流感檢測報告方法

⑴ 禽流感 怎樣診斷

禽流感的確診主要靠病原的分離和鑒定。分離毒用血凝和血凝抑制試驗排除新城疫、減蛋綜合征，雙向免疫瓊脂擴散試驗確定A型核蛋白的有無，再進一步檢測血凝素和神經氨酸酶表面抗原的亞型。由於該病臨床症狀和病理變化多樣，需結合流行特點作出初步診斷。也可測定發病急性期和發病後2～4周的雙份血清中抗體上升的程度來診斷。
本病與新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、傳染性鼻炎、慢性呼吸道病有相似的臨床表現，必須用病毒學方法和血清學方法加以區別。

⑵ 流行性感冒病毒的診斷方法

病毒感染還會誘導干擾素的表達和細胞免疫調理，造成一些自身免疫反應，包括高熱、頭痛、腓腸肌及全身肌肉疼痛等，病毒代謝的毒素樣產物以及細胞壞死釋放產物也會造成和加劇上述反應。
由於流感病毒感染會降低呼吸道粘膜上皮細胞清除和黏附異物的能力，所以大大降低了人體抵禦呼吸道感染的能力，因此流感經常會造成繼發性感染，由流感造成的繼發性肺炎是流感致死的主要死因之一。
在流行期結合臨床症狀診斷流感並不困難，但要確診或流行監測時必須進行實驗室檢查，主要包括病毒分離培養、血清學診斷和快速診斷方法。
病毒的分離與鑒定
通常採取發病3日內患者的咽洗液或咽拭子，經抗生素處理後接種於9～11日齡雞胚羊膜腔和尿囊腔中，於33℃～35℃孵育3～4天後，收集羊水和尿囊液進行血凝試驗。如血凝試驗陽性，再用已知免疫血清進行血凝抑制（hemoagglutination inhibition，HI）試驗，鑒定型別。若血凝試驗陰性，則用雞胚再盲目傳代3次，仍不能出現血凝則判斷病毒分離為陰性。也可用組織培養細胞（如人胚腎或猴腎）分離病毒，判定有無病毒增殖可用紅細胞吸附方法或熒光抗體方法。
血清學診斷
採取患者急性期（發病5天內）和恢復期（病程2～4周）雙份血清，常用HI試驗檢測抗體。如果恢復期比急性期血清抗體效價升高4倍以上，即可做出診斷。正常人血清中常含有非特異性抑制物，因此在進行HI試驗前可用胰蛋白酶等處理血清，以免影響HI試驗結果。HI試驗所用的病毒應當是與當前流行密切相關的病毒株，反應結果才能確切。補體結合試驗（compliment fixation，CF）只能檢測NP、MP的抗體。這些抗體出現早、消失快。因此，CF試驗只能作為是否新近感染的指標。
快速診斷
對患者進行快速診斷，主要是採用間接或直接免疫熒光法、ELISA法檢測病毒抗原。常取患者鼻甲粘膜印片或呼吸道脫落上皮細胞塗片，用熒光素標記的流感病毒免疫血清進行免疫熒光染色檢查抗原，或用ELISA檢查患者咽漱液中的抗原。 用單克隆抗體經免疫酶標法僅用24～72小時即可快速檢測甲、乙型流感病毒在感染細胞內的病毒顆粒或病毒相關抗原。
PCR、核酸雜交或序列分析等方法也被用於檢測流感病毒核酸或進行分型。

⑶ 禽流感病毒和抗體的實驗室檢測方法分別有哪些各種方法用途分別是什麼

病毒檢測方法有：
（1）病毒（雞胚、細胞）分離培養與鑒定，用途為直接分離病毒；
（2）免疫熒光法，用途為檢測組織、細胞培養物中病毒抗原；
（3）免疫酶法（包括免疫酶組織化學染色法和免疫過氧化物酶細胞單層試驗），用途為檢測組織、細胞培養物中病毒抗原；
（4）中和試驗，用已知陽性血清檢測病毒，金標准方法
（5）血凝/血凝抑制試驗，用已知陽性血清檢測病毒
（6）乳膠凝集試驗，用已知陽性血清檢測病毒抗原
（7）膠體金試紙，用已知陽性血清檢測病毒抗原
（8）ELISA方法，用已知陽性血清檢測病毒抗原
（9）RT-PCR（含熒光RT-PCR），用途為檢測病毒核酸
（10）NASBA，用途為檢測病毒核酸
（11）核酸探針，用途為檢測病毒核酸
（12）基因晶元，檢測病毒核酸
（13）核酸序列測定，解析病毒核酸
抗體檢測方法
（1）瓊脂擴散試驗，檢測病毒NP和M蛋白抗體
（2）血凝抑制試驗，檢測病毒HA蛋白抗體，可用於免疫效果評估
（3）神經氨酸酶抑制試驗，檢測病毒NA蛋白抗體
（4）中和試驗，用已知病毒檢測血清，金標准方法
（5）ELISA方法，用已知病毒抗原檢測特異抗體
（6）膠體金試紙，用已知病毒抗原檢測特異抗體
（7）乳膠凝集試驗，用已知病毒抗原檢測特異抗體

⑷ 流行性感冒診斷標准及處理原則的診斷標准

流行病學史
在流行季節一個單位或地區同時出現大量上呼吸道感染病人；或近期內該地區或鄰近地區上呼吸道感染病人明顯增多；或醫院門診上呼吸道感染病人明顯增多。
病原學診斷方法
A1 病毒分離
從疑似流感病人呼吸道採集標本分離病原體。
A2 標本的收集和處理
A2.1 標本收集時間應於發病早期（1～3d內）越早越好。
A2.2 標本收集方法常用棉拭子擦抹法或咽喉漱洗法。棉拭子擦抹法用於採集兒童標本，採集時將滅菌棉拭子稍沾標本收集液（pH7.2～7.6含20%～40%滅菌肉湯的生理鹽水或Hanks液或生理鹽水），反復擦拭患者咽部數次，然後將此棉拭子放進裝有上述收集液的試管中塞上棉塞。咽喉洗漱法用於採集成人標本，採集時先讓患者咳嗽，然後用10mL左右的收集液反復洗漱咽喉部約1min，吐入管內。如有條件，兒童標本用負壓抽吸法抽取鼻咽分泌物，成人標本用鼻咽洗液，可提高分離的陽性率。標本採集後置冰壺（4℃）中盡快送實驗室。
A2.3 標本的處理：用毛細吸管反復吹打標本液（如為咽拭子標本，先反復擠壓咽拭子後棄之），將粘液打散，於4℃靜置5～10min，待自然沉澱後取3mL上清，按每毫升加青黴素1000單位和鏈黴素1000μg，混勻置4℃處理2～4h即可接種。如標本污染較重，可置4℃過夜處理。如預計標本在48h內不能完成接種時，應將標本置低溫（最好-70℃）保存。
A3 接種及培養法
最常用雞胚培養法和組織培養法，有條件的亦可同時用兩種方法進行病毒分離。
A3.1 雞胚培養法：取9～11日齡雞胚，將處理過的標本液經羊膜腔和尿囊腔各接種0.2mL，每份標本接種3～4隻胚，置33～35℃溫箱培養3d，然後將雞胚放置4℃冰箱過夜（或置—20℃冰箱1h再置4℃數小時）可分別收獲尿液和羊水，並作初步血凝（其方法是用毛細吸管取1～2滴尿液或羊水，置大孔塑料板內，再加入1～2滴1%雞紅細胞，搖勻後置室溫或4℃30～45min觀察結果，根據血球凝集程度的不同可分為++++、+++、++、+、±、－），如血凝為+++～++++時，再按系列倍比稀釋測定其血凝滴度，如具有一定血凝滴度即可鑒定。如血凝陰性，可盲傳2代，如仍為陰性則棄之。
A3.2 組織培養法：用0.2mL處理過的標本液接種於長成單層的原代人胚腎（或猴腎或地鼠腎），或狗腎傳代細胞（Madin Darby Canine Kidney，MDCK），每份標本接種4管，置37℃吸附1～2h後棄標本液，再加入每毫升含2μg胰酶的199維持液1mL，於33℃培養7～10d，並逐日觀察病變。從第三天開始每隔一天用0.4%雞或豚鼠紅細胞對培養管做紅細胞吸附試驗（試驗前無菌法收獲細胞培養上清液），如陰性則用已收獲的上清液盲目傳代，如陽性則測定上清液的血凝滴度。如標本第1代紅細胞吸附試驗陰性，可用收獲的全部上清液混合進行盲傳2代，仍為陰性則棄之。
A4 新分離株的鑒定
新分離流感病毒可用血凝抑制、補體結合、中和以及血細胞吸附抑制等試驗方法進行鑒定。最常用和最簡單的方法是血凝抑制試驗，必要時採用補體結合試驗。
A4.1 血凝抑制試驗：用當前流行的甲3、甲1及乙型流感病毒代表株的免疫血清與新分離流感病毒做血凝抑制試驗，觀察新分離株能否被免疫血清所抑制。血凝抑制試驗方法見附錄B。
A4.2 紅細胞吸附抑制試驗：取紅細胞吸附試驗陽性的組織培養管和正常細胞對照管，用Hanks液洗細胞2次，加入經霍亂濾液（RDE）處理（1∶10）的免疫血清0.2mL，再加入Hanks0.6mL，室溫作用30min後，再加入0.4%雞（或豚鼠）紅細胞0.2mL，置室溫30min後於普通光學顯微鏡下觀察有無血球吸附。如果血細胞吸附被所用免疫血清所抑制，表明所分離的病毒與所用免疫血清型別相一致或接近。
A4.3 補體結合試驗：如果用已知的甲型（甲3、甲1）或乙型或丙型流感病毒免疫血清對新分離病毒的血凝均不能抑制，則應考慮可能為甲型流感病毒的新亞型，可用針對甲型、乙型流感病毒核蛋白的免疫血清作補體結合試驗定型。
血清學診斷方法
B1 血凝抑制試驗方法
B1.1 原理
一些動物紅細胞（如雞、豚鼠等）以及人「O」型血紅細胞上有流感病毒受體，遇流感病毒可產生紅細胞凝集現象，簡稱血凝。若將特異性抗體與流感病毒（血凝素）預先作用後再加入紅細胞則不產生凝集，稱為血凝抑制現象。用定量血凝素與不同稀釋度血清抗體作用後，能完全抑制血凝的最高稀釋度，即為血凝抑制抗體效價。
B1.2 主要材料
大孔塑料板，1mL吸管或1mL移液器。
B1.3 雙份血清收集及處理
急性期血清於發病3d內採取，恢復期血清於發病後2～4周採取。取0.1mL已分離的血清加入0.9（或0.4）mL霍亂濾液（RDE）（即1∶10或1∶5稀釋）搖勻，於37℃水浴中過夜，以去除血清中的非特異性抑制素，次日置56℃水浴50min以滅活多餘的RDE。
B1.4 流感病毒血凝素制備
流感病毒接種雞胚後48h收獲的尿囊液，加入1/10000硫柳汞防腐。為了延遲尿鹽沉澱可先用無菌生理鹽水做等量稀釋，置4℃備用。
B1.5 雞紅細胞懸液的制備
從靜脈或心臟抽取正常健康雞血，保存於阿氏（Alsevr's）液中，置4℃保存。用前以生理鹽水洗3次，末次經2000r/min離心10min，將紅細胞用生理鹽水配成1%濃度。
B1.6 血凝素滴定
將流感病毒血凝素在大孔塑料板內用生理鹽水從1∶5開始做系列倍比稀釋，每孔0.25mL再加入等量1%雞紅細胞，搖勻，置室溫或4℃30～45min後觀察結果，以出現十十血凝的血凝素最高稀釋度為其血凝效價，即為1個血凝單位，實驗時採用4個血凝素單位，例如血凝素效價為1∶320，為1個單位，4個單位即為1∶80稀釋。正式實驗前經校對取4個血凝單位用於實驗。
B1.7 血凝抑制試驗步驟
B1.7.1 將上述已處理的待檢血清（1∶10或1∶5）再用生理鹽水做系列倍比稀釋，每孔加0.25mL。
B1.7.2 加入等量已配好的4個單位血凝素。
B1.7.3 每孔加入0.25mL 1%雞紅細胞，搖勻置室溫或4℃30～45min。
B1.8 結果觀察
觀察結果時將血凝板傾斜數十秒鍾，待陰性孔內紅細胞自由下滑呈淚滴狀時讀結果。以出現完全抑制的血清最高稀釋度的倒數為抗體的效價。在檢測患者雙份血清時需在同一次試驗中進行，並以恢復期血清抗體效價較急性期抗體效價升高4倍或4倍以上為陽性。
B2 型特異性補體結合試驗
B2.1 原理
甲、乙、丙三個型流感病毒各具有特異的可溶性抗原（核蛋白抗原），甲型流感病毒各亞型均具有相同的可溶性抗原，與乙型或丙型的可溶性抗原完全不同，因此可利用補體結合試驗來區別它們。當流感病毒出現很大的變異或出現新亞型而引起大流行時，由於來不及充分掌握新分離毒株的性狀，常需同時採用補體結合試驗和血凝抑制試驗對新毒株進行血清學診斷。
B2.2 型特異免疫血清制備
B2.2.1 免疫用抗原
甲型為PR8株和乙型為Lee株均為小鼠適應株。於乙醚麻醉下鼻腔感染12～16g小鼠，每鼠0.05mL，待感染後3～5d大部分小鼠發病、部分死亡時，解剖小鼠。取肺研磨並用生理鹽水製成10%的懸液，低速離心去除粗塊，取上清鼠肺懸液即為免疫用抗原。
B2.2.2 免疫血清制備
選體重300～500g的健康豚鼠，免前采血3～5mL，分離血清分裝凍存留作對照。豚鼠用乙醚輕度麻醉，鼻腔滴入上述鼠肺懸液抗原0.5mL，共免疫3～4次，每次間隔一周，在末次免疫的同時，由腹腔注射鼠肺懸液2mL，一周後試血，如果對同型尿膜抗原的血清效價超過1∶80，而與異型抗原無交叉反應，立即采血分離血清分裝凍存於低溫（-20℃以下）。試驗前血清於56℃水浴滅活30min。
B2.3 可溶性抗原的制備
用甲、乙型流感病毒或新分離病毒按常規接種和收獲尿囊液，如尿液血凝在1∶40以上時，收獲其尿囊膜，將尿囊膜用鹽水洗一次，用無菌剪刀將膜剪成數小塊放入試管中，每個雞胚的尿囊膜加1mL無菌生理鹽水，凍化三次，末次化後以3000r/min離心15min，吸出上清即為可溶性抗原，加入1∶10000的硫柳汞防腐，置4℃冰箱至少可用一個月。
B2.4 雙份血清採集
收集病人急性期（發病3d內）和恢復期（發病10～30d後）的血清。血清於試驗前56℃30min滅活。
B2.5 1%綿羊紅細胞懸液制備、溶血素、補體的制備和滴定按常規方法。
B2.6 補體結合試驗步驟
按常規進行。
B2.7 結果判定
B2.7.1 被檢病毒尿膜抗原與甲型（或乙型）流感病毒免疫血清呈陽性反應則可診斷為甲型（或乙型）流感病毒，如甲、乙均為陰性時，應考慮丙型流感病毒或其他病毒。
B2.7.2 雙份血清對甲型（或乙型）抗原有4倍或4倍以上升高，即可診斷為甲型（或乙型）流感病毒感染。
B2.7.3 正常人群補體結合抗體滴度一般在1∶16以下，如單份恢復期血清抗體在1∶32以上時，結合臨床症狀可作診斷的參考。
B2.7.4 人群血清抗體水平調查中，補體結合抗體在1∶32以上者可作為新近感染流感的證據。
B3 神經氨酸酶抑制試驗
B3.1 原理
胎球蛋白（Fetuin）底物經流感病毒的神經氨酸酶作用後，使N乙醯神經氨酸游離出來，經過碘酸鹽的氧化作用將N乙醯神經氨酸轉化為β－甲醛內酮酸，後者經硫代巴比妥酸作用形成生色團，用有機溶劑提取生色團，並在分光光度計上比色。利用上述反應可測知流感病毒的神經氨酸酶活性，反應的顏色越深酶活性越強。並可選擇用於神經氨酸酶抑制試驗的標准劑量。神經氨酸酶抑制試驗是將標化好劑量的神經氨酸酶(即一定稀釋度的流感病毒尿囊液）和系列稀釋的被檢血清和正常血清起孵育，測知血清作用於神經氨酸酶活性的抑制效價，並計算出血清的神經氨酸酶抑制滴度。
B3.2 器材及試劑
B3.2.1 小試管、10mL吸管及分光光度計等。
B3.2.2 磷酸緩沖液（PBS pH5.9）及生理鹽水。
B3.2.3 胎球蛋白底物液：450～500mg冰凍乾燥的胎球蛋白加蒸餾水10mL，溶解後置4℃保存，每周新配。
B3.2.4 過碘酸鈉溶液：稱4.8g過碘酸鈉（NaIO（下標始）4（下標終)）溶於38mL蒸餾水中，加62mL正磷酸（濃），充分混合，置於棕色磨口瓶中，室溫保存。
B3.2.5 砷試劑：稱10g砷酸鈉（NaAsO（下標始）2（下標終））和7.1g無水硫酸鈉溶於100mL蒸餾水中，加0.3mL濃硫酸，置於帶玻璃塞的瓶中，置4℃保存。
B3.2.6 硫代巴比妥酸試劑：稱1.2g硫代巴比妥酸和14.2g無水硫酸鈉加入200mL蒸餾水中，在煮沸的水浴中加熱溶解，每周新配。
B3.2.7 酸化丁醇試劑：於100mL正丁醇中加入5mL濃鹽酸，置棕色帶玻璃塞的瓶中，室溫保存。
B3.3 神經氨酸酶活性測定
B3.3.1 病毒用生理鹽水做系列倍比稀釋（1∶2～1∶32）分裝小試管，每管0.1mL。標准病毒和未知病毒的神經氨酸酶應在同一試驗中測定。
B3.3.2 每管補充加入0.1mL生理鹽水，再加入0.1mL用pH5.9 PBS配製的胎球蛋白底物，對照管用鹽水代替病毒，充分混合後置37℃水浴作用18h。
B3.3.3 從水浴中取出試管在室溫冷卻，每管加入0.1mL的過碘酸鹽試劑，充分混合，室溫靜置20min（時間要准）。
B3.3.4 每管加入1mL砷試劑，由於碘的釋放出現棕色，搖動試管待棕色消失。
B3.3.5 每管加入2.5mL硫代巴比妥試劑，並充分混合（該試劑需在煮沸溶解後加入），用棉塞將管口堵緊。
B3.3.6 立刻將試管置於煮沸的水浴中，煮沸10min，可見紅色出現，即為神經氨酸酶活性的表現，顏色越深酶活性越高。
B3.3.7 將試管置冰水中冷卻後去掉棉塞，加入4mL丁醇試劑，換上干凈橡皮塞，用手劇烈搖動試管，提取顏色使其轉到有機物（丁醇）相。
B3.3.8 以1500r/min離心5～10min使丁醇層清亮透明，小心地吸出上層的丁醇，放入干凈的試管中待檢。
B3.3.9 將上述受檢樣品由高稀釋度到低稀釋度依次傾入透光池中，其中第一個透光池加入無病毒的對照管液，將分光光度計波長調至549nm，將對照管調至零，然後依次讀取每個稀釋度樣品的光密度。
B3.3.10 酶單位的計算：酶活性測定時光密度為0.45～0.85的病毒稀釋度作為一個酶單位。
B3.4 神經氨酸酶抑制試驗
B3.4.1 按上述方法測定酶活性，選用1個酶單位的病毒稀釋度（即酶活性測定時光密度為0.45～0.85的病毒稀釋度），每管加入0.1mL。
B3.4.2 受檢血清做系列倍比稀釋，每管病毒加入不同稀釋度血清0.1mL，血清對照管是以最低稀釋度血清加生理鹽水代替病毒，37℃水浴作用1h。以同法做正常血清對照組。
B3.4.3 每管加入pH5.9 PBS配製的胎球蛋白0.1mL，充分搖勻，置37℃水浴中孵育18h。
B3.4.4 自水浴中取出試管，按B3.3.3.～B3.3.7逐步加入前述各種試劑。
B3.4.5 測定光密度時應從低稀釋度血清管至高稀釋度血清管，檢測方法同B3.3.9。
B3.5 神經氨酸酶抑制抗體滴度的計演算法
B3.5.1 根據抗血清和正常血清兩組試驗的實驗結果，求得每組血清同一稀釋度的光密度之商數，即為經血清作用後所余之酶活性的百分數。血清稀釋度越高，殘留的酶活性也越高，找出50%酶活性前後兩個血清稀釋度及其相應的酶活性百分數，按公式計算出血清神經氨酸酶抑制抗體滴度。
B3.5.2 計算公式
式中：A——血清神經氨酸酶抑制抗體效價倒數；
B（下標始）1（下標終）——酶活性高於50%的血清稀釋度倒數；
B（下標始）2（下標終）——酶活性低於50%的血清稀釋度倒數；
C（下標始）1（下標終）——高於50%的酶活性的百分數；
C（下標始）2（下標終）——低於50%的酶活性的百分數；
50——常數。
B3.5.3 計算舉例
先計算血清作用後的酶活性：
然後將對數稀釋度換算為幾何稀釋度：例如10（上標始）－3（上標終）換算為1/1000，10（上標始）－3.5（上標終）換算為1/3200。最後代入公式：
此抗血清的神經氨酸酶抑制效價為1∶1440。
流感快速診斷方法
C1 直接檢查呼吸道脫落上皮細胞內抗原
C1.1 原理
由於流感病毒的主要感染部位是在呼吸道上皮細胞，因此在病人呼吸道標本的脫落細胞中含有流感病毒抗原，通過直接檢查脫落上皮細胞內抗原即可診斷。檢查方法可採用免疫熒光法，一般於3～4h內即可完成，而且可以直接定型。
C1.2 標本的收集和製片
兒童標本最好採用負壓抽吸法收集呼吸道分泌物，成人標本最好採用鼻咽洗液。可將每份標本分為兩份，一份低溫凍存備作病毒分離，一份用pH7.2磷酸緩沖液（PBS），將粘液吹打散，1500r/min離心15min去除上清，細胞沉澱用PBS洗1～2次，末次離心後棄上清，加入適量pH7.2 PBS使細胞重懸，滴加於帶圈的玻璃片上，自然乾燥，冷丙酮固定10min。
C1.3 間接免疫熒光法
C1.3.1 用10%新鮮羊或牛血清封閉標本片，置濕盒中於37℃30min。
C1.3.2 分別加入適當稀釋度的抗甲型和乙型流感型特異性單克隆抗體，置濕盒中於37℃放置1h。在PBS中洗兩次，共10min。
C1.3.3 加適當稀釋度的兔抗鼠熒光素結合物置37℃1h。在PBS中洗三次，共10min，末次用蒸餾水過一下。
C1.3.4 於熒光顯微鏡下觀察結果，觀察到三個以上胞漿內或胞核內熒光陽性細胞即可判為陽性。
C2 標本經敏感細胞增殖1代後查抗原
C2.1 原理
病人呼吸道標本經接種敏感細胞（狗腎傳代細胞MDCK）增殖1～3d後，將細胞消化分散製成抗原片，再用免疫熒光法或免疫酶染法檢查細胞內抗原。由於標本中的病毒在敏感細胞增殖後查抗原，能明顯提高其診斷的敏感性，可在細胞病變出現以前查到抗原，可以直接定型，而且比常規雞胚分離病毒法要快得多，一般24～72h即可診斷。檢查方法可採用間接免疫酶染法（C2.5）或間接免疫熒光法（C2.4）
C2.2 標本的收集及處理
兒童標本可採用咽拭子，最好採用負壓抽吸法；成人標本可採用咽漱液，最好採用鼻咽洗液。標本按附錄A（標準的附錄）中A2.3方法處理。
C2.3 標本的接種培養及製片
取處理過的標本液0.2mL接種於長成單層的MDCK細胞，每份標本接種3管，置37℃吸附1～2h後棄去標本液，加入每毫升含2μg胰酶的199維持液至1mL，於35℃培養24、48和72h分別取出1管，收集上清備用，將細胞用消化液（1份0.25%胰酶+4份Versene）消化下來，用PBS洗一次，然後滴加於帶圈的玻璃片上，自然乾燥，冷丙酮固定。同法制備未經感染的正常MDCK細胞片即為正常對照細胞。
C2.4 間接免疫熒光法
C2.4.1 加單克隆抗體同C1.3.2。
C2.4.2 加兔抗鼠熒光素結合物同C1.3.3。
C2.4.3 於熒光顯微鏡下觀察結果，觀察到胞漿內或胞核內熒光，而正常細胞片未見熒光，即可判定為陽性。
C2.5 間接免疫酶染法
C2.5.1 加單克隆抗體同C1.3.2。
C2.5.2 加適當稀釋度的羊抗鼠酶標結合物，濕盒中置37℃1h，用PBS洗兩次10min。
C2.5.3 加鄰苯二胺底物液，其配製方法為：4mg鄰苯二胺+10mLpH5.0磷酸－檸檬酸緩沖液+15μL雙氧水。pH5.0磷酸緩沖液的配製方法為：先分別配製0.1mol/L檸檬酸（C（下標始）6(下標終）H（下標始）8（下標終）O（下標始）7（下標終）·H（下標始)2（下標終）O）（21g/1000mL）和0.1mol/L磷酸氫二鈉（Na（下標始）2（下標終）HPO（下標始）4（下標終））（28.4g/1000mL），分別按24.3mL和25.7mL混合後，再加入等量（50mL）雙蒸水混合即為pH5.0磷酸鹽－檸檬酸緩沖液。加入底物液3～5min即可觀察結果。
C2.5.4 於倒置顯微鏡下觀察結果（觀察結果時，細胞要濕，如果細胞已干，可以加入一滴自來水），觀察到棕紅色深染細胞，根據觀察到的深染細胞多少記錄為++++、+++、++、+、±、－。以觀察到+以上深染細胞判為陽性；有時可觀察到單個深染細胞被無色或淡紅色細胞所包圍，而正常細胞對照呈無色或淡紅色，亦可判為陽性。