm′10min。
結果觀察：將細胞沉澱滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位。同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度。[圖11]
2：貼壁細胞的原位染色
（1） 貼壁生長的對數期細胞鋪在24孔或6孔板中（內有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到
50%~80%滿時，凋亡誘導劑處理細胞。
（2） 將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色，染色步驟同上。
（3） 將染色的爬片細胞放於一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微
鏡觀察TFAR19在細胞中的定位。
結果觀察：[圖12]
3：臨床病理切片的染色、檢測。
4：原代細胞的培養、檢測。
5：分析TFAR19蛋白在人體內各組織器官的分布及定位
（二）TFAR19蛋白的表達與臨床疾病
1． ELISA法檢測正常人和疾病狀態下，以及疾病的不同時期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。
材料和試劑：
1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer
2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
3. 封閉液： 3%BSA（用洗滌液配製）
4. 酶標抗體的稀釋：用封閉液稀釋
5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g
檸檬酸 0.51g
DDW 100ml
6. 顯色液（現配現用）：底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA
Reader（OD490nm），洗板機
操作步驟
1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C過夜（一般24h以上）。
2. 洗滌Buffer洗板三次，加入封閉液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C
過夜。
3. 洗滌Buffer洗板三次，加入不同稀釋度的病人血清（3個重復孔）100ml/well ，37°C孵育1h。設包被Buffer、洗滌Buffer 、封閉液為陰性對照。
4. 洗滌Buffer洗板三次，加入1：2500稀釋的HRP標記的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
5. 洗滌Buffer洗板三次，加入顯色液，100 ml/well，避光反應10~15min。
6. 加入H2SO4終止反應，50 ml/well。
7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值，分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達水平。
2． Western blot 分析原發性腫瘤細胞和正常細胞的TFAR19蛋白的表達水平。

來源（北京大學人類疾病研究中心）：
http://gene.bjmu.e.cn/news/apoptosis.htm

——————————————————————————————————————————————————————————————————————————

細胞壞死的鑒定

細胞壞死是因病理而產生的被動死亡，如物理性或化學性的損害因子及缺氧與營養不良等均導致細胞壞死。壞死細胞的膜通透性增高，致使細胞腫脹，細胞器變形或腫大，早期核無明顯形態學變化，最後細胞破裂。另外壞死的細胞裂解要釋放出內含物，並常引起炎症反應；在癒合過程中常伴隨組織器官的纖維化，形成瘢痕。

Ⅵ 根據細胞凋亡的生化特徵到目前為止DNA的什麼方法仍然是鑒定細胞凋亡最可靠的方法

鑒定細胞凋亡的方法有
1、染色法
2、電泳法看DNA ladder
3、彗星電泳法
4、流式細胞儀法
5、DNA斷裂的末端標記法
6、細胞組分變化：細胞凋亡時細胞膜上磷脂醯絲氨酸從內膜翻至外膜
7、檢測cyt c等

Ⅶ 最常用的細胞凋亡檢測方法是什麼

細胞死亡的方式主要有兩種，包括 細胞壞死（necrosis）和細胞凋亡（apoptosis） 。細胞壞死是早已被認識到的細胞死亡方式，而細胞凋亡是近年來逐漸被認識且越來越受到重視的細胞死亡方式。兩種死亡方式最重要的區別是細胞壞死會釋放出細胞內溶物， 引起炎性反應 ，而細胞凋亡不會暴露細胞內溶物，一般被吞噬細胞吞噬清除， 不引起炎性反應 。

細胞凋亡，也稱 細胞程序性死亡，是指在一定的生理或者病理條件下，細胞主動的、高度有序的、自己結束其生命的過程 。細胞凋亡是生物體中一種普遍存在的現象，胚胎形成、個體發育、衰老和損傷細胞的清除等都與細胞凋亡密切相關。細胞凋亡在免疫學中也非常重要，如T細胞在胸腺內發育的過程，經過陰性選擇和陽性選擇後，95%的胸腺細胞發生凋亡，只有5%的胸腺細胞發育為成熟T細胞進入外周。

檢測細胞凋亡的方法很多，如電子顯微鏡或者光學顯微鏡下的形態學觀察、細胞DNA提取物的DNA梯狀帶電泳實驗等。而流式細胞術是非常重要的檢測細胞凋亡的方法，不僅可以定性，也可以定量。流式細胞術檢測細胞凋亡的方法也有很多，其中最重要是annexinV/PI雙染色法。其他的還有SYTO/PI雙染色法、細胞DNA含量分析法、線粒體損傷檢測法、活化的caspase-3檢測法、FLICA標記法、甲醯胺誘導ssDNA單抗檢測法、TUNEL法等。今天主要介紹一下annexinV/PI雙染色法。

Annexin V/PI雙染色法

正常細胞膜的磷脂分布是不對稱的，活細胞中 磷脂醯絲氨酸(phosphatidylserine,PS） 位於 細胞膜的內表面 ，細胞凋亡時，細胞膜發生變化， PS從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表 面。 annexinV是一種對PS有高度親和力的、鈣依賴性的磷脂結合蛋白 ，annexinV可以特異性地識別凋亡細胞表面的PS，而 活細胞的PS位於細胞膜的內表面 ，無法與annexinV特異性結合。所以可以用FITC偶聯的annexinV鑒別凋亡細胞和活細胞。

壞死細胞的PS也會從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表面，annexinV也能識別壞死細胞表面的PS，所以 annexinV無法區分壞死細胞和凋亡細胞 。而 PI染料能夠與細胞內的DNA結合 ， 區分壞死細胞和活細胞 。凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整，PI染料無法自由通過細胞膜進入細胞內與DNA結合，所以 PI染料無法標記凋亡細胞和活細胞 ，而PI染料卻能夠通過壞死細胞的細胞膜與細胞內的DNA結合，壞死細胞內PI染料被488nm激光激發後會發射紅熒光，被FL2或FL3通道接收。所以 annexinV和PI同時使用，就可以區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞 ，這就是annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡的原理。

標記方法與常規標記熒光抗體的方能一樣：加入適量的FITC­annexinV和PI，4℃靜置30min即可。注意 標記PI的方法與PI染色檢測細胞內DNA含量的方法不同，不需提前固定細胞 ，因為本方法標記PI是為了檢測細胞膜的通透性從而鑒別細胞是活細胞還是死細胞，而用PI檢測DNA含量時必須先破壞活細胞的細胞膜的完整性使PI進入細胞內與DNA結合。

下圖是用annexinV/PI雙染色法檢測細胞凋亡得到的一張散點圖。圖中大致可以分為三大細胞群：右上象限的細胞表型為annexinV+PI+，代表的是壞死細胞；右下象限的細胞表型為annexinV＋PI-，代表的是凋亡細胞；左下象限的細胞表型為annexinV-PI-，代表的是活細胞。通過annexin V/PI雙染色法可以非常明確地區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，並且可以定量分析各自所佔的比例。

例：

下圖引自［1］，作者用annexinV/PI雙染色法檢測肺癌細胞系「H1299」和「A549」細胞凋亡，證明肺癌細胞表面的TLR4受體與LPS結合後，能夠增強其抵抗TNFα和TRAIL誘導的凋亡。

從圖中可以看出，TRAIL誘導後，H1299肺癌細胞系的凋亡比例從3.36%上升到13.7%，被TNF-α/CHX誘導後，凋亡比例上升到16.9%；如果在誘導前加入LPS，活化H1299表面TLR4信號，被TRAIL誘導後凋亡比例只有3.8%，被TNF-α/CHX誘導後凋亡比例只有3.93%,說明H1299表面TLR4信號的活化能夠促進其抵抗凋亡。另一個肺癌細胞系A549的結果也相似，LPS活化TLR4信號後，TRAIL誘導凋亡比例從16%下降到3.09%，而TNF-α/CHX誘導凋亡比例從17%下降到11.8%。

［1］Weigang He, Qiuyan Liu, Li Wang, et al. 2007. TLR4 signaling promotes immune escape ofhuman lung cancer cells by incing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Molecular Immunology, 44:2850-2859.