『壹』 多糖的紫外光譜怎麼看
經過分級純化的多糖在測定結構前須檢查其純度及測定分子量。
檢查純度最常用的判斷方法：
（1）用gc、hpLc測純吵做定組成多糖的單糖的摩爾比是否恆定。
用不同的柱型測定結果更為可靠。
（2）電泳只出現一條帶。
如可用聚丙烯醯胺凝膠電泳、乙酸纖維素薄膜電泳及玻璃纖維紙電泳。對於碰頃中性多糖可採用高壓電泳，以硼酸鹽為緩沖液，可增大其遷移速度。
（3）凝膠柱層析圖呈現對稱的單峰。若有「拖尾」現象，說明其均一性不夠好。陰離子交換層析純化
用DeAe一纖維素52(2.6x100cm)柱層析,0.lmol/Lnacl洗脫,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管檢測,繪制收集體積與糖含量之間的關系曲線。看是否有單一對稱峰。
按照Ye等報道,採用DeAe一52一纖維素交換柱層析法(2.6x30cm)對鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖進行初步分離。DeAe一纖維素凝膠預處理:稱取DeAe一52一纖維素凝膠乾粉,加入約10倍體積質量比(ml/g)的0.5mol/Lna0h溶液浸泡30分鍾,倒出上清液,用大量去離子水反復浸洗至ph值近中性;再用相同體積的0.5mol/LhcI溶液浸泡30分鍾,倒出上清液,用大量去離子水反復浸洗至ph值近中性;最後用相同體積的0.5mol/lnaoh溶液再浸泡30分鍾,用大量去離子水反復浸洗至ph值中性。處理完畢後,進行濕法裝柱,用去離子水0.5mol/Lnacl溶液,去離子水依次分別平衡(流速1.0ml/min)2一3個柱體積備用.
糖樣100mg溶於5ml的去離子水中,離心除去不溶物,上樣於DeAe一52一纖維素陰離子
-1層析柱(2.6x30cm,cl型),分別採用去離子水0.1和0.3mol/LnacI溶液進行分段梯度洗脫,
流速1.0ml/min,自動收集器分部收集(10ml/管),每梯度20管。用硫酸一苯酚法跟蹤檢測各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數為橫坐標。吸光值(490nm)為縱坐標繪制DeAe一52一纖維素色譜柱洗脫曲線。依據洗脫峰型,合並相同組分,50℃旋轉蒸發濃縮,對去離子水透析48h以去除nacI及小分子雜質,最後將透析內液冷凍乾燥,得初步純化產品。
初步純化多糖得率計算公式:
多糖得率(%)=純化多糖質量/粗多糖質量x100%
葡聚糖凝膠層析純化
採用sephadexg-100凝膠層析法對DeAe-52一纖維素初步純化的不同組分的多糖樣品進一步純化。葡聚糖凝膠(sephadexg一100)的預處理:稱取sephadexg一100凝膠乾粉,加入30倍體積質量比(ml/g)的去離子水,沸水浴5小時使其溶脹。冷卻後用去離子水反復浸洗,減壓脫氣後進行濕法裝柱,用0.1mna2so4;溶液平衡(流速0.25ml/min)2一3個柱體積備用。
分別稱取經DeAe一纖維素一52初步純化的各多糖組分樣品20mg,溶於2ml0.1mna2so4溶液中,上樣於sephadexg一100層析柱(2.6x60cm)用0.1mna2so4溶液溶液洗脫,流速0.25ml/min,分步收集(5ml/管)。
用硫酸一苯酚法跟蹤檢測各管多糖含量(490nm處吸收值),以收集的管數為橫坐標。吸光值(490nm)為縱坐標繪制sephadexg一100色譜柱洗脫做衡曲線。依據洗脫峰型,合並相同組分,50℃旋轉蒸發濃縮,對去離子水透析48h以去除na2so4;及小分子雜質,最後將透析內液冷凍乾燥,得不同純化產品。
純化多糖得率計算公式:
純化多糖得率(%)=純化多糖質量/粗多糖質量x100%
（鮑氏層孔菌菌絲體粗多糖）
（4）紙層析法呈單一集中斑點。
取0.5%的多糖樣品溶液50ul,點樣於新華中速濾紙(3cmx20cm)距端點1cm處的中部,以正丁醇:濃氨水:水(4o:50:5)為展開劑,飽和2小時以上,在室溫下展開6h,取出吹乾,用0.5%甲苯胺藍液染色,立即用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一個清晰的斑點。
（5）瓊脂糖(Agarose)凝膠電泳法
在瓊脂糖板(厚度為0.2cm)上點樣3一5ul採用濃度為0.075mol/L,ph8.6的巴比妥緩沖液,電泳1-1.5h,電壓為64一80V,甲苯胺藍(濃度為1%)染色,醋酸乙醇混合溶液(醋酸:乙醇:水=0.1:5:5)脫色。多糖純品經電泳展開後,看是否呈現單一斑點,斑點是否清晰。
（6）紫外分光光度法
將多糖pwZ加0.9%nacI溶液溶解,配成濃度為1mg/ml的溶液,採用uV一16oA紫外可見光譜儀掃描(200nm一30onm)觀察260nm、280nm處是否有吸收峰。
多糖的分子量測定：
過去用超速離心沉降法、光散射法、滲透壓法、粘度法(:多糖質譜鑒定)等，這些方法操作復雜且誤差較大，現已少用。現在較常用的方法有凝膠過濾法和高效凝膠液相色譜法，這兩種方法須先用已知分子量的標准多糖對照測定樣品的分子量。
一般來說，多糖結構分析包括以下幾點：
（1）單糖組成分析：研究確定單糖的種類及摩爾比；
完全酸水解後用高效液相色譜方法(hpLc)或氣相色譜方法測定。
（2）糖苷鍵類型：研究確定糖苷鍵及支鏈點連接位置；
甲基化分析方法
高碘酸氧化法與smith降解法
（3）糖環大小：研究確定糖苷鍵為呋喃糖或吡喃糖；
紅外光譜
（4）異頭碳構型：研究確定糖苷殘基的a-或p-構型；
2DnmR.()光譜分析方法測
（5）確定單糖殘基和重復單元的序列
甲基化分析方法與磁共振光譜分析方法結合分析，一般會參考多糖的單糖組成及摩爾比信息以利於解析多糖結構。
高碘酸氧化法
薄層層析(TLc)——定性，
氣相色譜法
（6）取代基團位點：研究0h-修飾基團的種類和取代位點，如0-磷酸化，乙丑基取代，0-
硫酷化等；
比色分析方法
（7）多糖分子量分布的研究。
紫外光譜
定性與定量方法
薄層層析：殘基定性
氣相色譜：殘基定量
氣質聯用：殘基定量
高效陰離子色譜法：殘基定量
鑒定結構常用物理化學方法：
高效液相色譜:確定單糖組分和相對分子量
紅外光譜分析:測定多糖的官能團，不僅可以檢測酮糖、酵糖的恥喃糖環或呋喃糖環的構象和糖苷鍵的構型
核磁共振:α-構型與β-構型殘基的比例；判斷異頭碳構型；推斷主鏈和支鏈連接鍵型鑒定結構復合方法：
甲基化分析:推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例
高碘酸氧化法與smith降解法:判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度及支鏈多糖的分支數目
糖睛乙酸酷衍生物的氣相色譜法:單糖組成和摩爾比
各種多糖化學結構鑒定方法的具體實施方案
1、酸水解
（1）完全酸水解
-1稱取20mg樣品,加入2mL2mol·L的h2so4於安培管中沸水浴水解8h,水解液用
baco3中和至ph=7,離心,取上清夜置冰箱冷藏備測。（阿魏側耳子實體多糖分離純化及其化學結構的初步研究）
（2）部分酸水解
稱取糖樣70mg，80℃條件下，0.05m三氟乙酸水解2h。降至室溫後，離心（4000r/min，10min），將沉澱乾燥，留做gc分析。上清用無水乙醇除酸至中性(ph為6～7)，蒸餾水透析48h：將袋外透析液濃縮，真空乾燥，留做gc分析；袋內液濃縮至5ml左右，加10倍體積無水乙醇，醇沉過夜，離心(4000r/min，10min)，沉澱常規乾燥，作gc分析；上清濃縮，真空乾燥，留做gc分析。
2、高效液相色譜
確定樣品的單糖組成
色譜條件為:
色譜柱為shodexKs804sugar(300mm×7.8mm)
柱溫40度
流動相為水
-1流速0.8mL·min
檢測用410RⅠ示差檢測器，數據處理用810gpc軟體進行。
同時用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、岩藻糖8種單糖進
行對照,根據峰值確定樣品的單糖組成。
分子量的測定以標準分子量的葡聚糖pulluan作分子量測定標准。讓其通過高壓液相色譜柱,條件同上,先以分子量對數與對應的保留時間作標准曲線,從標准葡聚糖pulluan的工作曲線上可以求得該成分分子量。
例如：（阿魏側耳子實體多糖分離純化及其化學結構的初步研究）
將水解後的多糖樣品pw2進行hpLc分析,結果如表所示:阿魏側耳子實體多糖pw2經過酸水解後,得到2種單糖:葡萄糖和半乳糖,摩爾比例1.77∶1。
例如：
4經hpLc測定後對照標准曲線得多糖pw2的分子量為3.18×10。（阿魏側耳子實體多糖
分離純化及其化學結構的初步研究）
4、甲基化分析
(1)基本原理
先將多糖中各種單糖殘基中的游離羥基全部甲基化，然後將多糖中的糖苷鍵進行完全酸水解，水解後得到的化合物，其羥基所在的位置，即為原來單糖殘基的連接點。同時根據不同甲基化單糖的比例，可以推測出此種連接鍵型在多糖重復結構中所佔的比例。
用此種方法得到的羥基及nabh4還原醛基後產生的羥基，經乙醯化可得到甲基化的糖醇乙酸酯(此產物易揮發，可進行gc分析)，再經gc與gc-ms分析，通過氣相色譜的出峰順序和對質譜譜圖的主要離子碎片的分析便可以較准確地確定糖的連接鍵型。
反應通式如下
:
（2)甲基化反應
取充分乾燥的多糖樣品10mg，溶解在2.0ml的二甲基亞礬（Dmso)中。在n2保護下快速加入乾燥的naoh粉50mg，用n2排出空氣，加蓋密封，室溫反應1.0h並間歇振盪。在n2保護下緩慢滴加碘甲烷1.0ml，用n2排出空氣，加蓋密封，室溫繼續反應1.0h並間歇振盪，反應完成後加0.5ml水終止反應。反應液先用自來水流水透析48h，再用蒸餾水透析24h，透析液冷凍乾燥得第一次甲基化樣品。第一次甲基化樣品繼續甲基化，反應步驟同上，得第二次甲基化樣品。如此重復甲基化三次。甲基化後的樣品用紅外光譜檢測，3700
cm-1—3100cm-1，附近無羥基的特徵吸收峰，表明甲基化反應完全。
（3)甲基化樣品的衍生化
上述完全甲基化多糖樣品加入2mol/1的三氟乙酸(TFA)3.0ml,120℃密閉水解2.0h。冷卻後50℃減壓蒸發干，加2.0ml甲醇再蒸發干，重復三次，最後蒸發幹得完全甲基化多糖的水解產物。加蒸餾水2.0ml使其溶解，再加硼氫化鈉25mg，振盪後室溫還原反應2.0h。反應完後滴加0.1mol/1醋酸分解過量的硼氫化鈉並調ph值至5.5~7.0弱酸性。反應液50℃減壓蒸發蒸干，加2.0ml甲醇再蒸干，重復三次，最後蒸發干。
上述蒸發干樣品加入1.0ml醋酸酐和1.0ml吡啶，封管後在沸水浴中反應1.0h。反應液50℃減壓蒸發干，加2.0ml甲醇再蒸發干，重復三次，最後蒸發干。加入丙酮1.0ml，用0.45ul尼龍微孔濾膜過濾，取樣進行gc/ms分析。
(4)衍生化樣品的gc/ms分析
多糖樣品經甲基化、水解、還原、乙醯化後得到甲基化糖醇乙酸酯，進行gc/ms聯機分析，根據文獻的相對保留時間和不同單糖的主要離子碎片(m/e），推斷出多糖樣品中糖基的連接方式及各種連接鍵型的比例。
本實驗採用的條件為:gc(Variancp3800型)和ms（Variansatum2200型)氣相一質譜聯用儀，Db-5ms石英毛細管柱(30mx0.25mmx0.25um);程序升溫，初溫80℃，保持1min，以8℃/min升至210℃，保持1min，再以20℃/min升至260℃,保持1min;氦氣作載氣，進樣口溫度250℃，分流比1:50，柱流速1.0ml/min;電子電離源(eI源)70eV，倍增器電壓350V，燈絲電流250uA，介面溫度260℃,離子源溫度180℃，質荷比(m/z)掃描范圍30~450，掃描速率2.5scan/sec。（胞式層孔菌菌絲體多糖分離純化、結構鑒定及其生物活性研究）
流程圖如下：（mAep-2a-2b是安絡小皮傘菌絲體多糖的某個過程中第某個樣品）
篇二：1多糖含量檢測
億信檢測推出單糖組成方案
簡介：gc-ms（氣相質譜聯用技術測定單糖組成）
1多糖含量檢測
方法：苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，並迅速脫水生
『貳』 鑒定多糖的方法
Molisch反應（α- 萘酚反應） 此方法是鑒定糖類最常用的顏色反應。它的原理是：糖類在濃酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以與α- 萘酚作用，形成紅紫色復合物。由於在糖溶液與濃硫酸兩液面間出現紅紫色的環，因此又稱紫環反應。α- 萘酚也可用麝香草酚或其他的苯酚化合物代替，麝香草酚溶液比較穩定，其靈敏度與α- 萘酚一樣。除了糖類之外，各種糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等都可以呈現近似的陽性反應。因此，陰性反應證明沒有糖類物質的存在；而陽性反應只能說明有糖類存在的可能。
此反應不能鑒別多聚糖如澱粉，纖維素等。 贊同0| 評論
『叄』 靈芝多糖含量測定的方法
靈芝粗多糖是靈芝孢子最主要的有效成分。以粗多糖的檢測方法為例進行說明。 靈芝粗多糖的檢測方法如下：
1）試劑：
濃硫酸；無水乙醇；5％苯酚溶液；80％乙醇溶液
2）樣品處理
取樣品2.0g於200ml容量瓶中，加入約150ml水，沸水浴提取40min，取出，放冷，用水定容，搖勻後過濾，取濾液10ml，加入40ml無水乙醇，3000轉/分離心5min，棄去上清液，殘渣用80％乙醇洗滌，離心（重復此過程2次），用水溶解殘渣，定容為20ml。此液即為樣品處理液。
3）標准曲線
取0.2mg/ml葡萄糖標准溶液0.0, 0.10, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50ml，用水定容為1.0ml，加入0.5ml苯酚溶液，10ml濃硫酸，混勻，放置至室溫，於L= 1ml，波長＝485nm測定吸收光度，繪制標准曲線。
4）樣品測定
取樣品處理液0.5ml於具塞比色杯中，以下同標准曲線操作。測定吸光度。
5）計算
C×200×20/10/0.5
X (mg/g) = ————————
M x 1000
式中：X：為樣品粗多糖含量(mg/g)
C：為從標准曲線上查出的含量（μg）
M：為取樣量（g）