18種氨基酸檢測方法

『壹』 氨基酸顯色方法

1、使用茚三酮試劑，噴後110oC加熱顯出顏色。用茚三酮劑顯色後用硝酸酮試劑噴，斑點由蘭紫色轉成紅色。

2、使用茚三酮+硝酸酮試劑，噴後在電爐上烤至剛剛顯色，顏色在日光燈中逐漸加深，某些氨基酸首先顯出顏色，用筆立刻將色點記下，許多氨基酸賧出特殊的顏色，不同的氨基酸顯出的速度也有差別。

3、使用2—萘醌—4—磺酸試劑（Folin試劑），噴後在室溫乾燥，不同的氨基產生各種顏色。

4．使用氯氣—聯甲苯胺試劑。也可以使氨基酸顯色。

(1)18種氨基酸檢測方法擴展閱讀；

常用的顯色反應

雙縮脲反應：

該反應是肽鍵常用的反應，即在鹼性銅溶液中， 肽鍵與銅離子形成絡合物，呈紫色(在540nm有最大光吸收峰)。

酚試劑法：

該反應是比色法測定蛋白質的常用方法，即蛋白 質以鹼性銅溶液處理後,加用酚試劑,呈藍色(在650nm有最大光吸收峰)。

考馬斯亮藍法： 即蛋白質與一種蛋白質染料考馬斯亮藍g250反應形成復合物，該復合物在595nm有最大光吸收峰。ms蛋白質遇硝酸也顯色為黃色，不過這樣蛋白質就變性了。

茚三酮反應：除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應生成黃色物質外，所有的α?氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質。

還有坂口反應 。在次溴酸鈉或次氯酸鈉存在的條件下，許多含有胍基的化合物 (如胍乙酸、甲胍、胍基丁胺等)能與α-萘酚發生反應生成紅色物質。

『貳』 氨基酸分析法的方法分類

本法系根據氨基酸與異硫氰酸苯酯（PITC）反應，生成有紫外響應的氨基酸衍生物苯氨基硫甲醯氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸經反相高效液相色譜分離後用紫外檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為0.025～1.25µmol/ml。
試劑 （1）流動相A 0.1mol/L醋酸鈉溶液(取無水醋酸鈉8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸調pH至6.5，然後加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。
（2）流動相B 乙腈－水（8：2）。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鍾1.0ml；柱溫為40℃；檢測波長為254nm。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 0 100 0 14 85 15 29 66 34 30 0 100 37 0 100 37.1 100 0 45 100 0 測定法 精密量取氨基酸對照品溶液200μl，置一2ml塑料離心管中，精密加入1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，混勻，精密加入0.1mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100μl，混勻，室溫放置1小時，加0.8ml正己烷，劇烈振搖，放置10min，精密取下層溶液2μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液200μl，自「置一2ml塑料離心管中」起同法測定。 本法系根據氨基酸與6－氨基喹啉－N－羥基琥珀醯亞氨基氨基甲酸酯（AQC）反應，生成有紫外與熒光響應的不對稱尿素衍生物（AQC-氨基酸），AQC-氨基酸經反相高效液相色譜後用紫外或熒光檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為2.5～200nmol/ml。
試劑 （1）流動相A 取醋酸銨10.8g或無水醋酸鈉11.5g，加水900ml溶解，用磷酸調pH至5.0，然後加水至1000 ml。
（2）流動相B 乙腈－水（3：2）。
（3）0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 8.8) 取硼酸12.36g，加水400ml溶解，用40%氫氧化鈉溶液調pH至8.8，然後加水稀釋至500ml。
(4) AQC溶液 取AQC適量，加乙腈溶解並稀釋製成每1ml中含1mg的溶液。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用新試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鍾1.4ml；柱溫為37℃；檢測波長為248nm。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 0 88 12 14 88 12 29 80 20 30 59 41 37 59 41 37.1 88 12 45 88 12 測定法 精密量取對照品溶液10μl，置一直徑為0.4cm、高度為5cm的小試管中，精密加入0. 4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 8.8) 70μl，在渦旋混勻器上混勻，精密加入AQC溶液20μl，混勻，精密量取5μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液10μl，自「置一直徑為0.4cm」起同法測定。 本法系根據一級氨基酸，在巰基試劑存在下，首先與鄰苯二醛（OPA）反應，生成OPA-氨基酸；反應完畢後，加入9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC），剩餘的二級氨基酸與FMOC繼續反應，生成FMOC-氨基酸，兩次反應生成的氨基酸衍生物經反相高效液相色譜分離後用紫外或熒光檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為0.025～2.5µmol/ml。
試劑 （1）流動相A 稱取醋酸鈉7.5g，加水4000ml溶解，加三乙胺800μl，四氫呋喃24ml，混勻，用2%醋酸調pH至7.2。
（2）流動相B 稱取醋酸鈉10.88g，加水800ml溶解，用2%醋酸調pH至7.2，加乙腈1400ml，甲醇1800ml，混勻。
（3）0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 10.4) 取硼酸24.73g，加水800ml溶解，用40%氫氧化鈉溶液調pH至10.4，然後加水稀釋至1000ml。
（4）OPA溶液 取 OPA 80mg，加0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 10.4) 7ml，加乙腈1ml， 3-巰基丙酸125μl ，混勻 。
（5）FMOC溶液 取FMOC 40mg , 加乙腈8ml溶解。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×150mm， 5μm）；柱溫為40℃；檢測波長為338nm（一級氨基酸），262nm（二級氨基酸）。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度及流速如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 流速（ml/min） 0.0 100 0 1.0 17.0 50 50 1.0 45.0 0 100 1.0 45.1 0 100 1.5 50.0 0 100 1.5 50.1 100 0 1.0 53 100 0 1.0 測定法 精密量取對照品溶液50μl，置一1.5ml塑料離心管中， 精密加入0. 4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 10.2) 250μl，混勻，精密加OPA衍生劑50μl，混勻，放置30秒，精密加入FMOC衍生劑50μl，混勻，精密量取4μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液50μl，自「置一1.5ml塑料離心管中」起同法測定。
附註：1、由於OPA-氨基酸不穩定，因此衍生後應立即進行分離測定。
2、本方法的衍生過程也可由自動進樣器完成。 本法系根據氨基酸與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應，生成有紫外響應的二硝基苯-氨基酸（DNP-氨基酸），DNP-氨基酸經反相高效液相色譜分離後採用紫外檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性響應范圍為30～140 pmol。本法所用的2，4－二硝基氟苯屬易爆、劇毒物質，有強致癌性，且該法對色譜柱要求較高，易損壞色譜柱，衍生試劑水解生成的2，4-二硝基苯易干擾絲氨酸的測定。除另有規定外，一般不宜採用本法。
試劑 （1）流動相A） 0.05mol/L醋酸鈉溶液(取 4.1g無水醋酸鈉，加水800ml溶解，加二甲基甲醯胺10ml，用稀醋酸調pH至6.4，用水稀釋至1000 ml)。
（2）流動相B 流動相A-乙腈（1：1）。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用新試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鍾1.0ml；柱溫為40℃；檢測波長為360nm。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 0 75 25 6 75 25 6.1 65 35 11 59 41 14 59 41 14.1 50 50 22 45 55 32 10 90 37 10 90 39 75 25 50 75 25 測定法 精密量取氨基酸對照品溶液2ml，置一50ml量瓶中，加0.5mol/L碳酸氫鈉溶液2ml，2，4-二硝基氟苯衍生化試劑（量取2，4－二硝基氟苯1ml ，用乙腈稀釋至100ml）1ml，混勻，在60℃水浴中反應 1小時，取20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液2ml，自「置一50ml量瓶中」起同法測定。 本法系根據氨基酸經陽離子交換色譜柱分離後，與茚三酮反應，一級氨基酸生成在570nm處具有最大吸收的紫色化合物，二級氨基酸（如脯氨酸）生成在440nm具有最大吸收的黃色化合物，分別在570nm和440nm下檢測上述反應產物，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性響應范圍為20～500 pmol。
試劑 （1）流動相A 取無水檸檬酸鈉1.7g，鹽酸1.5ml，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至3.0。
（2）流動相B 取無水檸檬酸鈉1.7g，鹽酸0.7ml，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至4.3。
（3）流動相C 取氯化鈉5g，無水檸檬酸鈉1.9g，苯酚0.1g，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至6.0。
（4） 色譜柱再生溶液 取氫氧化鈉0.8g，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至13。
（5）柱後衍生試劑 取茚三酮18g，茚氮蘭0.7g，加76.7%二甲基亞碸－0.7二水合醋酸鋰－0.1%醋酸溶液900ml使溶解，在氮氣下混合至少3小時。
（6）樣品緩沖液 2%無水檸檬酸鈉-1%鹽酸-0.5%硫代二乙醇－0.1%苯甲酸溶液。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用新試驗 用磺化苯乙烯－二乙烯苯共聚物為填充劑（4.0×120mm， 7.5μm）；流動相流速為每小時14.0ml；柱後衍生試劑得流速為每分鍾7ml，反應器溫度為135℃；檢測波長為440nm(一級氨基酸)，570nm（二級氨基酸）。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下：開始時用流動相A平衡色譜柱，在25分鍾流動相的組成變為100%流動相B，在37分鍾，流動相組成變為100%流動相C，在75min，最後一個氨基酸被洗脫後，用色譜柱再生溶液再生色譜柱1分鍾。柱溫程序如下：開始時柱溫48℃，11.5分鍾後，以每分鍾3℃的速率升至65℃，約35分鍾後，以每分鍾3℃的速率升至77℃，最後在約52分鍾後，以每分鍾3℃的速率降至77℃。
測定法 精密量取氨基酸對照品溶液適量，注入氨基酸分析儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液適量，同法測定。
附註：不同品牌的氨基酸分析儀，應根據儀器的要求，對流動相、色譜柱再生溶液、衍生試劑、緩沖液和洗脫梯度作適當調整。

『叄』 飼料的檢測項目有哪些

飼料主要指的是農業或牧業飼養動物的食物。主營由大豆、豆粕、玉米、魚粉、氨基酸、雜粕、乳清粉、油脂、肉骨粉、穀物、飼料添加劑等十餘個品種的飼料原料。
畜禽飼料檢測：顆粒飼料、牛飼料、雞飼料、羊飼料、配合飼料等
水產飼料檢測：魚飼料、鱉飼料、蝦飼料、蟹飼料、各類水產飼料等
寵物食品檢測：犬糧、貓糧、寵物零食、處方食品等
飼料添加劑檢測：胡蘿卜素、維生素、葉黃素、生物素、鹼式氯化銅、硫酸銅等
飼料測試項目：
飼料理化檢測：
感觀（外觀及氣味）、粒度、水分、灰分、pH、混合均勻度、粗脂肪、粗纖維、鹽分、粗蛋白、維生素、微量元素含量等。
飼料安全性檢測：
水溶性氯化物、揮發性鹽基氮、氰化物、亞硝酸鹽、三聚氰胺、重金屬殘留、農葯殘留、菌落總數、大腸菌數、黴菌數、芽孢桿菌數等。
飼料檢測標准：
GB/T 5917.1-2008 飼料粉碎粒度測定 兩層篩篩分法
GB/T 5918-2008 飼料產品混合均勻度的測定
GB/T 6432-1994 飼料中粗蛋白測定方法
GB/T 6433-2006 飼料中粗脂肪的測定
GB/T 6434-2006 飼料中粗纖維的含量測定 過濾法
GB/T 6435-2006 飼料中水分和其他揮發性物質含量的測定
GB/T 6436-2002 飼料中鈣的測定
GB/T 6437-2002 飼料中總磷的測定 分光光度法
GB/T 6438-2007 飼料中粗灰分的測定
辦理飼料檢測流程：
1、咨詢---申請人提供產品資料圖片或通過描述說明所需要申請的產品及材料.
2、報價---根據申請人提供的資料，技術工程師將作出評估，確定須測試的項目，並向申請方報價
3、申請方確認報價後填寫測試申請表和測試樣品
4、樣品測試——測試將依照所適用的標准進行
5、測試完成後提供報告。

『肆』 測定蛋白質中氨基酸含量的主要步驟有哪些為什麼一般分析報告顯示17種氨基酸成分

一般來說人體必須的17種氨基酸，也較為重視

氨基酸的定性測定
一、氨基酸的一般顯色反應
本節介紹三種顯色反應：茚三酮法、吲哚醌法和鄰苯二甲醛法。前二種是經典的常用顯
色法，後一種是近年來發展起來的熒光顯色法，具有靈敏度高的特點。
1. 茚三酮法
顯色方法有下列數種：
①常用法：將點有樣品的層析或電泳完畢的濾紙充分除盡溶劑，用 5g/L 茚三酮無水丙
酮溶液噴霧，充分吹乾，置65℃烘箱中約30min（溫度不宜過高，避免空氣中氨，以免背
景泛紅色），氨基酸斑點呈紫紅色。
為了使各種氨基酸呈現不同顏色，可用下列方法：
②用 0.4g 茚三酮，10g 酚和90g 正丁醇的混合液顯色。
③用 1g/L 茚三酮無水丙酮溶液顯色完畢後，再用鹽酸蒸汽熏1min。
④用 1g 茚三酮，600mL 無水乙醇，200mL 冰醋酸及80mL2,4,6-三甲基吡啶混合液80
℃染色5～10min。
為了使顯色穩定，可用下列方法：
⑤配製含醋酸鎘 2g 加蒸餾水200mL 及冰醋酸40mL 的貯存液。將上述貯存液加200mL
丙酮及2g 茚三酮，即為顯色液。點有樣品的濾紙上浸有此顯色液後，放置於盛有一小杯濃
硫酸的密閉玻璃容器中，25℃，18h，或較高溫度下適當縮短時間。背景色淺，氨基酸斑點
也比較穩定。
⑥用含 2g/LCoCl2(或CuSO4)的4g/L 茚三酮異丙酮溶液顯色時，氨基酸斑點呈紅色，也
可在茚三酮顯色後噴以含鈷、鎘或銅等無機離子的異丙醇溶液，斑點自藍紫色變成紅色。
2．吲哚醌法
（1）原理
各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可藉此辯認氨基酸。氨對吲哚醌顯色沒
有妨礙，但其靈敏度較茚三酮法稍差，顯色不穩定，顏色只有在絕對乾燥的環境中才能保存。
（2）試劑
①顯色劑：1g 吲哚醌溶於100mL 乙醇及10mL 冰醋酸中（若冰醋酸用量減少則靈敏度
稍差）。
②底色褪色劑：在 100mL 200g/L 碳酸鈉溶液中加入60g 硅酸鈉（Na2SiO3•9H2O）在水
浴（60～70℃）中加熱攪拌直至完全溶解，待溶液比較清澈為止。在溶解過程中，有時硅酸
鈉會結成凝膠，此時只需繼續攪拌即可溶解。配製時若硅酸鈉用量多則褪色較快，但背景容
易變黃，硅酸鈉用得少（40g），雖裉色較慢，但背景較為潔白。
顯色步驟
層析或電泳後濾紙烘乾後，仔細噴上或塗上顯色劑，用電吹風迅速吹乾，待醋酸氣味不
太刺鼻時移置100℃烘箱烘5～15min，直至顯色為止（溫度不要太高，以免引起減色）注
意觀察所顯出的顏色，然後均勻地塗上底色褪色劑，紙的背景即由黃色變為絳紅而後逐漸變
淺，待黃色背景幾乎褪盡時，迅速用電吹風吹乾，並隨時觀察顏色的變化。例如蘇氨酸在褪
色前為淺紅帶褐色，褪色後則呈橙黃色或黃色：脯氨酸在褪色前為藍色，吹乾時很快褪成無
色。室溫較低時，底色褪色很慢，此時可將褪色劑加溫到30～40℃。溫度過高也不宜，因
氨基酸斑點的褪色速度也同時加快，應該避免。
其他顯色步驟：顯色劑為 1g 吲哚醌，1.3g 醋酸鋅溶解於70～80mL 熱異丙醇中，冷卻
後加1mL 吡啶。或者1g 吲哚醌，1.5g 醋酸鋅溶解於95mL 熱異丙醇中，加3mL 水，冷卻
後加1mL 冰醋酸。點有樣品的濾紙仔細噴以顯色劑後，80～85℃放置10min，背景可用水
迅速浸洗去而不使氨基酸斑點退去
由於吲哚醌試劑配製方法不同，對同一種氨基酸所顯顏色往往也有差異。
3．鄰苯二甲醛法
鄰苯二甲醛法是目前紙上層析、硅膠薄層層析熒光顯色氨基酸最靈敏的方法之一，也可
用於氨基酸溶液定量，並推廣應用於乙內醯苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白質的檢出和定量。根
據文獻報道，氨基酸紙上層析靈敏度達0.5μmoL，在硅膠薄層層析上為0.05～0.2μmoL。
這里介紹在紙上層析顯現氨基酸方法。（熒光胺是另一種常用的熒光試劑，由於熒光胺來源
比較困難，這里未作介紹）
（1）原理
鄰苯二甲醛在 2-巰基乙醇存在下，在鹼性溶液中與氨基酸作用產生熒光化合物，最適
的激發光和發射光波長分別為340nm 和455nm。
各種氨基酸顯現的熒光強度不同，其相對熒光強度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，
異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨
酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。
（2）試劑
鄰苯二甲醛顯色液：取0.1g 鄰苯二甲醛，0.1mg 巰基乙醇，1mL 三乙胺，加丙酮+石油
醚（60℃～90℃）（1+1）的混合溶劑至100mL。放置0.5h 後使用。
顯色步驟
將含有氨基酸樣品的濾紙浸入鄰苯二甲醛顯色液中 1min，冷風吹乾，在溫度18℃以下，
濕度50%～90%之間顯色0.5h，於紫外燈下觀察熒光點。
說明
在濾紙上顯現氨基酸時，鄰苯二甲醛濃度以 0.1%為宜。顯色時必須有一定的濕度，以
便氨基酸溶解，提高分子碰撞機率，並使極性基團解離，促進反應趨於完全。濕度太低，顯
不出熒光。溫度對顯現的熒光延時有顯著影響，溫度高熒光延時短，溫度低熒光延時長。
二、個別氨基酸的顯色反應
利用個別氨基酸與某些試劑具有特殊的顯色反應定性氨基酸。可應用於紙層析和紙電
泳顯色，也可單獨應用。方法很多，僅將常用的方法介紹如下：
1．精氨酸的顯色——坂口（Sakaguchi）反應
(1)第一種方法
試劑：①5g 尿素溶解於100mL0.1g/Lα-萘酚乙醇中。使用前，每100mL 加約5g KOH。
②0.7mL 溴水溶解於100mL 5%NaOH 中。
顯色步驟：在點有樣品的濾紙上噴試劑①後，在空氣中吹幾分種，再噴試劑②。精氨
酸或含精氨酸的多肽顯紅色。此試劑對含精氨酸的蛋白質也適用。
(2)第二種方法：
試劑：①1g/L 8-羥基喹啉的丙酮溶液。②0.02mL 溴水溶解於100mL 0.5mol/LnaOH 溶
液中。
顯色步驟：將點有樣品的濾紙烘乾後，噴上試劑①，吹乾後，再噴試劑②。精氨酸或
其他胍類物質顯桔紅色。
2．胱氨酸和半胱氨酸的顯色
試劑：①1.5g 亞硝基鐵氰化鈉（Na2Fe(CN)5NO2•5H2O）溶於5mL 2mol/L H2SO 4 溶液
中，加95mL 甲醇。此時會有沉澱產生，可保存一個月以上。使用時在每100mL 上述溶液
中加10mL 28%氨水，過濾除去沉澱，清液僅能保持一天左右。②2g 氰化鈉溶於5mL 水中，
然後加95mL 甲醇。此時有沉澱產生，使用時只需搖勻即可。
顯色步驟：半胱氨酸的顯色：在濾紙上噴以試劑①的清液，5min 後半胱氨酸顯紅色。
胱氨酸的顯色：先將濾紙浸入試劑②，迅速取出，稍等片刻再噴試劑甲的清液，5min 後胱
氨酸顯紅色。也可以把試劑②配製的濃度增加一倍，在顯色前混和，再噴到濾紙上。
3．甘氨酸的顯色
試劑；0.1g 鄰苯二甲醛溶於100mL 77%乙醇中。
顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上試劑，甘氨酸顯墨綠色，在汞燈（365nm）下顯巧克力
棕色。吲哚醌顯色後，再用此試劑仍有效。以甘氨酸為N 端的小肽也能顯色，但其N 端被
保護後，以及其他氨基酸均不顯色。
4．脯氨酸的顯色
試劑：1g 吲哚醌和1.5g 醋酸鋅，1mL 醋酸，5mL 蒸餾水混和，再加入95mL 異丙醇。
新鮮配製。
顯色步驟：層析濾紙除盡溶劑，噴上以上試劑，80℃～85℃烘箱內放置30min，脯氨酸
顯藍色，再以30℃溫水漂洗除去多餘的試劑後，背景為白色或淺黃色。
也可剪下脯氨酸斑點，在試管中加入5mL 水飽和酚，在黑暗中洗脫15min，間歇振搖，
於610nm 測定其吸光度。從已知標准曲線即可求得樣品內脯氨酸含量，測定范圍5～20μg。
5．絲氨酸和羥賴氨酸的顯色
試劑：①0.035mol/L 過碘酸鈉（748mgNaIO4 溶於數毫升甲醇中，加2 滴6mol/L 鹽酸，
再用甲醇稀釋至100mL）。②15g 醋酸銨加0.3mL 冰醋酸，加1mL 乙醯丙酮，用甲醇稀釋到
100mL。
顯色步驟：點有樣品的濾紙吹乾，先噴試劑①，近干後再噴試劑②，室溫放置 2h，紫
外燈下照射0.5h，絲氨酸和羥賴氨酸呈黃色斑點，在紫外線下都有熒光。
6．羥脯氨酸的顯色
試劑：①1g 吲哚醌溶於100mL 乙醇及10mL 冰醋酸。②1g 對二甲胺苯甲醛溶於100mL
的丙酮濃鹽酸（9＋1）混合液中。（此試劑不穩定，隔數日後溶液顏色增深發黑，靈敏度降
低，故用時新鮮少量配製。
顯色步驟：將待鑒定的溶液點於小方塊紙上，干後先點上試劑①，熱風吹乾。這時純
羥脯氨酸呈墨綠色，純脯氨酸呈深藍色（極靈敏），對其他氨基酸呈程度不同的紫紅色（不
太靈敏）；然後再點上試劑②吹乾，如溶液中含有羥脯氨酸即轉變為玫瑰紅色，而其他氨基
酸與吲哚醌所生成的顏色則褪去。
7．色氨酸的顯色
(1)第一種方法
試劑：1g 對二甲氨基苯甲醛加90mL 丙酮，10mL 濃鹽酸。新鮮配製。
顯色步驟：點有樣品的濾紙乾燥後，噴上以上試劑，在室溫下放置幾分鍾後，色氨酸
顯藍色或紫紅色。茚三酮顯色後，仍可使用本法。
(2)第二種方法：
試劑：10mL 35%甲醛加10mL25%鹽酸，20mL 無水乙醇。
顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上以上試劑後，100℃烘5min，色氨酸在長波長紫外光下
呈現熒光（黃-橙-帶綠色）。
8．酪氨酸的顯色
試劑：①0.1%α-亞硝基β-萘酚的95%乙醇溶液。②10%硝酸水溶液。
顯色步驟：點有樣品的濾紙噴上試劑①後，吹乾，再噴試劑②，然後在100℃烘3min，
酪氨酸或含酪氨酸的多肽在淺灰綠色的背景上顯紅色，0.5h 後轉變為桔紅色，其後漸退去。
靈敏度1～2μg 酪氨酸。茚三酮顯色後，再用此試劑處理，仍能顯色，茚三酮所顯出的紫紅
色斑點變成紅色。
9．酪氨酸和組氨酸的顯色——pauly 反應
試劑：①4.5g 對氨基苯磺酸與45mL 12mol/L 鹽酸共熱溶解，以蒸餾水稀釋至500mL。
用時取出30mL，在0℃與等體積的5%亞硝酸鈉水溶液相混合。（室溫放置太長會失效）
②10%碳酸鈉水溶液。
顯色步驟：點有樣品的濾紙上噴試劑①，片刻後再噴試劑②。組氨酸及含組氨酸的多
肽顯桔紅色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽顯淺紅色。
第六節 氨基酸定量測定
一、氨基酸的一般定量測定
（一）甲醛滴定法
1．原理
氨基酸具有酸性的-COOH 基和鹼性的-NH2 基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內
鹽。當加入甲醛溶液時，-NH2 基與甲醛結合，從而使其鹼性消失。這樣就可以用標准強鹼
溶液來滴定-COOH 基，並用間接的方法測定氨基酸總量。反應式（有三種不同的推論）如
下：
2．方法特點及應用
此法簡單易行、快速方便，與亞硝酸氮氣容量法分析結果相近。在發酵工業中常用此
法測定發酵液中氨基氮含量的變化，來了解可被微生物利用的氮源的量及利用情況，並以此
作為控制發酵生產的指標之一。脯氨酸與甲醛作用時產生不穩定的化合物，使結果偏低；酪
氨酸含有酚羧基，滴定時也會消耗一些鹼而致使結果偏高；溶液中若有銨存在也可與甲醛反
應，往往使結果偏高。
3．操作方法
吸取含氨基酸約 20mg 的樣品溶液於100mL 容量瓶中，加水至標線，混勻後吸取20.0mL
置於200mL 燒杯中，加水60mL，開動磁力攪拌器，用0.05mol/L 氫氧化鈉標准溶液滴定至
酸度計指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標准溶液mL 數，供計算總酸含量。
加入10.0mL 甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標准溶液繼續滴定至pH9.2，記錄消
耗氫氧化鈉標准溶液毫升數。
同時取 80mL 蒸餾水置於另一200mL 潔凈燒瓶中，先用氫氧化鈉標准溶液調至pH8．2，
（此時不計鹼消耗量），再加入10.0mL 中性甲醛溶液，用0.05mol/L 氫氧化鈉標准溶液滴定
至pH9.2，作為試劑空白試驗。
4．結果計算
氨基酸態氮質量分數（%）=
式中：V1——樣品稀釋液在加入甲醛後滴定至終點（pH9.2）所消耗氫氧化鈉標准溶液
的體積，mL；
V2——空白試驗加入甲醛後滴定至終點所消耗的氫氧化鈉標准溶液的體積，mL；
c——氫氧化鈉標准溶液的濃度，mol/L；
m——測定用樣品溶液相當於樣品的質量，g；
0.014——氮的毫摩爾質量，g/mmoL。
5．說明
①本法准確快速，可用於各類樣品游離氨基酸含量測定。②渾濁和色深樣液可不經處
理而直接測定。
(二)茚三酮比色法
1．原理
氨基酸在鹼性溶液中能與茚三酮作用，生成藍紫色化合物（除脯氨酸外均有此反應），
可用吸光光度法測定。
該藍紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長為 570nm，故據此
可以測定樣品中氨基酸含量。
2．操作方法
(1)標准曲線繪制
准確吸取 200μg /mL 的氨基酸標准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相當於
0、100、200、300、400、500、600μg 氨基酸），分別置於25mL 容量瓶或比色管中，各加
水補充至容積為4.0mL，然後加入茚三酮溶液（20g/L）和磷酸鹽緩沖溶液（pH 為8.04）各
1mL，混合均勻，於水浴上加熱15min，取出迅速冷至室溫，加水至標線，搖勻。靜置15min
後，在570nm 波長下，以試劑空白為參比液測定其餘各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克
數為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，繪制標准曲線。
(2)樣品測定
吸取澄清的樣品溶液 1～4mL，按標准曲線製作步驟，在相同條件下測定吸光度A 值，
用測得的A 值在標准曲線上可查得對應的氨基酸微克數。
3．結果計算
氨基酸含量（mg/100g）=
式中：c——從標准曲線上查得的氨基酸的質量數，μg；
m——測定的樣品溶液相當於樣品的質量，g。
4．說明及注意事項
①通常採用的樣品處理方法為：准確稱取粉碎樣品 5～10g 或吸取樣液樣品5～10mL，
置於燒杯中，加入50mL 蒸餾水和5g 左右活性炭，加熱煮沸，過濾，用30～40mL 熱水洗
滌活性炭，收集濾液於100mL 容量瓶中，加水至標線，搖勻備測。
②茚三酮受陽光、空氣、溫度、濕度等影響而被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前須進行
純化，具體操作可參閱黃偉坤等編著《食品檢驗與分析》。
(三)非水溶液滴定法
1．原理
氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的標准溶液滴定其含量。根據酸
鹼的質子學說：一切能給出質子的物質為酸，能接受質子的物質為鹼；弱鹼在酸性溶劑中鹼
性顯得更強，而弱酸在鹼性溶劑中酸性顯得更強，因此本來在水溶液中不能滴定的弱鹼或弱
酸，如果選擇適當的溶劑使其強度增加，則可以順利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中
呈現中性，而在冰醋酸中就能接受質子顯示出鹼性，因此可以用高氯酸等強酸進行滴定。
本法適合於氨基酸成品的含量測定。允許測定的范圍是幾十毫克的氨基酸
2．測定
(1)直接法（適用於能溶解於冰醋酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣品50mg 左右，溶解
於20mL 冰醋酸中，加2 滴甲基紫指示劑，用0.100mol/L 高氯酸標准液滴定（用10mL 體積
的微量滴定管），終點為紫色剛消失，呈現藍色。空白管為不含氨基酸的冰醋酸液，滴定至
同樣終點顏色。
(2)回滴法（適用於不易溶解於冰醋酸而能溶解於高氯酸的氨基酸）：精確稱取氨基酸樣
品30～40mg 左右，溶解於5mL0.1mol/L 高氯酸標准溶液中，加2 滴甲基紫指示劑，剩餘的
酸以醋酸鈉溶液滴定，顏色變化由黃，經過綠、藍至初次出現不褪的紫色為終點。
3．說明
(1)能溶解於冰醋酸的氨基酸，可以用直接法測定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、組
氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和蘇氨酸。不易溶解於冰
醋酸，但能溶解於高氯酸可以回滴法測定的有：賴氨酸、絲氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。
(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以將樣品溶解於2mL 甲酸中，再
加20mL 冰醋酸，直接用標準的高氯酸溶液滴定。
(四)鄰苯二甲醛法(OPT 法)
1．原理
鄰苯二甲醛在 2-巰基乙醇存在下，於鹼性溶液中與氨基酸作用產生熒光化合物，最適
的激發光和發射光波長分別為340 和455nm。可能產物為：
各種氨基酸顯現的熒光強度不同，其相對熒光強度由大到小大致順序如下：天門冬氨酸，
異亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，組氨酸，亮氨酸，絲氨酸，纈氨酸，谷氨酸，蘇氨酸，甘氨
酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸，和半胱氨酸。
本法可用於測定游離氨基酸的含量。靈敏度較茚三酮法約高 100 倍以上，可測到0.1～
1×10－4mol 氨基酸。如用於血清中α-氨基氮的測定，每次血清用量只需5～10μL。與另一
種熒光試劑（螢光胺）一樣，空白無熒光，只有與氨基酸結合才產生熒光。缺點是與脯氨酸
不產生熒光，鄰苯二甲醛與半胱氨酸熒光值太低。熒光胺已有用於氨基酸自動分析定量分析，
但由於試劑昂貴及個別氨基酸反應不滿意，目前還未普遍應用。
(五)三硝基苯磺酸法
三硝基苯磺酸（TNBS）是定量測定氨基酸的重要試劑之一。TNBS 在偏鹼性的條件下
與氨基酸反應，先形成中間絡合物，如下式所示：
中間絡合物在光譜上有二個吸收值相近的高峰，分別位於355nm 和420nm 附近。然
而溶液一旦酸化，中間絡合物轉化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm 處的吸收值
顯著下降，而350nm 附近的吸收峰則移至340nm 處。
利用 TNBS 與氨基酸反應的這一特性，可在420nm 處（偏鹼性溶液中）或在340nm
（偏酸性溶液中）對氨基酸進行定量測定。下表列出各種氨基酸與TNBS 反應後在不同條
件下測定的吸光度。在340nm 處，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 處的吸光度
因氨基酸種類而異；在加入適量SO3
2－時，吸收值升高。
本法允許的測定范圍是 0.05～0.4μmol 氨基酸。
表 10-3 各種氨基酸與TNBS 反應後在不同條件下測定的吸光度
氨基酸種類 鹼性溶液① 酸性溶液加 SO3
①取不同含量氨基酸液1mL，加4%NaHCO3 1mL，0.1%TNBS 1mL，於40℃反應2h，用水補充至4mL，
在420nm 處測定。製作氨基酸濃度—吸光度坐標圖，從曲線中求得各氨基酸於1μmol 時的吸光度。
②條件同上，但在與TNBS 反應時加0.01mol/L Na2SO3 1mL，最後總體積也是4mL，同樣在420nm 處
測定。
③條件同①，但與 TNBS 反應後加1mol/L HCl 1mL 酸化，在340nm 處測定。
(六)乙醯丙酮和甲醛熒光法
1．原理
氨基酸與乙醯丙酮和甲醛反應，生成 N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙醯基1,4-二氫吡啶，
產生黃-綠色熒光，可用熒光分析法檢測。主要反應如下：
乙醯丙酮 甲醛 氨基酸 熒光物質
2．試劑
混合試劑：取1mol/L 乙酸鈉溶液10mL，加入乙醯丙酮溶液0.4mL 和30%甲醛溶液1mL，
用水稀釋至30mL。
3．測定
取氨基酸液 1mL，加入混合試劑1mL，用棉花塞滿試管口，避光於100℃下加熱10min，
冷卻，加水2mL，然後測定熒光值。
表 10-4 各種氨基酸的發射波長和檢測范圍
化合物（激發波長405nm） 發射波長（nm） 檢測范圍（mg/L）
甘氨酸 485 2～10
苯丙氨酸 490 8～40
絲氨酸 485 5～25
半胱氨酸（鹽酸鹽） 500 20～100
谷氨酸 485 20～100
與標准相比較求出樣品中的氨基酸含量。
二、個別氨基酸的定量測定
（一）賴氨酸的測定
1．原理
用銅離子阻礙游離氨基酸的α-氨基,使賴氨酸的ε-氨基可以自由地與1-氟-2,4 二硝基
苯(FDNB)反應,生成ε-DNP-賴氨酸。經酸化和用二乙基醚提取,在波長390nm 處有吸收峰,
從而求出樣品中游離賴氨酸的含量.
2．試劑
(1)氯化銅液：稱28.0g 無水氯化銅，用水稀釋至1000mL。
(2)磷酸三鈉溶液：稱68.5g 無水磷酸鈉,用水稀釋至1000mL。
(3)硼酸鹽緩沖液（pH9.1～9.2）：稱54.64g 帶有10 結晶水的四硼酸鈉，用水稀釋至
1000mL 。
(4)磷酸銅懸浮液：攪拌情況下，把氯化銅液200mL，緩慢倒入400 mL 的磷酸三鈉溶液
中，把懸浮液以2000r/min 速度離心5min ，用硼酸鹽緩沖液再懸浮沉澱物，洗滌離心3 次，
把最後的沉澱物懸浮在硼酸鹽緩沖液中，並用緩沖液稀釋至1L。
(5)1-氟-2，4 二硝基苯(FDNB)溶液：吸取FDNB10mL 用甲醇稀釋至100mL。
(6)賴氨酸-HCl 標准溶液：稱取一定量賴氨酸-HCl，用水配成200mg/L 的工作標准液。
(7)100g/L 丙氨酸溶液。
3．測定
(1)稱取通過40 目篩的均勻試樣1.00g，置於100mL 燒瓶中。另吸取賴氨酸-HCl 標准工
作液5mL（相當1mg 賴氨酸-HCl），連同試劑空白同時進行試驗。
(2)向各燒瓶中加入25mL 磷酸銅懸浮液，然後再加10%丙氨酸1.0mL,振搖15min。吸
取10%FDNB 溶液0.5mL.置於各處理燒瓶中,將燒瓶置沸水中加熱15min。
(3)取出燒瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,並不斷搖動使之酸化和分散均勻。
(4)燒瓶中的溶液冷卻至室溫,用水稀釋至100mL.取約40mL 懸浮液進行離心。
(5)用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。並將溶液收集於有刻度試管中,於65℃
水浴中加熱15min，以除去殘留的醚。並記錄溶液的毫升數。
(6)吸取上述各處理液10mL，分別與95%乙醇溶液10mL 混合，用濾紙過濾。
(7)用試劑空白液凋零，測定樣液A390nm，與賴氨酸-HCl 標准液對照，求出樣品中賴氨
酸-HCl 的含量。
本法在 0～40mg/L 賴氨酸溶液范圍內呈良好線性關系。
4．說明
(1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加總氨基酸的濃度，有助於賴氨酸-HCl 濃度
具有良好的線性關系。
(2)用醚提取酸性溶液，可將所有中性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，並把FDWB
的產物破壞，否則這些產物在390nm 處存在干擾。
（二）色氨酸的測定
1.原理
樣品中的蛋白質經鹼水解後，游離的色氨酸與甲醛和含鐵離子的三氯乙酸溶液作用，生
成哈爾滿化合物（norharman），具有特徵熒光值，可以進行定量測定。
2．試劑
(1)0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸溶液：稱取三氯化鐵(FeCl3•6H2O)41mg，加入10%三
氯乙酸溶液溶解並定溶至500mL。
(2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%～38%)5.5mL，加水至100mL。
(3)色氨酸標准溶液：稱取10mg 色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解並定容至100mL,
置棕色瓶中備用,使用時用水稀釋成1mg/L 的標准溶液.
3．測定
稱取樣品粉末 100～200mg 於離心管中，加入4mL 乙醚,搖勻後過夜，以3000r/min 速
度離心。將乙醚提取液移入試管內,並用乙醚洗滌殘渣3 次，收集乙醚液於試管中，於40℃
水浴除去醚。殘留物中加入6.25mol/L N aOH 4mL，火焰封口，於110℃水解16～24h。水
解液用4mol/L HCl 溶液調節至pH6～8 後,用水定容至50mL,過濾備用。
吸取濾液 0.2mL，加入2%甲醛0.2mL 和0.3mmol/L 三氯化鐵-三氯乙酸混合液2mL，
搖勻後於100℃水浴中加熱1h，取出，冷卻後用水定容至10mL。在激發波長為365nm，發
射波長449nm 條件下，測定樣品的熒光強度，與色氨酸標樣作對照，求出樣品中色氨酸含
量。
本法在 0～10mg/L 色氨酸溶液范圍內呈良好線性關系。