① 酶活性分析的常用方法
一、量氣法
在封閉的反應系統中如有氣體變化，通過測量變化後的氣體體積或壓力很容易計算出氣體變化量，這是量氣法的基本原理。曾在檢驗科廣泛應用的Van-slyke測二氧化碳結合力的方法就是量氣法的一個典型例子。Warburg進一步加以發展，設計出專用於測定酶活性的華勃呼吸儀。這種儀器特別適用於測定那些在反應中產生或消耗氣體的酶，例如氧化酶反應涉及到O2的消耗，脫羧酶會產生CO2。但也不僅限於這些酶，科學家採用與CO2氣體保持平衡過的重碳酸鹽體系，可用來測定各種產生H+的酶反應，如各種還原酶，可使NADH變為NAD和H+，而H+會促使反應體系中重碳酸鹽變為CO2氣體。
二、比色法與分光光度法
在20世紀上半個世紀華勃儀得到研究實驗室廣泛的應用，並在酶學上得到豐碩的成果。但此法操作煩瑣，技術要求高而且靈敏度低。臨床常規中很少使用。多使用簡單易行的比色法測酶活性。在上半個世紀建立了一些適用於常規工作的測酶活性濃度的方法，如測定澱粉酶的Somogyi法，鹼性磷酸酶的Bodansky法、King法等等。這些方法都是在酶和底物作用一段時間後停止酶反應，加入各種化學試劑與產物或基質反應呈色，用比色計在可見光處比色，同時將被測物質作標准管或標准曲線，比較後計算出在此段時間內產物生成量或底物消耗量，從而求得反應速率v。
比色法從50年代起逐步被分光光度法所取代。這是因為分光光度法有以下幾個顯著優點：一是測定范圍不只局限在可見光，還可擴展到紫外和紅外部分。這就為擴大測定酶范圍提供了可能性。二是提供了尋找一類不需停止酶反應就可直接測定產物生成量或底物消耗量方法的可能性。例某一酶催化下列反應A－＞B＋C，A、B、C三種物質用分光光度法的吸收光譜如圖17-1所示。
圖17-1 A、B、C三種物質的吸收曲線
可以看到C在560nm處有一吸收峰，而A和B在此處無吸光度變化因此無需停止酶反應，只要在560nm處測定吸光度變化就很容易計算出C的變化速度，而且C物質比A、B二物質有更高的吸收峰，即靈敏度最高。
這類方法中最成功的是Warburg在50年代利用NAD（P）H和NAD（P）吸收光譜差異建立的測酶活性濃度方法。NAD（P）H在340nm處有一吸收峰，而NAD（P）在此波段卻毫無吸光性。因此建立了一類和原來比色法截然不同方法。不需停止酶反應，在340nm根據吸光度變化，就可觀察到酶反應變化全過程。
第三個優點是不需要如比色法那樣，作標准管或標准曲線，因為分光光度計使用近似單色光的光源，在此條件下，某一特定物質的吸光度為常數，即人們所熟悉的摩爾吸光度（molar absorbance）。根據此值從吸光度△A/△T不難計算出酶催化反應速度v。
分光光度計的這些簡便、准確等特點使它在近年來已逐步取代比色法而成為目前最流行的方法。其缺點是需要精確帶恆溫裝置的分光光度計，在經濟不發達地區尚難推廣。
分光光度法的技術多樣化。設計得當可用於各種酶的測定。表17-2是一些可用於分光光度法的氧化還原物質特性。
除了前述的NAD(P)H系統可用於脫氫酶測定外，可利用黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）來測定各種含這二個輔基的酶。它們的氧化型在450nm有一很強吸收峰，而還原型的吸光度很低，同樣細胞色素還原型在可見光有一個非常明顯和很窄的吸收峰，都使人們很容易用分光光度法研究這些酶的作用。上述物質主要用於氧化還原酶的測定。
科學家還設計出一系列人工合成酶的底物，用於其它酶的分光光度法測定。例如合成了很多對硝基酚的衍生物，用於各種水解酶的測定。鹼性磷酸酶底物磷酸對硝基酚就是一個成功例子。又如測芳香基硫酸酯酶，可使用人工合成的硫酸對硝基酚為底物，其分解產物的吸收峰由原來的278nm變為318nm，Webb成功地在330nm進行此酶監測
表17-2 一些氧化還原物質的特性
物質 波長（nm） 克分子吸光度
還原型 氧化型
NAD，NADP 340 6300 0
FMN 450 12200
FAD 450 11300
細胞色素C 550 29500 8300
亞甲藍（等消光點） 610 0 41000
二氫酚吲哚酚 600 0 21000
吩嗪甲酯硫酸 388 1500 22000
抗壞血酸 265 15100
連二亞硫酸鹽 314 8000 0
氰化鐵（亞鐵） 420 0 1020
分光光度法的上述原理還可以用於其它酶的測定，如烯醇化酶、延胡索酸水解酶的底物由於含不飽和鍵，在330nm處有很強吸收峰，而酶作用產物無此不飽和鍵。則不難在330nm處對這些酶進行直接測定。
此後在分光光度法的發展過程中又導入了酶偶聯技術。使得分光光度法幾乎能測定所有的酶。因此臨床實驗室工作者如不能很好掌握分光光度法的技術，不了解各種影響因素，要作好酶的測定是很困難的。
三、熒光法和同位素法
分光光度法有一個缺點，即靈敏度較低。有些標本中酶濃度很低時往往測不出來。此時可考慮改用熒光法，可將測定靈敏度提高2-3個數量級。如科學家合成了一系列甲基傘形酮的衍生物，可取代對硝基酚衍生物做為一些水解酶的底物，由於水解產物甲基傘形酮有強烈熒光，大大提高測定的靈敏度，就是分光光度法中最常用的NAD(P)H反應系統，也可改用熒光法，在340nm紫外線激發下NAD(P)H產生強烈的藍色熒光，而NAD(P)不被激發。此外，還可使用在熒光法基礎上發展起來的時間分辨熒光法，例如北京醫院就曾利用此種靈敏度極高方法測定很難用其它方法檢測的腦脊液中微量的烯醇化酶。熒光法不易掌握，對所用的試劑、容器和儀器都要求很高，否則易產生非特異熒光干擾測定，或者引起熒光的淬滅使測定不準，故此種方法多用於研究實驗室，少用於常規實驗室。為提高靈敏度，還可使用同位素標記的底物進行酶測定，例如，有人以C12標記的乙醯膽鹼為底物測定膽鹼酯酶，在酶作用後以離子交換法分離出含C14的乙酸。同位素方法由於對人體有害，操作麻煩，目前已很少使用。
四、其它方法
離子選擇電極法，旋光法等有時用於測定特定的酶，當酶反應牽涉到有酸鹼變化時，很容易用pH儀直接觀察酶反應過程中H+的變化。直接用pH儀測酶反應有兩個缺點：一是隨pH變化，會偏離酶作用的最適pH值，不可避免地引起酶反應速度變慢。其二是如測定的標本不是純酶時標本中其他蛋白及其它有緩衡能力的物質將會影響所測pH變化的程度。此時如改用電位滴定儀則更為適合。此儀器可在酶反應過程中不斷向反應體系中加入酸或鹼以維持反應體系pH的恆定，而加入的酸鹼量只與體系中H+變化量相關，和反應體系中緩衡能力無關。
同樣如酶反應中有O2變化，可使用氧電極來監測酶反應過程，這可用來測定葡萄糖氧化酶活性，Chappell還成功地將此技術用於測線粒體的氧化能力。還曾有人嘗試用二氧化碳和氨電極測酶，由於這些電極反應時間較慢，不利於檢測酶反應速度。有些酶的反應物為光學異構體，則可根據旋光度變化來追蹤酶反應。某些反應物如羥基酸本身雖無旋光性，但與鉬結合後產生很高的旋光性。根據此特性建立了測定延胡索酸水合酶的方法。還有個別酶的測定使用了極譜法、高效液相色譜法等。總之，實驗室工作者完全可以根據實驗室現有儀器和技術，創造性地建立一些新的測活性濃度的方法。
過氧化氫酶的活性測定——紫外吸收法
【原理】
H2O2在240nm波長下有強烈吸收,過氧化氫酶能分解過氧化氫,使反應溶液吸光度(A240)隨反應時間而降低.根據測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性.
【儀器與用具】
紫外分光光度計；離心機；研缽；250ml容量瓶1個；0.5ml刻度吸管2支,2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恆溫水浴；
【試劑】
0.2mol/L
pH7.8磷酸緩沖液（內含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
0.1mol/L
H2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標定）.
【方法】
1.酶液提取：稱取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中,加入2～3ml
4℃下預冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿後,轉入25ml容量瓶中,並用緩沖液沖洗研缽數次,合並沖洗液,並定容到刻度.混合均勻將量瓶置5℃冰箱中靜置10min,取上部澄清液在4000rpm下離心15min,上清液即為過氧化氫酶粗提液.5℃下保存備用.
2.測定：取10ml試管3支,其中2支為樣品測定管,1支為空白管,按表40-2順序加入試劑.
表40-2
紫外吸收法測定H2O2樣品液配置表
管
號
S1
S2
S3
粗酶液(ml)
0.2
0.2
0.2
pH7.8磷酸(ml)
1.5
1.5
1.5
蒸餾水(ml)
1.0
1.0
1.0
25℃預熱後,逐管加入0.3ml
0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即記時,並迅速倒入石英比色杯中,240nm下測定吸光度,每隔1min讀數1次,共測4min,待3支管全部測定完後,按下式計算酶活性.
3.結果計算：
以1min內A240減少0.1的酶量為1個酶活單位（u）.
過氧化氫酶活性(u/gFW/min)=
式中
A240
=
AS0－
AS0—加入煮死酶液的對照管吸光值；
AS1,
AS2—樣品管吸光值；
Vt—粗酶提取液總體積（ml）；
V1—測定用粗酶液體積（ml）；
FW—樣品鮮重（g）；
0.1—A240每下降0.1為1個酶活單位（u）；
t—加過氧化氫到最後一次讀數時間（min）.
③ 如何從發酵液中分離一個蛋白酶如何測定其表達量和酶活
首先，去除菌體和殘余的發酵液，一般高速離心就可以，5000r/min離心1min.取上清。此部要根據蛋白質的特點來做。若果蛋白酶是在細胞內那麼要先破碎細胞，如果該酶的分子量過大，那麼要減小離心轉速。
其次，蛋白酶溶液中根據酶的性質，處理純化或提取。常用方法是有機溶劑提取法，陰、陽離子交換柱層析發，液相色譜法等。這要根據蛋白質的性質，是否帶電荷帶什麼電荷等。
關於酶活，應該每一步都要測定酶活，可用該酶分解蛋白質的特點，看一定的酶量在單位時間里分解蛋白的量，如果有特殊吸收峰的話可用紫外分光光度計測吸光度。
表達量，一般定量表達，常用方法是基因水平Realtime-PCR，蛋白水平，westen-blot法。也可參考其他相關文獻的方法。
④ sod酶活性測定方法
1、測定方法很多，常見的有化學法、免疫法和等電點聚焦法。其中化學法應用最普遍，化學法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會產生有色中間物和O2 -，利用SOD分解而間接推算酶活力。
2、在化學方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學發光法，腎上腺素法，NBT-還原法，光化學擴增法，Cyte還原法等。
（1）改良的鄰苯三酚自氧化法簡單易行較為實用。
（2）化學發光法和光化學擴增法不適用於測定Mn-SOD，但對於Cu/Zn-SOD反應極靈敏。（3）Cyte還原法用於Mn-SOD活力測定結果穩定，重復性好。但專一性和靈敏度不夠理想，而且需要特殊儀器，實際應用受到限制。
（4）亞硝酸鹽形成法與CN—抑制劑或SDS處理相結合，應用於Mn-SOD測定，靈敏度比Cyte還原法提高數倍，而且專一性強，重復性好，操作方便，不需要特殊儀器和設備，易於實際應用和推廣，是目前較好的測定方法之一。
⑤ 酶活力的測定方法及原理
酶活力的測定方法：有兩種主要方法即終止反應法和連續反應法。
終止反應法：是在恆溫反應系統中，每隔一定時間，取出一定體積的反應液，用強酸強鹼或SDS以及加熱等使反應立即停止，然後用化學法放射性化學法或酶偶聯法分析產物的形成量或底物的消耗量。這是最經典的酶活力測定方法，幾乎所有的酶都可以根據這一原理設計出具體的測定方法。
連續反應法：無須終止反應，而是在酶反應過程中用光化學儀器或電化學儀器等來監測反應的進行情況，對記錄結果進行分析，然後計算出酶活力。
酶活性測定的原理：
1. 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）
活性的測定 SOD採用氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反應步驟為：取200μl粗提液，加入3.7 ml NBT反應液50mmol/LpH7.8的磷酸緩沖液（PBS）配製的含77.12μmol/L氮藍四唑, 100μmol/LEDTA－Na2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液〕，在30℃下保溫2分鍾後加入100μl核黃素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸緩沖液中含80.2μmol/L 核黃素和100μmol/LEDTA－Na2），在4000Lx日光下反應20min。然後迅速測定A560。以不照光的管做空白。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。酶活性按以下公式計算：以抑制NBT光化還原的50％為一個SOD活性單位，結果以U/mg蛋白表示。以加緩沖液代替酶液的作為對照。
SOD總活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 式中， Ack為照光對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml）；Vt為測定時樣品用量（ml）；W為樣品鮮重（g）或蛋白質含量（mg）。
2. 過氧化氫酶（Catalase，CAT）
活性測定 CAT 活性參照Aebi (1984)[7]的方法進行測定。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL 。400 μL反應液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 µL粗酶液。反應從加入過氧化氫開始計時，連續測定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定義為：一個過氧化氫酶單位相當於在規定條件下於溫度25℃，pH7.0條件下1分鍾分解1μmol過氧化氫所需酶量，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。
3. 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）
活性的測定 PPO活性測定採用鄰苯二酚法（Aquino-Bolaños和Mercado-Silva，2004）。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。350µL反應液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配製，內含100µmol/L鄰苯二酚）中加入50 µL的粗酶液，平衡1分鍾後連續測定398nm吸光度的變化。以1分鍾內398nm吸光度上升0.01為一個酶活性單位，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。
4. 過氧化物酶（Peroxidase，POD）
活性測定POD活性測定採用愈創木酚法（Lurie等，1997)。用酶標儀進行測定時按比例調整為總反應體積為400μL。反應體系為30μL粗酶液，290 µL 0.3%愈創木酚（用50 mmol/L的PBS配製，pH 6.4）和 80µL0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配製，pH 6.4）。反應在加入H2O2 後開始准確記時。連續吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分鍾上升0.01為一個單位，結果以U/mg蛋白或U/g鮮重表示。
⑥ 怎樣消除（或中和、分解、）β-內醯胺酶有沒有檢測β-內醯胺酶的簡單方法謝謝~~！
一、消除：
暫時沒有什麼有效的針對性清除辦法，比較可行的是使用舒巴坦（Sulbactam）之類的不可逆競爭性β-內醯胺酶抑制劑。前者和β-內醯胺酶發生不可逆的醯化反應使酶失活,當抑制劑去除後酶的活性也不能恢復，其作用比較顯著。
二、檢測：
1.常規方法
(1).微生物法：
[原理] 以一種對青黴素高度敏感的細菌-枯草芽孢桿菌作為指示劑，試驗時如果被測細菌株產生青黴素酶，破壞了青黴素，則此高度敏感菌株即可生長，否則，指示劑則被抑制。
[方法] 以枯草芽孢桿菌為指示菌，用棉拭子將枯草芽孢桿菌接種於瓊脂培養基上，或傾注方法將枯草芽孢桿菌混於瓊升凱喚脂平板內。然後將被測菌與產青黴素酶陽性及陰性對照菌株，按下圖接種劃線，在瓊脂培養基中央放置一含青黴素G（1單位）紙片。放置35℃培養24小時後觀察結果。
[結果判斷] 如被檢菌產生青黴素酶，則沿著被測菌處的枯草芽孢桿菌抑菌環出現凹痕。
(2).碘量法[3]
[原理] β-內醯胺酶能裂解青黴素的β-內醯胺環形成青黴噻唑酸，它與澱粉競爭游離碘，破壞了碘和澱粉的蘭色復合物，使蘭色變為無色。
[方法]
①將0.25克青黴素溶於41.7mlPH6.0的磷酸鹽緩沖液中，使其濃度成6000ug/ml。取0.1ml於一小試管中。孫團
②將培養18-24小時的細菌在含青黴素試管內製成濃厚菌懸液（109/ ml）。
③在37℃水浴中吵凱放置30分鍾，不時搖動，使酶能破壞青黴素。
④加入1%可溶性澱粉溶液0.5 ml，搖勻。
⑤加入碘液0.02 ml。
⑥在37℃水浴中放置10分鍾，觀察結果。
[結果] 在10分鍾內能使蘭色完全消退的菌株為β-內醯胺酶陽性，不消退者為陰性。
[注意事項]
①由於青黴素很容易分解，因而用於實驗的青黴素應新鮮配製。
②澱粉也新鮮配製，在100 ml蒸餾水中加入1克可溶性澱粉，放到開水中水浴直到澱粉溶解。
③實驗應按照步驟操作，如果碘加得過早，酶反應就會停止，產生假陰性結果。
④每次試驗最好用陽性和陰性對照。
（3）.紙片酸度定量法[3]
[原理] β-內醯胺酶能破壞青黴素中的β-內醯胺環，形成青黴噻唑酸，使PH降低，指示劑溴甲酚紫顏色由紫變黃。
[方法]
①將一小片Whatman濾紙放於空平皿中。
②讓濾紙吸足青黴素溶液（0.05M磷酸緩沖液，PH8.0+0.2%溴甲酚紫+5%無緩沖劑的結晶青黴素）。
③用接種環把10-20個菌落塗到濾紙上，
④蓋好平皿後，將濾紙片在37℃孵育30分鍾，觀察結果。
[結果] 產β-內醯胺酶的菌株使濾紙顏色由蘭色變黃色，一般在10分鍾內即能看到。
（4）.產色頭胞菌素法[4]
[原理] 產色頭胞菌素如頭胞硝噻吩（nitrocefin）的β-內醯胺環能被β-內醯胺酶所破壞，使其顏色由淺黃色變為粉紅色，以此來測定細菌的產酶情況。
[方法] 將頭胞硝噻吩（nitrocefin）紙片置於干凈的平皿內，用無菌的牙簽或接種環挑取細菌菌落塗於紙片上，觀察紙片有無顏色變化。
[結果] 紙片塗抹處如顏色由淺黃色變成粉紅色，表示該菌產生β-內醯胺酶，如顏色不變，表示細菌不產生β-內醯胺酶。
檢測β-內醯胺酶方法中，生物學方法是古老的方法，由於特異性差、靈敏度低，現在基本上很少被採用，頭胞硝噻吩（nitrocefin）主要檢測淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）、葡萄球菌，結果可靠。紙片酸度定量法一般用於檢測淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌和葡萄球菌。碘量法常用於檢測淋病奈瑟氏菌，但莫拉氏菌（布拉漢氏菌）只能用頭胞硝噻吩（nitrocefin）法。
對於淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）快速測定β-內醯胺酶比做葯敏試驗能更快地得到臨床需要的結果。β-內醯胺酶試驗還可驗證葡萄球菌對紙片法青黴素的敏感試驗結果是否可信。腸桿菌科、假單胞菌科及其它需氧革蘭氏陰性桿菌不必測定β-內醯胺酶，因其結果常常不能預測這類細菌對臨床常用來治療β-內醯胺類抗生素葯物的敏感性[5]。