飼料中vc檢測方法

1. 怎樣測定果實中的維生素C（2，6-二氯靛酚滴定法）

答：維生素C又稱抗壞血酸，它在動植物的新陳代謝方面起著重要作用，因為它是調節植物體細胞氧化還原過程的重要因子之一，缺乏時有機體的新陳代謝就會遭到破壞。維生素C是果實中特有的，並且有的果實中含量很高。如100克獼猴桃鮮果中高達700～1100毫克，100克鮮棗中約有350～600毫克；而柑橘僅含有55～66毫克，蘋果5～48毫克，梨3～17毫克。通常情況下，隨著果實的成熟，維生素C的含量達到最高。但是一採收，活性很快降低，貯藏過程中下降更快，不耐貯藏的品種更為明顯。冷藏使維生素C的破壞更嚴重。由於維生素C極易氧化，因此它的測定應在當天進行。
（1）方法原理
抗壞血酸（Vc）結構中有烯二醇結構存在，因此具有還原性，能將藍色染料2，6-二氯靛酚還原為無色的化合物，Vc則被氧化為脫氫Vc。2，6-二氯靛酚具有酸鹼指示及氧化還原指示的兩種特性；其在鹼性介質中呈深藍色，而在酸性介質中呈淺紅色（變色范圍pH4～5），其於氧化態時呈深藍色（鹼性介質中）或淺紅色（酸性介質中），還原態時為無色。據此特性，用藍色染料鹼性的標准溶液滴定果實樣品酸性浸出液中Vc到剛變淺紅色為終點，用染料的用量即可計算Vc的含量。滴定終點的紅色是剛過量的未被還原的（氧化型）染料溶液在酸性介質中的顏色。
通常測定Vc的浸提和滴定都是在2%草酸溶液中進行的，目的是保持反應時一定的酸度，避免Vc在pH高時易被氧化。此染料不致氧化待測液中非Vc的還原性物質，所以對Vc測定有較好的選擇性。
（2）試劑配製
①2%草酸溶液：稱取20克草酸（化學純）溶於水中，稀釋至1000毫升，貯於避光處。
②6%碘化鉀（KI）溶液。
③1%澱粉指示劑。
④0.001摩爾/升碘酸鉀（KIO3）溶液：稱取1.784克在105℃下烘過24小時的碘酸鉀（優級純）溶於水，定容至500毫升，此為0.1000摩爾/升碘酸鉀標准溶液。使用時將此貯備標准液用煮沸並冷卻的水稀釋100倍，即成0.001摩爾/升的KIO3標准液。大約每星期應重新配製一次。
⑤Vc標准溶液：稱取20.0毫克Vc（分析純），溶於2%草酸溶液，並用2%草酸溶液稀釋至100毫升，此液約含Vc0.2毫克/毫升，置於冰箱中保存。臨用前當天進行標定。
Vc的標定：吸取Vc液5毫升於50毫升三角瓶中，加入2%草酸溶液10毫升，6%KI溶液0.5毫升，1%澱粉溶液5滴，用0.001摩爾/升 KIO3標准液滴定至溶液突變為淺藍色為止（應耗用0.001摩爾/升 KIO3標准液約為11毫升），計算Vc的准確濃度：
Vc溶液的濃度（毫克/毫升）＝N×V1×88/V2
式中：N——所用KIO3標准溶液的摩爾濃度；
V1——所用KIO3溶液的量（毫升）；
V2——所用Vc 溶液的量（毫升）；
88——Vc的毫摩爾質量（毫克）。
⑥2，6-二氯靛酚溶液：稱取50毫克2，6-二氯靛酚鈉（分析純）溶於約200毫升含有52毫升的NaHCO3（分析純）溫水（＜40℃）中冷卻後加水至250毫升。貯存於棕色瓶中，置於冰箱中保存。使用前待溶液恢復至室溫後，用Vc標液標定其准確濃度，並計算其滴定度。在冰箱中貯存時，每周須標定一次。
標定方法：吸取5毫升已標定的Vc標液（含Vc約1毫克）於50毫升三角瓶中，加入2%草酸溶液10毫升，搖勻，用2，6-二氯靛酚溶液滴定至溶液呈淺紅色，約在15秒內不褪色為止（應用染料溶液約10毫升），計算每毫升染料溶液相當於Vc的毫克數，即滴定度T（應約為0.1毫克Vc/毫升）：
T＝（C×V1）/V2
式中：C——所用Vc標准液的濃度（毫克/毫升）；
V1——所用Vc標准液的量（毫升）；
V2——所用2，6-二氯靛酚標准溶液的量（毫升）。
（3）樣品的測定
①樣品處理：選取新鮮果實樣品10～15個，洗凈擦乾，每個果實取中部縱橫剖面各一薄片，用不銹鋼刀迅速切碎，稱取樣品50.0～100.0克鮮樣，將樣品打成漿狀。處理樣品的過程應在10分鍾內完成，以免還原性Vc在空氣中曝露太久而被氧化。用小燒杯稱取20～40克勻漿狀樣品（實際樣品重為其重的1/2，應含還原性Vc1～5毫克）洗入100毫升容量瓶中，用2%草酸溶液定容（若有泡沫可在定容前加2滴辛醇除去）。過慮，若濾液色深，影響滴定終點的判定時，可加1～2勺白陶土（須測定其對Vc的回收率）脫色，過濾後再滴定。若樣液不易過慮，可用離心機分離。對於色澤較濃的山楂等樣品尚無合適的脫色方法，可用2%草酸稀釋10倍再進行滴定。
對於多汁果實樣品，如葡萄、柑橘等，可以直接壓汁後量取10～20毫升汁液（含Vc1～5克），立即用2%草酸溶液定容至100毫升。對於干樣品，可直接稱取1.0000～4.0000克（含Vc1～5克范圍）放入研缽中，加入2%草酸溶液研磨成漿液，洗入100毫升容量瓶中，用2%草酸溶液定容。含有還原性物質的樣品如含有較多Fe2+，可用8%醋酸溶液代替2%草酸溶液為浸提劑。
②樣品的測定：用吸管吸取以上製取的無色濾液5.00～10.00毫升（使含Vc約0.2～1克范圍），放入50毫升三角瓶中，用棕色半微量滴定管中裝的2，6-二氯靛酚標准溶液滴定至呈淺紅色，約在15秒內不褪色為終點。同時做試劑空白試驗，即取與待測液等量的2%草酸代替樣品液，用2，6-二氯靛酚標准溶液滴定。此空白值通常不得超過0.08～0.10毫升。
（4）結果計算
維生素C（毫克/100克樣品）＝（V-V0）×T×取用量倍數×100/W
式中：V——滴定樣品濾液消耗的2，6-二氯靛酚標准溶液的量（毫升）；
V0——空白試驗所用2，6-二氯靛酚標准溶液的量（毫升）；
T——2，6-二氯靛酚的滴定度，即1毫升此液所相當於還原型抗壞血酸的毫克數；
W——測定時樣液中樣品重量（克）；
取用倍數——樣品定容體積與測定體積之比。
（5）注意事項
①偏磷酸是Vc最佳穩定劑，且具有沉澱蛋白質的作用，但其價格較貴，而且在室溫下放置易轉化為正磷酸鹽，降低對Vc的穩定性，草酸廉價易得，有與偏磷酸相近的穩定性。而醋酸適於浸提含有Fe2+的樣品。
②處理樣品時應先加入草酸，可阻止氧化酶氧化Vc，而增加其在提取液中的穩定性。草酸溶液不應置於日光下，以免產生過氧化物。當有催化劑（如有金屬離子Cu2+）存在時過氧化物能破壞Vc。
③2，6-二氯靛酚呈氧化型時有色，還原型時無色，固體試劑有時含有分解產物，染料溶液長期貯存後也會生成分解產物，從而使滴定終點不敏銳。因此須在使用前檢查。檢查方法：取15毫升染料液加入過量的Vc溶液，若還原後的溶液帶有顏色，表示此染料溶液已不能使用。

2. 水果中維生素c含量的測定方法有幾種

水果中維生素c含量的測定方法有三種，分別為原子吸收分光光度法、紫外可見分光光度法、高效液相色譜法。

1、原子吸收分光光度法
利用原子吸收分光光度法問接測定維生素C的含量，是利用維生素C可以與一些金屬離子發生氧化還原反應，通過測定反應掉的金屬離子的量，進而間接計算出維生素c的含量。

2、紫外-可見分光光度法

利用紫外-可見分光光度法測定維生素C的含量是基於維生素c在紫外光區有特徵吸收，但是因為維生素C結構中具有不飽和鍵，具有還原性，不易穩定存在，直接測定誤差較大。所以在利用紫外分光光度法測定時，維生素標准溶液和待測樣的配製條件非常重要。

3、高效液相色譜法

高效液相色譜法是以液體為流動相，採用高壓輸液系統，將維生素C的溶劑裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而測量出維生素c的含量。

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維生素c含量的測定方法對比：

由於維生素C自身的不穩定，導致了很多方法測定結果誤差較大，所以對維生素C穩定存在條件的探索非常重要。高效液相色譜法因為測定較准確、靈敏度高、選擇性好，有較好的發展前景，是目前發展較快的一種方法。

3. 怎樣測定蔬菜中的維生素C

1.滴定法測定維生素C
1.1測定原理
2，6一二氯靛酚法和碘量法是較常見的滴定測定維生素C的方法。還原型抗壞血酸還原染料2，6一二氯靛酚，該染料在酸性中呈紅色，被還原後紅色消失。還原型抗壞血酸還原2，6一二氯靛酚後，本身被氧化成脫氫抗壞血酸。在沒有雜質干擾時，一定量的樣品提取液還原標准2， 6-二氯靛酚的量與樣品中所含維生素C的量成正比。
碘量法的原理：維生素C包括氧化型、還原型和二酮古樂糖酸三種，當用碘滴定維生素C時，所滴定的碘被維生素C還原為碘離子，隨著滴定過程中維生素C全被氧化，所滴入的碘將以碘分子形式出現。碘分子可以使含指示劑（澱粉）的溶液產生藍色，即為滴定終點。
1.2測定操作
2，6一二氯靛酚法：取適量的樣品可食部，加入100 mL 2%草酸溶液，製成勻漿。取同一樣品勻漿10g，加入1%草酸溶液20 mL，搖勻，用濾紙過濾，取5mL過濾液於錐形瓶中，用2，6一二氯靛酚鈉鹽溶液滴定(1 mL≈0.02 mgVitC)，以淡紅色存在30 s內不褪色為滴定終點。記錄2，6-二氯酚靛酚鈉鹽溶液的消耗量，根據結果計算出樣品中維生素C含量(mg/100 g)。
碘量法：將果蔬洗凈，用紗布拭乾其外部所附著的水分，若樣品清潔可以不必洗。樣品可以先縱切為4~8等份，分別稱取20g可是用食部分，置於研缽中加入2% Hcl 15~10ml，研磨至漿狀，移於 100ml 容量瓶中，用2% HCl 加至刻度線處，混勻，過濾，記錄濾液總體積。樣品液的測定: 在50ml 燒杯中，用移液管注入10% KI 溶液0．5ml，0.5% 的澱粉溶液 2ml，樣品液 5ml，蒸餾水 2.5ml，用0.001N KIO3 液滴定，要一滴滴加入，並時時搖動燒杯，至微藍色不褪色為終點( 一分鍾不褪為止) 。記錄所用 KIO3 液毫升數，計算維生素C含量。
1.3測定方法評價
2，6-二氯酚靛酚滴定法具有簡便、快速、比較准確等優點，適用於許多不同類型樣品的分析。缺點是不能直接測定樣品中的脫氫抗壞血酸及結合抗壞血酸的含量，易受其他還原物質的干擾，如果樣品中含有色素類物質，將給滴定終點的觀察造成困難。碘酸鉀滴定法較便宜，使用碘酸鉀滴定法測定蔬菜中維生素C含量較為簡便易行，而2，6一二氯靛酚法相對復雜。總的來說，滴定法操作簡便、快速，無須特殊儀器，但在測定深色樣品時，准確度和精確度欠佳。
2.熒光法測定維生素C
2.1測定原理
Deutsch和Weeks曾經報道過一種檢測維生素C的熒光分析法(OPDA)，並被指定為維生素C的經典熒光分析法。在該方法中，維生素C先被活性炭(Norit)氧化為脫氫抗壞血酸(DHAA)，DHAA再與熒光底物鄰苯二胺(OPDA)結合生成熒光產物，通過對該熒光產物的檢測實現對維生素C的定量分析。孫振艷等[1]提出了一種新的測定維生素C的熒光分析方法。基於維生素C被Cu2+氧化為DHAA，DHAA進一步與苯甲酸及十六烷基三甲基溴化銨產生熒光協同增敏作用，通過對體系熒光強度的測定進行維生素C的定量分析。
2.2測定操作
熒光分析法(OPDA)的測定方法：稱取一定量樣品，研磨後用水浸泡，取清液加入適量1%草酸溶液，振搖約3min，加入0.2g已處理好的活性炭再充分振搖約3min後過濾，濾液加於兩個25mL比色管再加入5.0mL緩沖溶液,，其中一管加入2.0mL硼酸溶液(即空白)搖勻，放置15min後，兩管均加入鄰苯二胺溶液10mL，避光放置30min待測。樣品熒光強度減去空白熒光強度值即為樣品相對熒光強度值。
孫振艷等的熒光分析法：在25 mL比色管中依次加入0. 6 mL CuSO4溶液，2. 0 mL十六烷基三甲基溴化銨溶液，2. 0 mL苯甲酸溶液，一定體積的維生素C標准溶液，，5. 0 mLNaOH-鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液，用蒸餾水定容，搖勻。在35℃恆溫水浴中加熱30 min，將溶液流水冷卻至室溫，激發波長為308 nm，在發射波長408nm處，測量熒光強度F，以不含維生素C的試劑空白為F0，計算ΔF=F-F。
2.3測定方法評價
熒光分析法測定維生素C具有操作簡單，精密度高，檢出限低等優點，該法可以應用於水果、蔬菜和葯物中維生素C的檢測，適於推廣。
3.光度分析法測定維生素C
3. 1測定原理
2，4-二硝基苯肼法和鉬藍比色法是常見測定維生素C的一種光度分析法。2，4-二硝基苯肼法的原理是總維生素C包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸，樣品中還原型抗壞血酸經活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與2，4-二硝基苯肼作用生成紅色脎，脎的含量與總抗壞血酸含量成正比，進行比色測定。鉬藍比色法是測定果蔬中還原型維生素C含量的一種常用方法，因偏磷酸和鉬酸銨反應生成的磷鉬酸銨經還原型的維生素C還原後生成亮藍色的絡合物，通過分光比色可以測定樣品中還原型維生素C的含量。
3.2測定操作
2，4-二硝基苯肼法：取適量的樣品可食部，加入100 mL 2%草酸溶液，製成勻漿。取勻漿20 g (含1~2 mg抗壞血酸)置入100 mL容量瓶中，用1%草酸溶液定容，混勻後過濾。取25 mL過濾液放入有2 g活性炭的25 mL比色管中，振搖1 min，過濾。然後取10 mL此氧化提取液，加入10 mL 2%硫脲溶液，混勻。按照GB12392-90中呈色反應方法，用分光光度計進行比色，根據結果計算出樣品中抗壞血酸含量。按下式計算樣品中Vc的含量:X=c·Vm×F×1001000。
X—樣品中總抗壞血酸含量，mg/100g；
c—由標准曲線查得或回歸方程算得「樣品氧化液」總抗壞血酸的濃度，μg/mL； V—試樣用1%草酸溶液定容的體積，mL； F—樣品氧化處理過程中稀釋倍數； m—試樣質量，g。
鉬藍比色法：准確稱取 100 g 樣品， 加入草酸－EDTA 溶液， 經搗碎後移入 100 mL 容量瓶，定容，過濾，吸取 2 mL 上清液於 50 mL 容量瓶中，加入 1 mL 的偏磷酸－醋酸溶液，5％的硫酸 2．0 mL，搖勻，加入 4 mL 鉬酸銨，以去離子水定容至 50 mL，20 min 後測定吸光度。
3.3測定方法評價
鉬藍比色法測定果蔬中還原型維生素C含量數據穩定性、准確性較好，是一種快速、准確、靈敏度高的測定方法，而且不受樣液顏色的影響。2，4-二硝基苯肼比色法測定總VitC (還原型和氧化型)，特異性較好，但操作復雜，是我國食品中VitC測定的標准方法，此方法適用於蔬菜、水果及其製品中總抗壞血酸的測定。
4.高效液相色譜法
4.1測定原理
高效液相色譜法是近年來發展起來的一種測定維生素 C 含量的方法，測定維生素 C 含量通常採用 C18柱或 C8柱，由於維生素 C 對紫外光有吸收，故檢測器常用紫外檢測器。
4.2測定操作
稱取維生素C標准樣品0.1000 g.轉移至100 ml容量瓶中，用雙蒸水定容，得到1.0mg·ml-1的維生素C標准溶液。參考Nisperos-Carriedo等的方法。准確稱取果肉1.00 g，用5 ml 0.2%偏磷酸冰浴研磨， 10000 g離心15 min，殘渣加入4 ml 0.2%偏磷酸再提取，合並上清液，定容至10 ml，經0.45μm濾膜過濾後待測。每個樣品重復5次。維生素C在240 nm波長時有最大吸收峰，故以240 nm作為檢測波長。以0.2%偏磷酸為流動相。分別吸取標准溶液1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8m，l各自定容至10 m，l從中分別吸取10.0μl進樣分析，以峰面積(mv)為縱坐標，標樣濃度(mg·ml-1)為橫坐標，繪制標准溶液曲線，計算線性回歸方程的回歸系數和截距。將樣品溶液分別進樣10.0μl進行液相色譜分析，測定維生素C的色譜峰面積，代入標准曲線計算出維生素C含量。
4.3測定方法評價
高效液相色譜法具有高效、快速、穩定、結構准確、操作簡便等特點。該法分離時間短，對結構不穩定的維生素C尤為適合，還特別適用於顏色較深的提取液樣品的測定，成為近年來較受歡迎的維生素C測定方法。缺點是所用儀器較為昂貴。