薄層色素檢測方法

A. HPLC、UV、GC、TLC是什麼檢測方法

TLC:薄層色譜法.系將適宜的固定相塗布於玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。待點樣、展開後，根據比移值（Rf）與適宜的對照物按同法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對比，用以進行葯品的鑒別、雜質檢查或含量測定的方法。薄層色譜法是快速分離和定性分析少量物質的一種很重要的實驗技術，也用於跟蹤反應進程。
PC:紙色譜法.是一種可以測試物質的純度與分離混合物的方法，因為它可以快速的完成分析，而且對材料的限制很少，所以是一種極方便而且有用的分析方法。紙色譜法用的分離原則跟薄層色譜法一樣，物質分布在一個固定相與流動相。固定相通常是濾紙，流動相會帶著物質在上面流動，這個裝置將會根據混合物中不同物質對固定相的附著力和對流動相的溶解度而分離出來。分析顏料時，如果顏料中含有不只一種物質，不同顏色的物質會就根據溶劑和不同溶質的極性分開，這是因為不同的分子結構極有可能有不同的極性。這些不同的極性造就對溶劑的不同溶解度，使各種溶質會在溶劑擴散的不同位置沉澱在固定相上以斑點呈現，就可以根據固定相上的斑位置及大小作分析。
HPLC:高效液相色譜法.是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，採用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。
GC:氣相色譜.可分為氣固色譜和氣液色譜。氣固色譜指流動相是氣體，固定相是固體物質的色譜分離方法。例如活性炭、硅膠等作固定相；氣液色譜指流動相是氣體，固定相是液體的色譜分離方法。例如在惰性材料硅藻土塗上一層角鯊烷，可以分離、測定純乙烯中的微量甲烷、乙炔、丙烯、丙烷等雜質。

B. 合成色素的檢測

鑒於食用合成色素的不安全性，國家也加強了對合成色素的監管，制訂了食品添加劑使用標准（GB 2760-2011），另外對合成色素的檢測也非常重要，國家標准食品中合成著色劑的測定標准（GB/T 5009.35-2003)中規定了對新紅、檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、赤蘚紅、亮藍、靛藍這8中合成色素的3種檢測方法，分別為高效液相色譜法、薄層色譜法、示波極譜法。
1.高效液相色譜法
食品中人工合成著色劑用聚醯胺吸附法或液-液分配法提取，製成水溶液，注入高效液相色譜儀，經反相色譜分離，根據保留時間定性和與峰面積比較進行定量。
2.薄層層析法
薄層層析法原理是依據水溶性酸性合成著色劑在酸性條件下被聚醯胺吸附，而在鹼性條件下解吸附，再用紙色譜法或薄層色譜法進行分離後，與標准比較定性、定量。該方法具有操作簡單的特點。
3.示波極譜法
食品中的合成著色劑，在特定的緩沖溶液中，在滴汞電極上可產生敏感的極譜波，波高與著色劑的濃度成正比。當食品中存在一種或兩種以上互不影響測定的著色劑時，可用其進行定性定量分析。缺點是存在著色劑較多或存在干擾，將不能准確測定。
4.其他方法
其他檢測合成色素的方法有微柱法 、導數伏安法 、毛細管電泳法 、靜電離子色譜法 、光譜掃描法 。

C. 什麼是TLC檢測

薄層色譜法（TLC），系將適宜的固定相塗布於玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。

待點樣、展開後，根據比移值（Rf）與適宜的對照物按同法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對比，用以進行葯品的鑒別、雜質檢查或含量測定的方法。薄層色譜法是快速分離和定性分析少量物質的一種很重要的實驗技術，也用於跟蹤反應進程。

基本原理

薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分離法，它利用各成分對同一吸附劑吸附能力不同，使在流動相(溶劑)流過固定相(吸附劑)的過程中，連續的產生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達到各成分的互相分離的目的。

薄層層析可根據作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析(吸附劑)、薄層分配層析(纖維素)、薄層離子交換層析(離子交換劑)、薄層凝膠層析(分子篩凝膠)等。一般實驗中應用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。

吸附是表面的一個重要性質。任何兩個相都可以形成表面，吸附就是其中一個相的物質或溶解於其中的溶質在此表面上的密集現象。在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的表面上，都可能發生吸附現象。

物質分子之所以能在固體表面停留，這是因為固體表面的分子(離子或原子)和固體內部分子所受的吸引力不相等。在固體內部，分子之間相互作用的力是對稱的，其力場互相抵消。

而處於固體表面的分子所受的力是不對稱的，向內的一面受到固體內部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質分子在運動中遇到固體表面時受到這種剩餘力的影響，就會被吸引而停留下來。

吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來。在單位時間內被吸附於吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內離開此表面的分子之間可以建立動態平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過程就是不斷地產生平衡與不平衡、吸附與解吸的動態平衡過程。

例如用硅膠和氧化鋁作支持劑，其主要原理是吸附力與分配系數的不同，使混合物得以分離。當溶劑沿著吸附劑移動時，帶著樣品中的各組分一起移動，同時發生連續吸附與解吸作用以及反復分配作用。

由於各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對它們的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列斑點。如作為標準的化合物在層析薄板上一起展開，則可以根據這些已知化合物的Rf值(後面介紹Rf值)對各斑點的組分進行鑒定，同時也可以進一步採用某些方法加以定量。

制備TLC

TLC還可用於少量如100毫克左右的化合物的分離，此時混合物樣品不是「點」在板上，而是塗抹在TLC板上且高於洗脫劑液面上的位置，形成一條水平的樣品帶。

然後如同展開小型TLC板一樣將制備TLC板展開並晾乾，然後將每條攜帶不同化合物的色帶從板上分別刮下，並用合適的溶劑萃取洗滌（如二氯甲烷）並過濾掉固定相等不溶物，得到濾液後再脫除溶劑就得到純凈的化合物。

對於小量且易於分離的反應產物，制備TLC較柱色譜法在時間、效率和經濟上更占優勢。顯然，這種方法得到的TLC板不可用全部用化學方法顯色，否則會導致樣品全部損失。因此可使用一些不會破壞樣品的顯色方法，如紫外線。

或者，可刮下板上部分的吸附相進行鑒定，也可以割下部分的TLC板用顯色劑（如碘）找到需要的化合物。

應用

在有機化學中，有機反應可通過TLC進行定性的檢測。使用毛細管將樣品點於TLC板上：一個點表示起始原料，一個點表示反應體系，一個點表示兩者「混合點」。一個小型TLC板（3X7cm）只需幾分鍾就可以完全展開。

整個分析過程是定性的，它可顯示起始原料是否消失即是否反應已經完成；是否有產物出現以及產生了多少產物。需注意的是，從低溫環境中取樣的TLC結果可能會出現誤差，因為樣品的溫度在毛細管中就已經升至室溫，其與低溫反應瓶內的反應將不一樣。例如DIBAL-H還原酯制備醛的反應。

以上內容參考網路-薄層色譜法

D. 儀器分析——薄層色譜法

薄層色譜法，系將供試品溶液點樣於薄層板上，經展開、檢視後所得的色譜圖，與適宜的塌亮對照物按同法所得的色譜對比，用於葯品的鑒別或雜質檢查的方法。

1.儀器與材料

（1）薄層板

自製薄層板玻板要求光滑、平整，洗凈後不附水珠，晾乾。最常用的固定相有硅膠G、硅膠GF254、硅膠H和硅膠HF254，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F254等。其顆粒大小，一般要求直徑為5～40μm.

薄層塗布，一般可分為無黏合劑和含黏合劑兩種；前者系將固定相直接塗布於玻板上，後者系在固定相中加入一定量的黏合劑，一般常用10%～15％煅石膏（CaSO4·2H2O在140℃加熱4小時），混勻後加水適量使用，或用羧甲基纖維素鈉水溶液（0.2%～0.5％）適量調成糊狀，均勻塗布於玻板上。使用塗布器塗布應能使固定相在玻板上塗成一層符合厚度要求的均勻薄層。

市售薄層板分普通薄層板和高效薄層板，如硅膠薄層板、硅膠GF254薄層板、聚醯胺薄膜和鋁基片薄層板等。

（2）點樣器同紙色譜法項下。

（3）展開容器應使用適合薄層板大小的玻璃制薄層色譜展開缸，並有嚴密的蓋子，底部應平整光滑，或有雙槽。

（4）顯色劑見各品種項下規定。可採用噴霧顯色、浸漬顯色或置碘蒸氣中顯色，檢出斑點。

（5）顯色裝置噴霧顯色要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細霧狀噴出；浸漬顯色可用專用玻璃器械或用適宜的玻璃缸代用；蒸氣熏蒸顯色可用雙槽玻璃缸或適宜大小的乾燥器代替。

（6）檢視裝置為裝有可見光、短波紫外光（254nm）、長波紫外光（365nm）光源及相應濾片的暗箱，可附加攝像設備供拍攝圖像用，暗箱內光源應有足夠的光照度。

2.操作方法

（1）薄層板制備

自製薄層板除另有規定外，將1份固定相和3份水在研缽中向一方向研磨混合，去除表面的氣泡後，倒入塗布器中，在玻板上平穩地移動塗布器進行塗布（厚度為0.2～0.3mm），取下塗好薄層的玻板，置水平台上於室溫下晾乾後，在110℃活化30分鍾，即置有乾燥劑的乾燥箱中備用。使用前檢查其均勻度（可通過透射光和反射光檢視）。

市售薄層板臨用前一般應在110℃活化30分鍾。聚醯胺薄膜不需活化。鋁基片薄層板可根據需要剪裁，但須注意剪裁後的薄層板底邊的硅膠層不得有破損。如在貯放期間被空氣中雜質污染，使用前可用適宜的溶劑在展開容器中上行展開預洗，110℃活化後，放乾燥器中備用。

（2）點樣除另有規定外，用點樣器點樣於薄層板上，一般為圓點，點樣基線距底邊2.0cm，樣點直徑為2～4mm，點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜，一般為1.0～2.0cm。點樣時必須注意勿損傷薄層板表面。

（3）展開展開缸如需預先用展開劑飽和，可在缸中加入足夠量的展開劑，並在壁上貼兩條與缸團戚寬一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封頂蓋，使系統平衡或按各品種正文規定操作。［醫學教育 網搜集整理］

將點好樣品的薄層板放入展開缸的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5～1.0cm（切勿將樣點浸入展開劑中），密封頂蓋，待展開至規定距離（一般為10～15cm），取出薄層板，晾乾，按各品種項下的規定檢測。

展開可以向一個方向進行，即單向展開；也可以進行雙向展開，即先向一個方向展開，取出，待展開劑完全揮發後，將薄層板轉動90°，再用原展開劑或另一種展開劑進行展開；亦可多次展開。

（4）顯色與檢視熒光薄層板可用熒光猝滅法；普通薄層板，如有色物質可直接檢視；無色物質可用物理或化學方法檢視。物理方法是檢出斑點的熒光顏色及強度；化學方法一般用化學試劑顯色後，立即覆蓋同樣大小的玻板，檢視。

3.系統適用仔輪性試驗來源：www.examda.com

按各品種項下要求對檢測方法進行系統適用性試驗，檢測斑點的檢測靈敏度、比移值（Rf）和分離效能應符合規定。

（1）檢測靈敏度系指雜質檢查時，採用對照溶液稀釋若干倍的溶液與供試品溶液和對照溶液在規定的色譜條件下，在同一塊薄層板上點樣、展開、檢視，前者應顯示清晰的斑點。

（2）比移值（Rf）系指從基線至展開斑點中心的距離與從基線至展開劑前沿的距離的比率。

可用計算供試品溶液主斑點與對照品溶液主斑點的比移值進行比較，或用比移值來說明主斑點或雜質斑點的位置。

（3）分離效能鑒別時，對照品與結構相似的葯物對照品製成的混合對照溶液應顯示兩個清晰分離的斑點。雜質檢查時，雜質對照品用供試品自身稀釋對照溶液或同品種對照品溶液溶解製成的混合對照溶液應顯示兩個清晰分離的斑點，或待測成分與相鄰的雜質斑點應清晰分離。

4．測定法來源：考試大

（1）鑒別可採用與同濃度的對照品溶液，在同一塊薄層板上點樣、展開與檢視，供試品溶液所顯主斑點的顏色（或熒光）與位置（Rf）應與對照品溶液的主斑點一致，而且主斑點的大小與顏色的深淺也應大致相同。或採用供試品溶液與對照品溶液等體積混合，醫學 教育 網搜集整理 應顯示單一、緊密的斑點；或選用與供試品化學結構相似的葯物對照品與供試品溶液的主斑點比較，兩者Rf應不同；或將上述兩種溶液等體積混合，應顯示兩個清晰分離的斑點。

（2）雜質檢查可採用雜質對照品法、供試品溶液的自身稀釋對照法或雜質對照品法與供試品溶液自身稀釋對照法並用。供試品溶液除主斑點外的其他斑點應與相應的對照品溶液或系列對照品溶液的主斑點比較，或與供試品溶液的自身稀釋對照溶液或系列自身稀釋對照溶液的主斑點比較，不得更深。

通常應規定雜質的斑點數和單一雜質量，當採用系列自身稀釋對照溶液時，也可規定估計的雜質總量。

E. 薄層色譜熒光掃描本質是什麼方法

薄層色譜掃描儀是對薄層色譜進行定量檢測分析的儀器，當前市場上有兩類薄層色譜掃描儀：
是一種全波長掃描儀，提供波長200-800nm范圍的可選波長，通過檢測樣品對光的吸收強弱確定物質含量。該掃描儀也能檢測254nm或365nm紫外照射產生的熒光強度，從而進行特異性檢測。
傳統掃描儀的掃描方式分為：單光束掃描、雙光束掃描和雙波長掃描。
單光束掃描：採用單一光束（即單一波長掃描），其結果就是上圖中一特定波長條件下的單條曲線。儀器結構簡單，但是基線不穩，實際中很少使用。
雙光束掃描：採用同一波長的兩個光束同步掃描，一個光束掃描樣品展開通道，另一個光束掃描樣品通道旁邊的空白區域，這樣就可扣除空白吸收，部分消除薄層板展開方向鋪板不均勻產生的誤差。但是無法消除垂至於展開方向鋪板不均勻產生的誤差。
雙波長掃描：兩個不同波長的光束交替掃描樣品展開的通道區域，波長選擇時，一個波長為樣品最大吸收位置，另一是吸收極小值位置。如上圖所示，如檢測目標為3（則最大吸收峰為290nm，極小值可選200nm、260nm或325nm）。這種方法可基本消除鋪板不均產生的誤差，因此掃描基線很穩定。
以上各種掃描方式中，根據光源大小（掃描精度）不同可分為直線掃描和鋸齒掃描。

F. 薄層色譜法的主要顯色定位方法有哪些

1、在日光下觀察，劃出有色物質的斑點位置。

2、在紫外燈（254nm或365nm）下觀察有無暗斑或熒光斑點並記錄其顏色、位置及強弱。能發熒光的物質或少數有紫外吸收的物質可用此法檢出。

3、熒光薄層板檢測，熒光薄層板是在硅膠中摻入了少量熒光物質製成的板。在254nm紫外燈下，整個薄層板呈黃綠色熒光，被測物質由於熒光猝滅作用而呈現暗斑。

4、既無色又無紫外吸收的物質，可採用顯色劑顯色。

(6)薄層色素檢測方法擴展閱讀

薄層色譜方法要求硅膠粉末的粒度分布窄、平均粒徑約15微米，薄層厚度為250微米左右，支持物一般為玻璃板，也可採用其他適用的物質。

將欲分析的樣品溶液以點狀或線狀加至薄層板上。然後將它插到 一個動相的液體(展開劑)中，使動相向上移動達到色譜分離的目的。

通常把流動相極性小而固定相極性大的體系稱為正相薄層色譜法；反之，則把流動相極性大而固定相極性小的體系稱為反相薄層色譜法。

與其它色譜方法相比具備如下優點：

①展開時間短，一般只需十至幾十分鍾。

②操作簡單，所用儀器設備也簡單，分離效果好。

③顯色劑多樣化，選擇性鑒定能力強。