微孔板生物檢測方法

㈠ 簡述檢測蛋白質磷酸化的檢測方法及其原理

方法及原理：
1.激酶活性分析
生物學樣品中的激酶活性通常是在體外測定的，在ATP的存在下將免疫沉澱的激酶與外源底物共同孵育。之後通過一些報告系統來評估特定激酶對底物的磷酸化，包括顯色、放射性或熒光檢測。
直接測定蛋白磷酸化的一種經典方法是將整個細胞與放射性標記的32P-磷酸鹽共同孵育，獲得細胞提取物，通過SDS-PAGE分離，並曝光在膠片上。這種繁瑣的方法需要多次幾小時的孵育，且使用放射性同位素。其他傳統方法包括2D凝膠電泳，這種技術假定磷酸化會改變蛋白的遷移率和等電點。
2.WesternBlot
利用SDS-PAGE分離生物樣品，隨後轉移到膜上（通常是PVDF或尼龍膜），之後利用磷酸化特異的抗體來鑒定目的蛋白。
由於測得的磷酸化蛋白水平可能隨處理或凝膠上樣誤差而變化，研究人員常常利用一個抗體來檢測同源蛋白的總水平（而不考慮磷酸化狀態），以確定磷酸化組分相對於總組分的比例，並充當上樣內對照。化學發光和顯色法都很常用，而分子量marker常用來提供蛋白分子量的信息。
3.酶聯免疫吸附分析（ELISA）
ELISA的定量能力優於Westernblot，且在調節激酶活性和功能的研究中表現出巨大的作用。這種微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特異的捕獲抗體，與磷酸化狀態無關。隨後讓目的蛋白結合在抗體包被的分析板中，目的蛋白可以是純的，也可以是復雜的異質樣品（如細胞裂解液）中的一個組分。加入待分析的磷酸化位點特異的檢測抗體。這些分析通常設計為顯色或熒光檢測。
4.基於細胞的ELISA
來自目的蛋白的信號可通過第二種蛋白來標准化，校正各孔之間的差異，實現磷酸化蛋白水平的准確評估，並比較多個樣品，與傳統免疫印跡中使用磷酸化特異和總蛋白抗體相似。這些分析繞過了制備細胞裂解液的需要，因此更適合高通量分析。
5.質譜
首先，磷酸化肽段的信號通常較弱，因為它們帶負電荷，而電噴霧質譜在正電模式下作用，因此電離效果不好。其次，在大量非磷酸化蛋白的高背景之下，很難觀察到低豐度目的蛋白的信號。
6.多個分析物圖譜分析

㈡ 食品微生物檢驗內容與檢測技術方法

食品微生物檢驗內容與檢測技術方法

近年來，世界各地出現了諸多嚴重的食品安全事故，由於食品微生物污染而造成的質量事故嚴重威脅著人們的身體健康，如何做好食品微生物檢驗，確保食品質量安全，就需要社會各界共同努力。根據國際和國內衛生組織的相關規定和要求，所有的食品生產廠商都要對食品的質量進行嚴格的檢驗，對於生產出來食品的菌落種類、細菌數量、大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等進行檢測，必須達到要求的合格標准才能進入市場進行出售。下面是我為大家帶來的食品微生物檢驗內容與檢測技術方法的知識，歡迎閱讀。

需要注意的問題

一是工作人員及活動規定。必須保證參加檢測的人員具有相應的資格，並通過相關的考試後，持證上崗才能開展相關活動。同時要求工作人員不僅需要具有高超的專業技術，還應該有良好的職業道德修養，盡可能降低人為問題的制約。檢測過程需要按照相關的活動規范和流程進行，使用無菌設備認真地進行抽樣活動，採用先進技術獲取相關信息。二是存放裝置。若想檢測過程順利進行，除了確保實驗室有必要的設施外，還應該重點考慮裝置存放的條件和要求。三是裝置和葯品的配置。在各項裝置進行安裝時應該對氣溫進行調節，確保其安穩，對裝置氣溫穩定性合乎規定要用的具體時間詳細記錄。同時在規定的時間內對各種裝置進行消毒處理，並通過感應設備對其運作狀態進行監測。對於葯品的配置，培養基往往在121℃下採用高壓濕熱滅菌法滅菌15分鍾;較為敏感的'培養基一般採用膜過濾法。四是樣本的處理。在樣本收集過程中，需要確保抽樣活動是在無菌環境下展開的，有效避免了樣本被污染。在樣本輸送時，應該防止樣本受到光線的影響而出現污染現象，抽樣之後就應該及時將其送至測試場地。一般樣本輸送時間要控制在3h內，如果無法及時送到，要確保在近乎之前的氣溫時將其完整的存放。

食品微生物檢驗內容

一是檢驗食品污染程度指示菌。細菌總數即菌落總數，是食品和生活飲用水檢樣處理後，在特定培養條件下，所得1g或者1mc檢樣中所含有的細菌菌落個數，這就是判斷食品和生活飲用水污染程度的關鍵指標。大腸菌群系是在37℃下培養24h的一群發酵乳糖、產氣、產配以及需氧或者厭氧的革蘭氏染色陰性無芽胞桿菌。這種菌群主要來源於人和牲畜的糞便，因此，可以用糞便的污染指標菌對食品的衛生質量進行評價。二是檢測食品中治病菌。在食品微生物相關檢驗標准中已經明確規定某些微生物的數量，因此在對食品污染程度指示菌檢測的同時，還應該對一些治病菌進行測定，如沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等。

食品微生物檢測技術方法

很長時間以來，開展的此項檢測活動，是按照瓊脂平板的措施來進行的，通常要兩到三天的時間才可以完成。最近，許多的專家和組織都不斷地對工藝以及措施進行深化分析，獲取了非常高的成就，對許多措施進行了改進，切實提升了檢測的精準性以及安穩性特徵，而且獲取了許多全新的工藝，具體有如下的措施：

1.採用電阻抗法。具體的講，它是指細菌繁衍的時候，將會使培養基中的火分電惰性物質如碳水化合物、蛋白質和脂類等，代謝為具有電活性的小分子物質，其能增加培養基的導電性，進而導致阻抗出現改變，因此，可以通過檢測培養基的電阻抗變化情況來判定細菌在培養基中的生長繁殖特性，即可檢測出相應的細菌。

2.採用快速酶觸反應及代謝產物的檢測。細菌在生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，所以根據其特性來選用相對應的底物和指示劑，而且合理的記載信息。

3.採用分子生物學技術。它涵蓋兩項內容：1)核酸探針技術。結合鹼基互補相關的概念，使用獨特的措施來對物體進行標注。2)聚合酶鏈式反應(PCR)技術。其原理為通過加熱使雙鏈DNA經裂解成兩條單鏈，成為引物和DNA聚合酶的模板;接下來把氣溫變低，使寡聚核苷酸引物與DNA分子上的互補序列退火。通常狀態中，當退火的氣溫非常高的話，它的擴增特性就十分的優秀。

4.採用免疫學方法檢測細菌抗原和抗體的技術。具體有三項措施：1)熒光抗體檢測技術(IFA)，它又有兩種，分別是直接的以及間接地。其中第一種是直接在樣本上滴加已知特異性熒游標記的抗血清，然後對其清洗，進而獲取信息。而後一種措施是在檢樣上滴加已知細菌特異性抗血清，等到發生反映之後再仔細地清洗，再加入熒游標記的抗體後在熒光顯微鏡下觀察結果。2)免疫酶技術(EIA)，其是將抗原、抗體特異性反應和酶的高效催化作用原理結合，此法非常的獨特，而且功效非常好。通過共價結合將酶與抗原或抗體結合，形成酶標抗原或抗體，或通過免疫方法使酶與抗酶抗體結合，形成酶抗體復合物。3)免疫磁珠分離法(IMS)，即應用抗體包被的免疫磁珠，用一個磁場裝置收集鐵珠。

5.採用儀器法。1)微型全自動熒光酶標分析儀(Mini-VIDAS)，其主要採用具有優異的敏感性和特異性的酶聯熒光技術(ELFA)，得到的熒光和抗原的比例是一種順向的關系。2)全自動微生物分析系統(Vietk-AMS)。它能夠一次對非常多的樣本開展分析，而且檢測的時間不需要非常久，通常在兩到三個小時即可，此法的效率非常好，同時也將成為檢測行業全行的發展趨勢。

㈢ HIV核酸檢測的HIV核酸檢測方法及程序

1.1 方法和試劑
1.1.1 方法
（1）檢測方法為商品化試劑盒和實驗室自建方法，商品化試劑應嚴格按說明書操作。下面介紹的方法是實驗室自建方法，供參考。
（2）檢測血漿或血清樣品使用逆轉錄PCR（RT-PCR）方法，建議第一輪PCR擴增使用RT-PCR一步法；檢測血細胞或組織樣品使用PCR方法。一般使用擴增兩輪的套式PCR方法。
（3）設立陽性、陰性及空白對照。陽性對照為與待測樣品同質、含有目的基因的樣品；陰性對照為與待測樣品同質、不含有目的基因的樣品。陽性和陰性對照樣品應與待檢樣品處理程序一致。陰性對照的設置數量應根據實驗樣品的數量設置在不同的位置。
1.1.2 試劑
（1）PCR引物：一般使用擴增HIVgag和/或pol和/或env和/或LTR等引物。進行RNA逆轉錄時可使用下游特異性引物或隨機引物。引物設計可參考文獻或自行設計，應盡量涵蓋常見的HIV流行毒株，也可使用兼並性引物。
（2）主要試劑：包括核酸提取純化、逆轉錄、PCR所需的試劑。使用商品化核酸提取純化試劑、逆轉錄酶反應試劑和PCR擴增試劑。
（3）抗污染試劑：實驗室自建檢測方法可使用抗污染試劑，參考尿嘧啶DNA糖基化酶抗污染方法。
1.2 擴增目的基因片段
1.2.1 樣品的採集和處理
1.2.2 核酸提取
可使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動化儀器等商品化試劑或設備並按說明書操作。提取RNA時應注意防止RNA降解。DNA應置於-20℃保存，RNA和需長期保存的DNA應置於-80℃保存。
1.2.3 逆轉錄合成cDNA
使用商品化試劑並按說明書操作。逆轉錄cDNA合成反應需使用逆轉錄引物、dNTPs、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規定的溫度和時間下進行逆轉錄反應。建議使用商品化RT-PCR一步法試劑進行第一輪擴增反應。
1.2.4 PCR擴增反應
使用商品化試劑按說明書操作。PCR反應需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、緩沖液、和適量無RNA/DNA酶超純水、以及模板（DNA或cDNA）。在擴增儀中，按照設定的程序進行擴增。一般使用二次擴增的套式PCR擴增方法。
1.3 擴增產物分析及結果報告
1.3.1 擴增產物分析
擴增產物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標准比較，判斷擴增片段是否在預期的分子量范圍內。其它擴增產物分析方法還有限制性內切酶酶切分析、特異性探針雜交分析以及DNA序列分析等。自動化核酸擴增儀使用酶聯比色分析或熒光探針雜交等原理測定。
1.3.2 結果判定和報告
（1）實驗成立的條件：每一次檢測需同時做兩個陽性對照、兩個陰性對照，只有陽性對照擴增出預期的片段、陰性對照沒有擴增出任何片段、雙份平行樣品結果一致的情況下實驗才成立，可以作出核酸陽性或陰性反應結果的判定。
（2）HIV核酸檢測陽性：使用商品化檢測試劑，發現核酸陽性反應，應該重復採集樣品進行復測，復測結果呈核酸陽性反應則判定為核酸陽性，復測結果為核酸陰性反應則判為不確定結果，需進一步隨訪檢測。
（3）HIV核酸檢測陰性：只可報告本次實驗結果陰性。
（4）應在完成檢測後7個工作日內發出檢測報告。 2.1 方法
HIV核酸定量檢測主要基於靶核酸擴增RT-PCR和信號放大擴增兩種方法。國內常用的方法中，NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1採用國際單位（IU/ml），與NASBA的拷貝數關系基本為1:1；Amplicor Cobas 的拷貝數約為1.2～1.5國際單位；bDNA方法的拷貝數約為0.8～1.0國際單位。不同方法的關系與HIV的亞型有關。
2.2 試劑
必須使用經中國葯品生物製品監督管理局注冊批準的商品化試劑並嚴格按說明書操作。
2.2.1 靶核酸擴增試劑和性能
（1）RT-PCR擴增試劑
1）Amplicor HIV-1 Monitor v1.5（RT-PCR微孔板捕獲比色分析法），核酸手工提取（異丙醇沉澱），比色分析測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，可擴增HIV-1M組的A-H基因亞型。標准法的檢測線性范圍是400～750，000；超敏法的線性范圍是50～100，000 RNA拷貝/毫升。
2）COBAS Amplicor HIV-1 Monitor v1.5, 核酸手工提取（異丙醇沉澱），儀器測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，可擴增HIV-1M組的A-H基因亞型。標准法的檢測線性范圍是400～750，000；超敏法的線性范圍是50～100，000 RNA拷貝/毫升。
3）COBAS AmpliPrep/COBAS Amplicor HIV-1 Monitor v1.5 （COBAS Amplicor 分析儀）,儀器提取核酸，儀器測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，可擴增HIV-1M組的A-H基因亞型。標准方法的檢測線性范圍是400～1，000，000；超敏方法的線性范圍是50～100，000 RNA拷貝/毫升。
以上三種試劑均採用基於PCR擴增靶核酸檢測法，僅在設備的使用、自動化程度和樣品制備的方法有所不同。
4）COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test（實時熒光探針RT-PCR分析法）, 儀器提取核酸,實時熒光探針PCR擴增儀器測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，可擴增HIV-1M組的A-H基因亞型。檢測線性范圍是40～10，000，000 RNA拷貝/毫升，比上述三種方法的檢測線性范圍要寬，樣品可不經稀釋一次完成檢測。
以上四種試劑均使用一個內部定量標准品，1個陰性、1個弱陽性和1個強陽性外部外部質控品。均使用dUTP/UNG防污染試劑。
5）LCx HIV RNA Quantitative Assay（競爭性RT-PCR微顆粒酶免疫分析法）,手工或儀器提取核酸（活化硅膠柱純化），儀器測定。擴增靶核酸位置是pol（整合酶）基因區，可擴增HIV-1基因M組的A-G亞型和0組病毒，尤其可檢測M組C基因亞型和一些重組病毒。檢測線性范圍是50～1，000，000 RNA 拷貝/毫升；使用一個內部定量標准品和六個外部定量標准品。
6）RealTime HIV-1 Assay（實時熒光探針RT-PCR分析法）,使用獨特的雙鏈熒光探針。手工或儀器提取核酸（磁性顆粒純化），儀器測定。擴增靶核酸位置是pol（整合酶）基因區，擴增HIV-1基因亞型是M組的A-G亞型和0組以及N組病毒。檢測線性范圍是40～1，000，000 RNA 拷貝/毫升。使用一個內部定量標准品。檢測結果與LCx HIV RNA Quantitative Assay結果高度相關。
（2）基於核酸序列擴增試劑（NASBA擴增技術）：以等溫方式直接擴增HIV-1 RNA。
NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1（實時熒光探針分析法）, 使用熒游標記的分子信標探針技術檢測擴增子。手工或儀器提取核酸（硅膠純化，異丙醇沉澱）,儀器測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，擴增HIV-1基因亞型是M組的A-G亞型。檢測線性范圍是50～3，000，000 RNA 國際單位/毫升；使用一個內部定量標准品，沒有陰陽性外部外部質控品。每次檢測8的整數倍樣品，直至48個。檢測結果與Versant HIV-1 RNA、和Amplicor HIV-1 Monitor v1.5 方法的結果有著高度的相關性。國際上已經推薦使用V2.0試劑盒。
2.2.2 信號放大擴增試劑和性能
Versant HIV-1 RNA 3.0.bDNA（分枝狀DNA探針雜交微孔板捕獲比色分析法）, 利用分枝狀DNA多級信號放大原理。無需RNA純化和PCR擴增步驟。離心濃縮病毒子並用去垢劑和蛋白酶K消化病毒釋放病毒RNA，儀器測定。擴增靶核酸位置是pol基因區，擴增HIV-1基因亞型是M組的A-H亞型，檢測線性范圍是50～500，000 RNA 拷貝/毫升；使用六個外部定量標准品，1個陰性、1個弱陽性和1個強陽性外部外部質控品。每次可檢測12的整數倍樣品。
以上試劑均可使用EDTA和ACD作為樣品的抗凝劑，NucliSens HIV-1 QT和NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1以及Versant HIV-1 RNA 3.0.bDNA試劑還可以使用肝素作為抗凝劑。如果必須使用經肝素處理的血漿樣品進行RT-PCR擴增，則必須在樣品中直接加肝素酶消化肝素。
2.2.3 實時熒光定量PCR技術
實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標准曲線對未知模板進行定量分析的方法。每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系。利用已知起始拷貝數的標准品可作出標准曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標准曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
實時熒光定量PCR擴增的實驗檢測過程可分為：（1）樣品制備,抽提和濃縮目標RNA分子，並除去可能存在的抑制因子。（2）Real-time PCR，檢測PCR的產物使用熒游標記的寡核苷酸探針。檢測的原理基於熒光信號增長曲線與循環數相關。（3）RT-PCR反應，病毒RNA利用逆轉錄酶將RNA逆轉錄為cDNA，然後通過DNA聚合酶對特定片段進行擴增。（4）擴增產物的檢測，基於檢測閾值的設定，當病毒載量高時，低循環數即能檢測到熒光信號，當病毒載量低時，高循環數時才能檢測到熒光。循環數與樣品載量成線性關系。利用標准品製作循環數與載量的標准曲線就能對樣品載量進行定量檢測。 使用集合核酸擴增檢測技術和方法，利用核酸檢測方法的高度敏感性，對高度懷疑感染人群且抗體陰性的樣品進行集合核酸檢測，可及時發現窗口期感染者。該方法較單份樣品的核酸檢測具有更高的成本效益。
3.1 樣品集合程序
3.1.1 根據預處理樣品量，計算預形成一級和二級集合數量，在登記表格上記錄一級和二級集合及對應的原始樣品編號。
3.1.2 吸取130mL樣品，移入標記二級集合的離心管中；10份樣品形成一個1300mL的二級集合樣品，充分渦旋震盪混勻。
3.1.3 從5個二級集合管中分別吸取210mL樣品，移入標記有一級集合的離心管中，形成由50份樣品1050mL體積組成的一級集合樣品，充分渦旋震盪混勻。
3.1.4 從每個一、二級集合管中吸取500mL集合樣品，分裝至另一相應標記的離心管，用超敏感核酸檢測試劑進行檢測。
3.1.5 制備陰性集合外部質控品：使用50份HIV抗體和核酸陰性樣品，按上述步驟，分別集合成5個陰性二級集合外部質控品和1個一級集合外部質控品。
3.1.6 制備陽性集合外部質控品：從9份HIV抗體和核酸陰性樣品和一份至少含有HIV RNA10c/ml陽性樣品中，分別移取130mL加入離心管中，形成一個1300mL的陽性二級集合外部質控品。再分別從4個已制備好的陰性二級集合外部質控品和上述陽性二級集合外部質控品中，移取210mL至標記為一級陽性集合外部質控品的離心管中，形成一級陽性集合外部質控品。
3.1.7 一級和二級陰、陽性集合外部質控品分別用於RT-PCR中每一輪一級和二級集合樣品的檢測。
3.2 集合樣品的檢測和分解路線
使用商品化核酸檢測試劑，應嚴格按照試劑說明書操作。按照各商品化核酸試劑集合PCR的方案進行檢測，集合樣品的數量根據各試劑方案操作。方法簡述如下：
3.2.1 用HIV RNA RT-PCR超敏檢測方法對一級集合樣品進行檢測，陽性反應的一級集合樣品進入下一檢測步驟。
3.2.2 用HIV RNA RT-PCR超敏檢測方法對所有組成陽性一級集合的二級集合樣品進行檢測，陽性反應的二級集合樣品進入下一檢測步驟。
3.2.3 用HIV RNA RT-PCR標准檢測方法檢測所有組成陽性二級集合樣品的的10份單個樣品，確定核酸陽性的單個樣品。 HIV感染產婦所生嬰幼兒在出生後18個月內可應用HIV核酸（DNA或RNA）檢測進行早期HIV感染診斷。盡管HIV RNA檢測敏感性在感染早期較高（出生後1個月內），但是HIV DNA檢測不受母親圍產期抗逆轉錄病毒治療和人乳汁中抗逆轉錄病毒葯物以及嬰幼兒預防性抗逆轉錄病毒治療的干擾而影響早期診斷。另外，考慮母親血液污染因素，不推薦使用臍帶血進行HIV核酸檢測。嬰幼兒的抗體檢測流程和結果判斷見第二章（HIV抗體檢測）。
4.1 適用范圍
未滿18個月的HIV感染產婦所生嬰幼兒；未滿18個月的嬰幼兒，其母親HIV感染狀態不詳，兒童出現HIV相關臨床表現，臨床懷疑HIV感染者。
4.2 檢測程序及結果報告
4.2.1 於嬰兒出生後6周（42天）採集第一份血樣本（血樣本可制備成DBS或EDTA抗凝全血），送檢。
4.2.2 若第一份血樣本檢測呈陽性反應，盡快再次採集第二份血樣本進行檢測。若兩份血樣本檢測均呈陽性反應，報告「嬰兒HIV感染早期診斷檢測結果陽性」，診斷兒童HIV感染。及時對HIV感染兒童進行追蹤和病情監測，將其轉介到兒童抗病毒治療醫療服務機構，並為其提供機會性感染預防等服務措施；若第二份血樣本檢測呈陰性反應，待嬰兒滿3個月再次採集血樣本進行檢測。若第一份血樣本檢測呈陰性反應，繼續提供兒童保健和隨訪服務，待嬰兒滿3個月再次採集血樣本進行檢測。
4.2.3 若嬰兒滿3個月再次檢測呈陰性反應，報告「嬰兒HIV感染早期診斷檢測結果陰性」，按照未感染兒童處理，繼續提供兒童保健隨訪服務；於兒童滿12個月時，按照「HIV感染產婦所生兒童HIV抗體檢測流程」（圖4），開始HIV抗體檢測，最終確定兒童感染狀態。若嬰兒滿3個月再次檢測呈陽性反應，盡快再次採集血樣本進行檢測。第三份血樣本檢測呈陽性反應，報告「嬰兒HIV感染早期診斷檢測結果陽性」；若第三份血樣本檢測呈陰性反應，報告「嬰兒HIV感染早期診斷檢測結果陰性」；分別按照前述流程提供相應服務。
4.2.4 不同時間「嬰兒HIV感染早期診斷」檢測均呈陰性反應的喂哺母乳的兒童，應在完全停止喂哺母乳後的6周和3個月（若6周時檢測結果為陽性可盡快）再次采血進行核酸定性檢測，進行早期診斷。兒童滿18個月後則可直接進行抗體檢測。
4.2.5 如果嬰兒第一次采血時已滿3個月，但未滿12個月，則應盡快在不同時間採集兩份血樣本；同時將兩份血樣本送檢，按照前述流程進行檢測。如果兒童第一次采血時已滿12個月，則應首先按照「艾滋病感染產婦所生兒童HIV抗體檢測流程」（ 圖4）進行HIV抗體檢測。若兩種不同原理或廠家生產的HIV抗體檢測試劑檢測結果均為陰性，則排除兒童感染；若HIV抗體檢測試劑檢測結果呈陽性反應，不能通過抗體檢測確定兒童感染狀態，則可在不同時間採集兩份血樣本，按照前述流程進行「嬰兒HIV感染早期診斷」檢測。如果兒童第一次采血時已滿18個月，則應按照HIV抗體檢測流程（圖1）進行HIV抗體檢測，無需進行「嬰兒HIV感染早期診斷」檢測。

㈣ pcr擴增產物分析的方法有免疫印跡嗎

PCR擴增產物的分析方法微孔板夾心雜交法顏色互補分析法PCR-ELISA法PCR-OLA法PCR-打點雜交法微孔板夾心雜交法：該法是通過一固定於微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特 異雜交使產物的間接地固定於微孔板上，然後，再用一生物素 等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一特異性較一次 雜交，漂洗後顯色即可判斷結果。該法需要兩個雜交過程來檢測 一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用於HBV 的檢測，其敏感度可達5個HBVDNA分子。此法的敏感性和特異性與 PCR32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡 便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應類似於臨床常 規應用的ELISA，適於臨床實驗室常規應用。另一種微孔板雜交法不 是採用夾心法，而是直接將特異探針固定微孔板上，然後用生物素 標記的PCR產物雜交。微孔板雜交與膜印跡雜交相比，有如下優點： ①前者易操作；②固相微孔板漂洗時間短，節省了檢測時間，因為 膜雜交過程中，反應劑要浸透膜中，漂洗時，使反應劑全部浸出需 要時間較長；③本底低，微孔板雜交不需Dehatdt液和預雜交以及封 閉過程。另外，微孔板固定的DNA不需再加熱或UV照射。微孔板雜交的基本過程包括L：DNA的固定，探針的雜交和酶聯顯色。DNA的固定在一定鹽濃度條件下，DNA單鏈的一端可固定在微孔板上。不同來源 的微孔板固定DNA時所需鹽濃度不同。因此，必須用一系列的鹽濃度 （0.15mol/L至3.0mol/LNaCl）來固定加熱變性的核酸，然後，用固 定濃度的標記探針雜交。顯色後，判斷合適的固定鹽濃度。固定方 法的選擇必須使DNA最大量的固定，且不影響雜交。用合適濃度的 NaCl或(NH4)2SO4可達到此目的。硫氰酸鈉則無固定作用。鹽濃度合 適時，DNA應為一端固定到微孔板上，而太低或太高濃度的鹽可能使 DNA「平躺」固定在孔內而影響雜交。Mg2+雖有促進DNA固定的作 用，但它可激活Dnase，所以，一般不用。被固定的DNA應大於300bp， 否則影響雜交結果。每孔可固定高達200ng(624bp)的DNA。合適的鹽 濃和固定量一經確定，可按下法固定DNA。
待固定DNA100℃加熱5min變性並立即冷卻。與合適的固定液混合後，加入微孔板的孔內。固定液：10mmol/L磷 酸鈉-10mmol/LEDTA，pH7.0，合適濃度的NaCl（與DNA變性混合後， 終濃度為最適固定濃度）。用膠布封好，浸於37℃水浴2h。用PBS-0.05%Tween20漂洗3次。立即用於雜交，或封閉於塑料袋內保存。雜交可採用標準的雜交系統雜交。夾心雜交時，是將變性的PCR產物與檢 測探針一並加。雜交與漂洗時間均較一般膜雜交短。顯色根據不同酶標檢測分子的不同選擇不同的底物、終止劑和測定波 長。顏色互補分析法(A)顏色互補分析法是利用三原色原理，當不同DNA片段（A和B）同時擴增時，用引 物5』端修飾技術將不同引物用不同顏色熒光素標記（A片段引物標記綠色的熒 光素，B標記紅色的羅丹明）。如果僅有一條片段被擴增，擴增產物激發後，只有 一種顏色（紅色或綠色）。如果兩條不同大小的片段均被擴增，可通過電泳分離，紫 外激發後可觀察到不同顏色的兩條帶。如果兩條被擴增片段大小相同，電泳後可見一 條紅綠互補色-黃色帶。如果不用電泳法分離擴增片段，通過一定手段除未摻入引 物，亦可觀察到擴增產物的顏色。此時，擴增產物無論大小，只要均被擴增，就可見 一條紅綠互補的黃色條帶。該法簡便、易於自動化，可用於檢測基因，缺失、染色體轉位和病原微生物。這種情 況下，只需判斷產物的有無。另外，在檢測多種基因實變、多種病原菌和HLA分型 時，可用復合PCR。此時，不同引物可用不同熒光素標記（如綠色的ROX；藍色的COUM 等）。PCR-ELISA法：(A)本法避免了電泳和雜交的步驟，適於常規ELISA記數儀檢測。因為5』端修飾後仍 可進行常規PCR擴增特異靶序列，因此，可以通過修飾其中一個引物的5』端使其攜帶 便於PCR產物固定的功能基團，而通過另一引物5』端的修飾使產物便於檢測。鏈霉親和素的包被：不同廠家的聚丙乙烯微孔板的包被效果差異並不顯著。親和層析純化的鏈霉親和素（13U/mg，Sigma公司）用PBS-Tween液140mmol/LNaCl， 2.7mmol/LKCl，4.3mmol/LNa2HPO4，1.4mmol/LK2HPO4，0.05%(w/v)Tween20，Ph7.2 配成1μg/ml。向微孔板的每孔內加入100μl，封好，室溫過夜。 用PBS液漂洗。
擴增產物與包被板的結合：PCR產物1μl用50μ1PBS-Tween液稀釋後加入包被孔內。室溫下作用30min。 用PBS-Tween液漂洗6次，去除未摻入的熒光引物。 ELISA：向結合有PCR產物的孔內加入50μlPBS-Tween液稀釋的HRP-抗FITC抗體，室溫下作用 30min。用PBS-Tween漂洗6次。將1mgTMB溶於1ml二甲基亞碸中，用50mmol/L醋酸鈉-檸檬酸液（Ph4.9）稀釋10倍， 向每孔內加入30%（v/v）H2O23μl，再加入80μlTMB液，使反應在室溫下進行2～5min ，再加入80μl2mol/L硫酸終止反應。於ELISA計數儀上450nm測定OD值。另外，引物的修飾除用圖2-3所示的生物素和FITC外，還可用DNA結合蛋白質的結合位 點和生物素修飾，將DNA結合蛋白質（GCN5或TyrR）包被在微孔板內，與PCR產物結合 後，可加入酶標親和素進行ELISA檢測。PCR-ELISA法可用於PCR產物定量分析。需注 意的是，定量分析時，PCR要在對數期內終止，並需設立已知標准對照。PCR-OLA法(A)研究表明、不同個體中同源DNA片段序列間的差異大部分是限定於單個核苷酸的位 置。已弄清的人遺傳病的40個基因結構變異中，絕大部分屬鹼基替換，同樣，作為遺 傳連鎖分析標記的大部分序列變異主要是位於基因組的非編碼區的點突變。所以，一 般基因檢測技術的一個重要要求是能很容易地檢出單一核苷酸變異。寡核苷酸連接試 驗（OLA）就是為此目的而設計的。它可以單獨或結合PCR快速確定緊密相關的DNA序 列。OLA是通過設計兩種能與靶序列DNA精確並列雜交的寡核苷酸完成的。寡核酸雜交 後，DNA連接酶可使其正常配對的相鄰鹼基共價連接，而錯配的相鄰鹼基可通過調節 連接酶和NaCl濃度防止其連接，連接產物可通過凝膠電泳觀察其大小，或通過5』端 修飾技術使一個寡核苷酸5』端帶有一個配基。連接後，通過固相化的親和配基使其 固定，漂洗後，檢測另一寡核苷酸3』端攜帶的適當標記分子。這一過程如重復進行 多個循環，則連接產物會呈線性增加，故稱這循環進行的OLA為連接檢測反應（LDR）。 此反應中若再加入兩種與上述寡核苷酸互補的寡核苷酸互補的寡核苷酸進行循環的連 接反應，則稱之為連接酶鏈反應。兩寡核苷酸在無靶序列的情況下，在非常接近的位 置發生雜交的可能性極小，因此，OLA技術的假陽性極少。另外，連接酶所形成的鍵 是連接產物。該法適於簡單、標准化的基因組樣品處理法，或直接用表面活性劑和蛋 白酶初步處理有核細胞作為檢測樣品。需指出的是，這里是以放射性標記檢測分子為 例的。如圖2-6中的地高辛標記分子可避免放射性同位素的缺點，且敏感性相當，更 易於自動化。
寡核苷酸的設計與標記：用於OLA的寡核苷酸一般為20mer，使被檢變異核苷酸位於 即將連接的兩個寡核苷酸接頭的5』端。即位於圖2-6中第2步左側寡核苷酸的3』端。 左側寡核苷酸是5』標記生物素。右側寡核苷酸5』端需磷酸化才能與左側寡核苷酸的 3』-OH相連接。用PNK酶處理很易使其5』或3』標記可以選擇其它標記物（如熒光素 等）。OLA反應：向一軟質圓底微滴定板內依次加入：3μlPCR擴增DNA產物；1μl剪切的鮭精DNA(10μg /μl);1μl0.5mol/LNaCl混勻室溫作用10min。加入1μl0.5mol/LHCl，混勻。加入1μl生物素標記探針水溶液（140fmol）和1μl32P探針（1.4fmol），2μlT4連 接(約0.1WeiSS單位，用5×連接緩沖液稀釋)。5X連接緩沖液：250mmol/LTris-HCl， Ph7.5;500mmol/LNaCl;500mmol/LMgCl2;25mmol./LDTT;5mmol/LATTP;500μg/μlBSA。 不同寡核苷酸與底物反應的連接所需酶液度不同，OLA試驗時，一定要小心滴定最適 酶濃度，提高連接溫度（50℃）可擴加OLA的特異性。混勻，在100%濕度下於37℃作用1h。加入1μl1mol/LNaOH，混勻，室溫下作用10min。加入1μl1mol/LHCl中和。加入2μl10%SDS，3μl15%（w/v）鏈霉親和素包被的瓊脂糖懸液，混勻後室溫作用 10min。將一事先用0.5%奶粉-0.1%SDS-100μg/ml蛙精DNA煮過的Whatman4號濾膜置於點樣器 上，然後，將微孔板內混合液加入點樣孔內，真空抽濾點膜。再用數毫升1%SDS和 0.1mol/LNaOH分別依次抽洗膜。取下膜，用塑料保鮮包好進行放射自顯影。打點雜交當擴增產物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過 程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再 用放射性或非放射性標記的探針雜交。點雜交還有助於檢測突變 DNA的突變類型，用於人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同 位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性 均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關系起了很大的作 用。但是，由於同位素不穩定和放射性危害，不能常規用於臨床或 法醫檢驗。因而用非放射性物質（生物素、和地高辛等）標記的寡 核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的 方法。非放射性標記物質穩定性高、使用方便、安全、檢測速度 快。因此，本節僅敘述非放射性標記探針的點雜交與檢測情況。
膜的制備：點雜交膜的制備有兩種方法，一是將擴增產物直接固定於膜上，每 一個探針制備1張膜。然後，用不同的等位基因特異或某一微生物特 異探針在嚴格條件下雜交來檢測擴增產物的突變類型或鑒定病原 菌；另一種方法是將不同的探針固定到尼龍膜上，然後，用標記的 PCR產物作探針去雜交。這樣，根據雜交點的位置即可判斷產物序列 變異的種類。顯然，前一方法較後一方法繁瑣，費時，費力；而後 一方法僅需一次雜交即可判斷結果。產物的固定：⑴取1張帶正電荷的尼龍膜，按點樣器的 大小裁剪膜，並做好標記。⑵將膜浸入水中濕透至少 1min。⑶變性PCR產物：此步可在圓底微孔板或微量離 心管內操作。每點的變性方法為；5～20μl(50～100ng)PCR 產物與100μl變性液（0.4mol/LNaOH-25mmol/LEDAT） 混勻，室溫作用5min即可。⑷小心將預濕的膜裝在點 樣器上，注意膜與點樣器接觸表面不能有任何氣泡。 因氣泡會使點樣點呈環形或月牙形或樣品間彌散融 合。膜固定後，每孔內加100μl變性混合液，打開真空泵。⑸抽干變性液後，每孔內再加100μlTE緩沖 液，真空抽濾「洗滌」樣品。⑹取下膜，置於厚3mm濾 紙上漬干。重復制備用於其它基因探針的膜時，一定要認真清洗點樣器，以免樣品間的交叉污染。⑺漬干 的膜於80℃真空干烤1h或於254nmUV光源下以60～120mJ/cm2 的強度下照射使DNA固定在膜上。此時，的膜可直接用 於雜交，也可以用濾紙包好存於塑料袋或乾燥缸內。探針的固定：因寡核苷酸的探針太短，在膜上固定較 困難，即使固定上，也會影響雜交。這就是需要將寡 核苷酸探針用末端轉移酶加polydT尾後，UV線照射固 定。因為UV可激活胸腺嘧啶，使其與尼龍膜上的氨基共價結合，使探針間接地牢固地固定在尼龍膜上。這 種加尾固定的探針不影響雜交。但這種雜交對固定探針的要求是，在同一條件下與PCR產物的雜交必須是特 異的。通過選擇探針的合適長度，G+C含量或通過改變 探針的固定可達到特異性的要求。這種固定的探針可 用於檢測人類基因的突變，也可用來檢測病原微生 物。
(1)加尾反應是用脫氧核糖核酸末端轉移酶（TDT）催化，它可將dT依次加在寡核苷酸的3』端，在四種脫氧 核苷中，以dT加尾效果最好。通過改變dT濃度和TdT量 可調節加尾長度，在下述反應條件下，加尾長度可達 400個dT。①向一微量離心管中依次加入：寡核苷酸探 針，100～200pmol;10×TdT緩沖液(1mol/L二甲胂酸鉀; 250mmol/LTris-HCl，Ph7.6;10mmol/LCoCl2;2mmol/LDTT) 10μl;dTTP80～110nmol；TdT，60～80U；補水至100μl。 ②混勻後，稍加離心，置37℃水浴60～90min。③加入 100μl10mmol/LEDTA終止反應。加尾長度可通過10%聚 丙烯醯胺凝膠電泳監測。(2)點膜：①加尾探針6pmol，用0.3mol/LNaOH室溫處理5min，然後，用2.5mol/LNH4Oac中和。②加入等體 積6×SSC(1×SSC:0.15mol/LNaCl，0.015mol/L檸檬酸三 鈉pH7.0)。③將6×SSC預濕的尼龍膜（zeta-probe）或 hybond-N固定在點樣器上。④點樣方法同上。(3)固定：①小心取下膜，置於TE緩沖液飽和的4～6 濾紙上，DNA面朝上。②將濾紙和膜一起置於254nmUV 燈下照射固定，poly(dT)400尾的探針在40mJ/cm2r的 劑下固定效果最好。輻射劑與給定光源對給定面積的 能量釋放率（輻照度）和輻照時間有關。一般對一個 固定光源而言，輻照劑量為：輻照劑量（J/cm2）=輻照度（w/m2）×輻照時間(s)其中，J為輻照能量單位；w為輻照通量單位。輻照度 與照射角度有關，與入射角度θ的餘弦（cosθ）呈正 相關。③固定後，在100ml6×SSC-0.5%SDS液中於42～55℃ 漂洗30min左右。漂洗後可立即用於雜交，也可以在蒸溜水中浸洗，晾乾後室溫保存。
探針的固定量與加尾長度均影響雜交結果。如用poly (dT)400尾的不同固定量的探針與等PCR產物（2.33fmol） 雜交，固定6pmol苷酸雜交時，有29.2%的PCR產物與 1.1%的寡核而固定的探針600fmol雜交時，僅有2.2%的產 物與0.8%。用不同加尾長度的等量產物6pmol固定寡核苷酸與（時，僅0.33%233fmol）雜交結果表明， poly(dT)300探針與產物雜交；而有1.3%的探針poly (dT)400時，則與產物雜交。因此，固定的探針加最好 在400個以dT尾上，固定量也至少6pmol。雜交寡核苷酸探針的雜交：每一寡核苷酸探針均有自己的雜交溫度和漂 洗條件，主要取決於探針的Tm值。Tm值則受探針長度，G+C含量和雜 交液的鹽渡影響。一般要由如下公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)來計算Tm 值。在1mol/L鹽濃時，雜交溫度可比預測的寡核苷酸Tm值低5～20℃。 提高雜交溫度和降低鹽濃度可提高雜交的嚴格性。漂洗液一般不含 鹽，漂洗溫度比雜交溫度低5℃。一旦確定了探針的雜交與漂洗條 件，可按下述方法進行雜交。⑴在（2×SSPE3.6mol/LNaCl：; 200mmol/LNaH2PO4;20mmol/LEDTA，Ph7.4）液中預濕點樣膜。⑵置 膜於塑料封口袋中，並加入適量雜交液（SSPE，5×Denhardt液， 0.5%TritonX-100），封口。袋內不要有氣泡。⑶置於水浴加熱搖 動，在雜交溫度下預雜交5min。⑷取出塑料袋，剪開一角。加入非 放射性標記物（如生物素-補骨脂素）標記的探針。每毫升雜交中加 入1pmol探針。封口後搖育20～60min。雜交時間不能太長，否則會 引起探針與膜的不可逆結合。⑸從袋中取出膜，室溫下在漂洗液 （SSPE-0.1%TritonX-100）中洗1～2次。⑹漂洗溫度下預熱的漂洗 液在合適溫度下洗10min。漂洗後的膜可用於顯色檢測。
反向點雜交：反向點雜交即擴增產物作為相中的探針與固定到膜上 的寡核苷酸雜交。如前述，這種雜交最基本的要求就是在同一條件 下，所有固定探針均與擴增產物特異雜較。為此，主要是認真選擇 與設計寡核苷酸探針，使各探針在同一條件下Tm值相近。在同一雜 交特異。一旦確定了合適的雜交和漂洗條件，即可按上述基本程度雜交。只是雜交探針（產物）在加入前應加熱變性或用等體積的 400mmol/LNaOH-10mmol/LEDTA變性。雜交時間（2～4h）要長些。PCR 產物的標記可以用標記引物擴增或在擴增時摻入標記物。雜交的檢測不同非放射性標記物的檢測原則上基本相同。若為酶標探針則可直接進行顯色檢測。下面以生物素標記物為例加以說明。酶標親和素的結合 ⑴漂洗後的膜在緩沖液A（PBS，100mmol/LNaCl，5%TritonX-100） 中與一定濃度的HRP-標記鏈霉親和素在室溫作用10min，並輕輕振 盪。⑵用緩沖液B（液A，1mol/L尿素，1%硫酸葡聚糖）在室溫下漂 洗5min，並輕輕振盪，將膜上非特異吸附的HRP-鏈霉親和素洗掉。顯色不同酶標親和素的顯色條件與底物均不同，下面以HRP的顯色加以說 明。⑴將上述膜於緩沖液C（100mmol/L檸檬酸鈉，pH5.0）中在室溫下作 用5min，並輕輕振盪。⑵在緩沖液D中室溫下，輕輕振盪10min。此步應避強光。緩沖液D： 1份底物（TMB：2mg/ml，用無水乙醇配製）和19份緩沖液C。⑶在緩沖液E中顯色，該液應現用現配。應避強光。緩沖液E：2000 份緩沖液D和1份3%H2O2。顯色時間取決於雜交體中含標記物的量； 一般為1～15min即可。雜交陽性呈深藍紫色。⑷當膜色（信/噪比）合適時，在液C中洗膜1h終止反應，在此過程 中應更換2～3次液體。⑸雜交膜可拍照記錄結果，也可封於緩沖液C避光條件下貯存。膜的再利用⑴脫色：將膜置於0.18%Na2SO4液中即可脫掉膜上的顏色。 ⑵去雜交的探針：將膜置於水-0.5%SDS中，65℃加熱1h。 ⑶這種處理的膜可再與另一種探針雜交。
問題與對策信號弱：①點膜的產物少-增加點膜量；②雜交時探針濃度低-加大 探針濃度；③雜交漂洗過於嚴格-增加鹽濃度或降低雜交溫度；④TMB 液貯存時間過長（TMB液4℃可存2個月）-重新配製。本底信號強：①雜交時探針濃度高-降低探針濃度；②雜交時間長- 縮短雜交時間；③雜交漂洗不嚴格-降低鹽濃度和提高雜交溫度；④ 顯色時間長-縮短顯色時間。雜交膜的高本底著色：①同②；②在緩沖液C中洗膜時間短-延長漂 洗時間（過多的硫酸葡聚糖也能增加膜的本底著色；③同2④；④避 光不嚴格-顯色過程中及顯色後要確保雜交膜的避光。陰性對照出現陽性信號：①點樣混淆，即把陽性標本點於陰性對照 的位置，重復實驗即可糾正；②PCR較物的殘留污染，用新配的試劑 重復全部擴增反應。（我自己加進的：Hybond—N+：Hybond-N+是帶正電尼龍膜，對在鹼性條件下雜交和普通的Southern雜交均有很好的靈敏性，故核酸樣品可通過簡單的鹼處理固定在膜上，而不必在紫外燈下固定，盡管紫外固定的重復性最好。）
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PCR擴增產物的分析方法
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PCR擴增產物的分析方法
微孔板夾心雜交法
顏色互補分析法
PCR-ELISA法
PCR-OLA法
PCR-打點雜交法
微孔板夾心雜交法：
該法是通過一固定於微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特 異雜交使產物的間接地固定於微孔板上，然後，再用一生物素 等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一特異性較一次 雜交，漂洗後顯色即可判斷結果。該法需要兩個雜交過程來檢測 一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用於HBV 的檢測，其敏感度可達5個HBVDNA分子。此法的敏感性和特異性與 PCR32P探針的

㈤ 微生物的傳統檢測方法有哪些

傳統檢測有三種方法

1、直接顯微鏡觀察，正常情況，在一定的培養條件下（相同的培養基、溫度以及培養時間），同種微生物表現出穩定的菌落特徵。可以通過顯微鏡觀察菌落特徵對微生物種類進行判斷。

2、選擇培養基培養微生物或人為提供有利於目的菌株生長的條件，選擇培養基，其作用是允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他微生物生長。選擇培養一般是通過觀察微生物的同化作用類型或某一特徵進行間接判斷，得到的微生物往往並不只有一種，但是能夠大致確定這些微生物存在的共有特徵從而對其分類。

3、鑒別培養基，根據微生物的代謝特點，在培養基中加入某種指示劑或化學葯品。與選擇培養相比，鑒別培養基的鑒別所得結果的范圍比較小，一般可直接測定某微生物的種類。

㈥ 病原微生物中細菌常見檢測方法有哪些

1、快速測試片技術法

快速測試片是指以紙片、紙膜、膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在上面，通過微生物在上面的生長、顯色來測定食品中微生物的方法。

細菌總數檢測紙片的研製始於 20 世紀 80 年代，其主要優點是簡便、實用、經濟、操作性強。近年來以濾紙和美國某公司的 Petrifilm 為載體的測試片已開始被廣泛應用。

2、生物電化學方法

生物電化學方法是指通過電極測定微生物產生或消耗的電荷，從而提供分析信號的方法。微生物在滋生代謝過程中，培養基的電化學性質如電流、電位、電阻和電導等會發生變化，所以可以通過檢測分析這些電化學參量的變化來實現對微生物的快速測定。

常見的有：阻抗分析法、電位分析法、電流分析法等。生物電化學方法具有測量快速、直觀、操作簡單、測量設備成本低和信號的可控性等特點。

3、微菌落技術

微菌落是指細菌生長繁殖早期在固相載體上所形成的只能藉助於顯微鏡觀察的微小菌落。微菌落技術具有快速、經濟、實用的特點，其研究始於 20 世紀50年代，定量測定技術從 20 世紀 70 年代開始，國外已有報道將該法應用於水、食品中細菌總數的快速檢測。

4、氣相色譜法

氣相色譜應用到微生物的檢測中，主要是依據不同微生物的化學組成或其產生的代謝產物各異，利用上述色譜檢測可直接分析各種體液中的細菌代謝產物、細胞中的脂肪酸、蛋白質、氨基酸、多肽、多糖等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

5、高效液相色譜法

利用高效液相色譜檢測可分析各種體液中的細菌代謝產物、病原微生物等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

㈦ 微生物生長的幾種檢測方法

一、生長量測定法

1.1體積測量法：又稱測菌絲濃度法。

通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間（如5分鍾）和轉速（如5000rpm），離心後，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。

1.2稱乾重法：

可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，並用清水離心洗滌1-5次，進行乾燥。乾燥可用烘箱在105℃或100℃下烘乾，或採用紅外線烘乾，也可在80℃或40℃下真空乾燥，乾燥後稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾後用少量水洗滌，在40℃下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常採用這種方法，如活性乾酵母（activitydryyeast,ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

1.3比濁法：

微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600nm處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.Coli的生長及誘導時間。

1.4菌絲長度測量法：

對於絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度，或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管，到入合適的培養基，卧放，在開口的一端接種微生物，一段時間後記錄其菌絲生長長度，藉此衡量絲狀微生物的生長

二、微生物計數法

2.1血球計數板法:

血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平台，兩嵴的表比兩平台的表面高0.1mm，每個平台上刻有不同規格的格網，中央0.1mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

2.2染色計數法：

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色後在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。

2.3比例計數法：

將已知顆粒（如黴菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標准。

2.4液體稀釋法：

對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15隻裝培養液的試管中，經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然後查最大或然數表MPN（mostprobablynumber）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

2.5平板菌落計數法：

這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定

體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液塗布於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養後，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。

2.6試劑紙法：

在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養後在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標准紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷准確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

2.7膜過濾法：

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。

2.8生理指標法：

微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸鹼度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的'生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。

2.9測定含氮量：

大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母為7.5%，黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱後產生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2後即可測出N2的量。

2.10測定含碳量：

將少量（乾重0.2-2.0mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加熱30分鍾後冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標准樣品做標准曲線。

2.11還原糖測定法：

還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生(轉載於:mHg）的條件下才能生長，他們有完整的呼吸鏈，以分子氧為最終氫受體，具有超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶。

兼性厭氧菌:它是以在有氧條件下的生長為主也可兼在厭氧條件下生長的微生物，有時也稱「兼性好氧菌」。

微好氧菌:只能在嬌滴滴額氧分壓（1.33~3.Pa，正常大氣中的氧分壓為0.2bar）下才能正常生長的微生物。

耐氧菌:耐氧性厭氧菌的簡稱，是一類可在分子氧存在下進行發酵性厭氧生活的厭氧菌。

厭氧菌:有一般厭氧菌與嚴格厭氧菌（專性厭氧菌）之分。

超氧陰離子自由基:活性氧的形式之一，因有奇數電子，故帶負電荷；它既有分子性質，又有離子性質；其性質極不穩定，化學反應力極強，在細胞內可破壞各種重要生物大分子和膜結構，還可形成其他活性氧化物，故對生物體極其有害。

超氧化物歧化酶(SOD):保護好氧菌免受超氧化物陰離子自由基的毒害的酶。按SOD分子中所含金屬輔基的不同分三類：1、含Cu、Zn的SOD，存在於幾乎所有真核生物的細胞質中；2、含Fe的SOD，主要存在原核生物中；3、含Mn的SOD，主要存在於真核生物的線粒體中。SOD除可清除超氧陰離子自由基外，還發現在防治人體衰老、治療自身免疫性疾病、抗癌、防白內障、治療放射病和肺氣腫以及解除苯中毒等方面有一系列療效。

PRAS培養基:用嚴格厭氧方法配置、分裝、滅菌後的厭氧菌培養基，稱為預還原無氧滅菌培養基，即PRAS培養基。

厭氧罐:培養厭氧菌的裝置。

亨蓋特滾管技術:一種集制備高純氮、以氮驅氧和全過程實現無氧操作、無氧培養、無氧檢測於一體，用於研究嚴格厭氧菌的技術和裝置。

厭氧手套箱:一種用於無氧操作和培養嚴格厭氧菌的箱形密閉裝置。

搖瓶培養:一般將三角瓶內培養液的瓶口用8層紗布包紮，以利通氣和防止雜菌污染，同時減少瓶內裝液量，把它放在往復式或旋轉式搖床上作有節奏的震盪，以達到提高溶氧量的目的。

曲:是一類用麩皮、米糠等疏鬆的固體營養料接種、培養微生物而製成的含氧活菌產品。

曲法培養:將麩皮、碎麥或豆餅等固態基質經蒸煮和自然接種後，薄薄地鋪在培養容器表面，使微生物即可獲得充足的氧氣，又有利於散發熱量，對真菌來說，還有利於產生大量孢子。

通風曲:一種機械化程度和生產效率都較高的現代大規模製曲技術，在我國醬油釀造業中廣泛應用。

污染:有害微生物通過氣流、水流、接觸和人工接種等方式，傳播到合適的基質或生物對象上而造成種種危害。

巴氏消毒法:有發過微生物學家巴斯德用於果酒消毒，故名。這是一種專用於牛奶、啤酒、果酒或醬油等不宜進行高溫滅菌的也太風味食品或調料的低溫消毒方法（一般在60-85度下處理30min至15s）。有兩種方法：1、低溫維持法；2、高溫瞬時法。

間歇滅菌法:適用於不耐熱的培養基滅菌。方法是：講帶滅菌的培養基放在80-100度下蒸煮15-60min，以殺滅其中所有的微生物營養體，然後放至室溫37度下保溫過

夜，誘使其中殘存的芽孢發芽，第二天再以同樣方法蒸煮和保溫過夜，如此重復3天即可在較低的滅菌溫度下同樣達到徹底滅菌的效果。

連續加壓蒸氣滅菌法:讓培養基在管道的流動過程中快速升溫、維持和冷卻，然後流進發酵罐。

梅拉特反應:高溫滅菌時，培養基中得氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白質）的游離氨基與羧基化合物（糖類）的羰基間發生復雜的化學反應，導致培養基褐變同時，還降低了有關營養物成分，故應設法避免。

石炭酸系數:一定時期內，被試葯劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度與達到同效果的石炭酸的最高稀釋度之比。

抗生素:一類有微生物或其他生物生命活動過程中合成的此生代謝產物或其人工衍生物，他們在很低濃度時就能一直或干擾他種生物的生命活力，因而可用作有兩的化學治療劑。

抗代謝葯物:一類在化學結構上與細胞內必要代謝物的結構相似，並可干擾正常代謝活動的化學物質。3種作用：1、與正常代謝物一起共同競爭酶的活性中心，從而使微生物正常代謝所需要的重要物質無法正常合成，例如磺胺類；2、「假冒」正常代謝物，使微生物合成出無法正常生理活動的假產物，如8-重氮鳥嘌呤取代鳥嘌呤而合成的核苷酸就會產生無正常功能的RNA；3、某些抗代謝葯物與某一生化合成途徑的終產物結構類似，可通過反饋調節破壞正常代謝調節機制，例如，6-巰基腺嘌呤可抑制腺嘌呤核苷酸的合成。

選擇毒力:大於病原菌具高度毒力而對其宿主基本無毒的化學物質來抑制宿主體內病源微生物的生長繁殖，藉以達到治療該宿主傳染病的一種措施。