1. 如何設計一種檢測動物或植物中某病毒的免疫學方法(只有已知的該病毒標准抗原)
這個得具體問題具體分析。看你想達到什麼檢測目的了，另外還得看是什麼病毒，存在於動植物什麼部位。最簡單的就是沉積實驗：用標准抗原免疫鼠或兔等使其產生抗體，再用其血清作個沉積實驗就可以了。這個實驗不敏感，需要抗原抗體量較大，如果是特殊病毒或是感染初期，則檢測不到。如果你有條件的話可以做ELISA，這個實驗敏感性強。
一,基本原理
它採用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接,然後通過酶與底物產生顏色反應,用於定量測定.測定的對象可以是抗體也可以是抗原.
在這種測定方法中有3種必要的試劑:
①固相的抗原或抗體(免疫吸附劑)
②酶標記的抗原或抗體(標記物)
③酶作用的底物(顯色劑)
測量時,抗原(抗體)先結合在固相載體上,但仍保留其免疫活性,然後加一種抗體(抗原)與酶結合成的偶聯物(標記物),此偶聯物仍保留其原免疫活性與酶活性,當偶聯物與固相載體上的抗原(抗體)反應結合後,
再加上酶的相應底物,即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色.
其所生成的顏色深淺與欲測的抗原(抗體)含量成正比.
這種有色產物可用肉眼,光學顯微鏡,電子顯微鏡觀察,也可以用分光光度計(酶標儀)加以測定.
其方法簡單,方便訊速,特異性強.
二,酶及其底物
酶結合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯劑作用下聯結的產物.是ELISA成敗的關鍵試劑,它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應,還具有酶促反應,顯示出生物放大作用,但不同的酶選用不同的底物 ,將得到不同的顏色反應.
360,450
420
熒光
黃色
甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)
硝基酚半乳糖苷(ONPG)
β-D-半乳糖苷酶
405
420
黃色
深藍色
ABTS+HRP+葡萄糖
葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭
葡萄糖氧化酶
400
500
黃色
紅色
4-硝基酚磷酸鹽(PNP)
萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽
鹼性磷酸酯酶
492
460
449
425
642
橘紅色
黃色
棕色
蘭色
藍綠色
鄰苯二胺
四甲替聯苯胺
氨基水楊酸
鄰聯苯甲胺
2,2'-連胺基-2(3-乙基-並噻唑啉磺酸-6)銨鹽
辣根過氧化物酶
測定波長
顯色反應
底 物
酶
ELISA的種類和變化
(一)雙抗體夾心法
(二)間接法
(三)競爭法
(四)雙位點一步法
(五)捕獲法測IgM抗體
(六)應用親和素和生物素的ELISA
(一)雙抗體夾心法
此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原
獲得待分析物的未標定抗體
將特異性抗體與固相
載體連接形成固相抗體
洗滌除去未結合的
抗體及雜質
加入封閉蛋白溶液以封閉載體
表面殘留的蛋白結合位點
洗滌並除去未結合的封閉蛋白
加受檢標本(抗原)形成
固相抗體-抗原復合物
洗滌除去其他
未結合的物質
加酶標抗體生成
抗體—待測抗原—酶標記抗體
的復合物
徹底洗滌
未結合的
酶標抗體
加底物進行
酶催化反應
根據顏色反應的
程度進行該抗原
的定性或定量測定
間接法是檢測抗體最常用的方法,其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體,故稱為間接法.
(二)間接法
包被固相載體:
用已知抗原包被
固相載體
加待檢標本:
使相應抗體與固相抗原結合
洗滌,除去無關的物質
加酶標抗抗體:
與固相載體上抗原抗體
復合物結合;洗滌,除去
未結合的酶標抗抗體
加底物
顯色
根據顏色反應的程度進行
該抗原的定性或定量測定
(三)競爭法
此法可用於抗原和半抗原的定量測定,也可用於測定抗體 .
用已知特異性
抗體包被
固相載體
測定管加待測抗原和
一定量的酶標抗原使二者與
固相抗體競爭結合
對照管只加一定量酶標抗原
與固相抗體直接結合
分別洗滌
除去未結合
的成分
加底物顯色
分別測定兩管的吸光度值,
根據對照管與測定管吸光度值之比,
計算標本中待測抗原含量
對照管由於只加酶標抗原,與固相抗體充分結合,故分解底物顯色深;測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結合的結果而異.如待測抗原量多,競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結合,使固相上結合的酶標抗原量減少.因此,加入底物後顯色反應較弱.
特點一:靈敏性
該測定法的靈敏度來自作為報告集團的酶.眾所周知, 酶是一種有機催化劑,很少量的酶即可誘導大量的催化反應 ,產生可供觀察的顯色反應現象.因此該體系常被稱為酶放大體系.ELISA實現了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位,或在微克,甚至納克水平上對其進行定量.
例如,在測定血清中某一物質的含量時,化學比色法的敏感度為mg/ml水平,酶反應測定法的敏感度約為5~10μg/ml .
特點二:特異性
其特異性來自抗體或抗原的選擇性.抗原抗體的結合實質上只發生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間.由於兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系,所以抗原抗體反應具有高度的特異性.
例如乙肝病毒中的表面抗原(HBsAg),e抗原(HBeAg)和核心抗體(HBcAg),雖來源於同一病毒,但僅與其相應的抗體結合,而不與另外兩種抗體反應.抗原抗體反應的這種特異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質化合物(例如血清)中測定某一特定的物質,而不需先分離待檢物.
ELISA應用實例
飼料中鹽酸克倫特羅的測定
飼料中毒素的測定(主要包括黃麴黴毒素, 簡麴黴毒素 )
飼料中有害微生物的快速篩檢 (如沙門氏菌 )
甲胺磷殘留分析
甲基對硫磷殘留分析
呋喃丹殘留分析
ELISA在飼料安全檢測中的應用
ELISA用於農葯殘留的檢測
河豚毒素
植物毒素如罌粟鹼,嗎啡,藻類毒素
苯並芘
主要有除草劑與殺蟲劑兩大類
例如殺暝松( FN ),
甲氟磷酸異已酶( SOMAN ),
草不綠( Alachor ),
西維因( Carbaryl ),
多菌靈及克菌丹( Captan )等.
農葯的檢測:
ELISA檢測 "非典型肺炎"冠狀病毒
ELISA在結締組織病早期診斷中的應用檢測抗異質性胞核核糖蛋白A2(hnRNPA2)/類風濕性關節炎(PtA)33抗體
ELISA在疾病診斷中的作用
ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體
ELISA試劑盒商業資訊
ELISA試劑盒
酶聯免疫井
DNM-9602G酶標分析儀
DNM-9602 標配酶標分析儀
DNM-9602A酶標分析儀
幾種酶標分析儀
(一) 原理
ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、牽9體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由於抗原、抗體的反應在一種固相載體——聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育後，可通過洗滌除去多餘的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用於檢測抗體的間接法(圖a)、用於檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用於檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
(二) 操作步驟
方法一 用於檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鍾。(簡稱洗滌，下同)。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然後洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。
3. 加酶標抗體：於各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定後的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
4. 加底物液顯色：於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鍾。
5. 終止反應：於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結果判定：可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以「+」、「-」號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，於450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零後測各孔O·D值，若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
方法二 用於檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)於反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鍾，洗滌,最後一遍用DDW洗滌。其餘步驟同「雙抗體夾心法」的4、5、6。
(三) 試劑器材
1. 試劑
(1) 包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):
NaCO31.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸餾水至1000ml
(2) 洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸餾水至1000ml
(3) 稀釋液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗滌緩沖液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清與洗滌液配成5～10％使用。
(4) 終止液(2M H2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。
(5) 底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml 0.1M 檸檬酸(19.2克／L) 24.3ml 加蒸餾水50ml。
(6) TMB(四甲基聯苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml無水乙醇) 0.5ml底物緩沖液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl
(7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物緩沖液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl
(8) 抗原、抗體和酶標記抗體。
(9) 正常人血清和陽性對照血清。
2. 器材:
(1) 聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標板)40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。
(2) 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。
(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。
(四) 注意事項
1. 正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的准確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可採用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2. 在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:
(1) 固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙醯胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。
（2) 包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多採用4℃18～24小時。蛋白質包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進行包被後，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對於多數蛋白質來說通常為1～10μg／ml。
(3) 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。然後再固定其它條件或採取「方陣法」(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統里准確地滴定其工作濃度。
(4) 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間後，應加入強酸或強鹼以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鍾為宜。底物使用液必須新鮮配製，尤其是H2O2在臨用前加入。
2. 核酸檢測方法
對於新型冠狀病毒的核酸檢測，首先根據試劑盒說明書」樣本要求「部分進行樣本採集，常規的樣本類型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等。
獲得患者樣本後，需盡快進行檢測，如無法立即檢測需要轉運的樣本，應按照說明書的要求進行低溫封裝，並送到專門的檢測機構進行檢測。檢測機構收到樣本後，對樣本進行核酸提取，核酸提取試劑應使用批准產品說明書中指定的核酸提取試劑盒。
病毒RNA需要首先逆轉錄為cDNA，再進行擴增檢測。PCR擴增和檢測應使用批准產品說明書中指定的熒光定量PCR儀，通過熒光定量PCR所得到的樣本Ct值的大小，可以判斷患者樣本中是否含有新型冠狀病毒。
(2)牛冠狀病毒檢測方法擴展閱讀
核酸檢測原理
所有生物除朊病毒外都含有核酸，核酸包括脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），新型冠狀病毒是一種僅含有RNA的病毒，病毒中特異性RNA序列是區分該病毒與其它病原體的標志物。新型冠狀病毒出現後，我國科學家在極短的時間里完成了對新型冠狀病毒全基因組序列的解析。
並通過與其它物種的基因組序列對比，發現了新型冠狀病毒中的特異核酸序列。臨床實驗檢測過程中，如果能在患者樣本中檢測到新型冠狀病毒的特異核酸序列，應提示該患者可能被新型冠狀病毒感染
3. 新型冠狀病毒抗原檢測怎麼做
新冠抗原檢測篩查即新型冠狀病毒抗原檢測篩查，通常是被檢測者需要將鼻腔當中的鼻涕清理干凈，使用鼻拭子在鼻腔部位大約1cm處旋轉四周，將鼻拭子放置在保存液中充分混合後，然後滴入檢測的樣本孔中等待結果。
新型冠狀病毒抗原檢測篩查是用於檢測是否感染新型頃敬冠狀病毒及其變異毒株的有效手段，新型冠狀病毒抗原檢測篩查屬於比較簡單、快捷的檢測方式，自己居家可以操作，不需要特定的人員或者工作人員操作。在進行檢測前需要用流動的清水清洗手部，將鼻腔當中的鼻涕擤出來，使用特定的鼻拭子插入鼻腔約1-1.5cm的喊乎斗鄭磨部位，旋轉採集鼻腔分泌物，然後將採集拭子收集在樣品管保存液當中，讓拭子保持30秒，然後放置在樣品孔大約15-20分鍾，通過抗原和抗體結合可以有效檢測出是否感染新型冠狀病毒。
若在檢測盒C區和T區均出現一條紅色或是紫色橫線，結果為陽性，如果僅在C區出現一條橫線，則結果陰性，暫時未檢測到新型冠狀病毒，如果C區無任何變化，結果無效，需再次進行檢測。如果感染新型冠狀病毒之後出現相應症狀，可及時使用退燒葯、止咳葯等葯物進行對症治療。