豬CD4淋巴細胞檢測方法

Ⅰ 請問檢測動物機體免疫功能的方法都有哪些

細胞免疫（CMⅠ）是由多種細胞相互作用的結果。免疫細胞間相互作用導致多種細胞因子的釋放。因此細胞功能測定不僅涉及T細胞的數量和功能與包括各類因子活性測定，因此評價機體的細胞免疫功能不僅程序復雜，且很難標准化

一、遲發型過敏反應的體外檢測方法

皮膚試驗和接觸性過敏的誘發是檢測遲發型過敏反應（DTH）的兩種常用方法。皮膚試驗中誘發對曾經使病人致敏的抗原的再次應答，而接觸性過敏是測試受者對從未接觸過的物質發生致敏的能力。

1．皮膚試驗 用皮膚試驗診斷DTH，常用的抗原有結核菌純蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人類試驗時在前臂皮內注射少量可溶性抗原，24～48小後，測量紅腫硬結的大小，硬結直徑大於10mm即被看作為陽性。表明受試者對該病原菌有了一定的細胞免疫能力，若皮試無反應，可用更高濃度的抗原重復試驗，若仍無反應即為陰性，需排除皮試技術誤差，也可能受試者從未接觸過此抗原，也可能由於細胞免疫功能缺損，或由於細胞免疫功能缺損，或由於嚴重感染（麻疹、慢性播散性結核）造成的無反應性。

2．接觸性過敏常應用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）誘生接觸性過敏。化合物與皮膚蛋白質結合而導至DTH反應。在動物試驗時，初次皮膚上塗抹DNCB後間隔7～10天再激發刺激，則皮膚出現即為陽性。此試驗人類已不使用。

二、細胞免疫的體外檢測方法

體外檢測淋巴細胞的數量和功能，最易採集的是血標本，首先需分離或純化淋巴細胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重為1.077的淋巴細胞分層液，當將血液重疊於淋巴細胞分層液之上離心時，由於紅細胞（1.092）、多形核白細胞（1.090）、淋巴細胞（1.070）的比重不同而相互分開。淋巴細胞和單核細胞在血漿和分層液交界處形成一薄層。仔細分出這一薄層的細胞，其中淋巴細胞佔80%，單核細胞佔20%，淋巴細胞中T細胞佔80%，B細胞佔4%～10%，其作為非DT、非B細胞。

1．T細胞計數

（1）E花環法：人類T細胞表面有SRBC受體（CD2）能與SRBC結合形成玫瑰花環樣結構，將經分層液分離現的RBM懸液與SRBC在含有血清的平衡鹽水中混合，經37℃培養5～10分鍾放4℃過夜，取細胞懸計數，外周血淋巴細胞中約70%～80%淋巴細胞結成花環即為T細胞。目前此方法已用來分離T細胞，而不用做T細胞計數。

（2）用單克隆抗體計數T細胞：將人的PBM分成三等份，分別用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的單克隆抗體作第一抗體與細胞結合，再用FITC標記的兔抗小鼠IgG抗體作第二抗體進行間接免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下或流式細胞儀檢測結果，在PBM中被CD3抗體染上熒光的細胞稱為CD3+細胞即總T細胞。正常人在PBM中T細胞佔70%～80%。正常人的CD4+細胞和CD8+細胞之和應與CD3+細胞數一致。CD4+細胞與CD8+細胞的比值正常人約為2/1而艾滋病患者則比值小於1.7。

2．T細胞活化試驗 T細胞能被非特異的物質稱為有絲分裂原所激活而向淋巴母細胞轉化。T細胞轉化過程可伴隨有DNA、RNA、蛋白質的合成增加，最圖導致細胞分裂。在光學顯微鏡下可計數轉化後的淋巴細胞數，也可用氚標記的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）摻入正在分裂的淋巴細胞，用液閃測定儀檢查摻入正在分裂的淋巴細胞，用液測量儀檢查摻入的3H-TdR的多少確定淋巴細胞轉化率。最近有一種不用同位素，又可用儀器測量的淋巴細胞增殖反應的檢查法，稱為MTT檢測法，MTT是一種甲氮唑鹽，它是細胞線粒體脫氫酶的底物，細胞內的酶可將MTT分解產生藍黑色甲（fromazan）產物。該產物的多少與活性細胞數正相關。結果可用酶標檢測儀（595mm）測量匯豐銀行密度，做為MTT法的檢查指標。此法的結果與3H-TdR摻入法平行，並能反應試驗中的活細胞數（表20-3）。

表20－3 淋巴細胞增殖反應的刺激物

分裂原
T細胞
B細胞

植物血凝素（PHA）
+
－

刀豆蛋白A（ConA）
+
－

美洲商陸（PWM）
+
+

葡萄球菌蛋白A（SPA）
±＊
+

副傷寒桿B（SPB）
±
+

註： PWH主要是T細胞分裂原，也可通過刺激T細胞分泌可溶性因子誘導B細胞增殖分化；

＊SPA誘導B細胞分裂不需要T細胞協助，但誘導B細胞激活抗體分泌細胞需要T細胞協助

3．細胞毒試驗 TC細胞、NK細胞、LAK細胞、TIL細胞對其靶細胞有直接的細胞毒（殺傷）作用。常用的栓測細胞毒效應的方法是51Cr-Na2Cro4鹽水溶液與靶細胞胞混合，於37℃培養1小時左右，51Cr即可進入靶細胞，與胞漿蛋白結合，洗去游離的51Cr後，即可得到51Cr標記的靶細胞，將待檢細胞毒性的細胞與51Cr標記的靶細胞混合（比例約為50：1或100：1）靶細胞被殺傷越多，釋放到上清液中的液游離的51Cr越多，且不能被其他細胞吸收。用γ射線測量儀檢測上清液中的cpm值，即可計算出待檢細胞殺傷活性的高低。

細胞毒試驗檢測Tc細胞效應功能是否健全，及經IgG介導的ADCC效應，或NK細胞在抗腫瘤免疫中的作用是有意義的。

4．混合淋巴細胞的反應（MIR） 是體外研究T細胞的較好的方法，雙向MLR常被用來篩選骨髓移植的供體。來自不同供體的淋巴細胞分別與病人的淋巴細胞混合培養4～5天，在最後8小時摻入51TdR摻入法測T細胞的反應性。或用細胞毒法觀察受刺激的T細胞與活的靶細胞混合（靶細胞來自與刺激細胞相同的個體）如果T細胞受刺激後產生了細胞毒T細胞，可殺死活的細胞，根據靶細胞釋放51Cr的多少算出T細胞移動抑制因子）和LIF（白細胞移動抑制因子）來評估細胞免疫功能。近年來應用測定IL-2的免疫酶技術，操作簡單，並能定量以取代了MIF和LIF的測定。單個核細胞與分裂原一起培養24小時，然後測定清液中的IL-2活性。在細胞免疫功能缺損時，特別是AIDS病人，IL-2分泌明顯降低。而有些疾病，如多發性硬化、類風濕關節炎、移植排斥反應等病人體內血清中IL-2水平升高，表明病人T細胞活性增高。發生移植排斥反應的病人尿中IL-2也可升高。

也可用酶聯免疫吸附試驗測定各種體液中活化的T細胞脫落的IL-2受體（CD25），一般來說IL-2的水平和IL-2受體水平是平行的，IL-2和IL-2受體的檢測可用於對某些疾病的監測，如移桿排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治療的病人。

對體外培養的細胞進行細胞因子產生能力檢測是檢查細胞培養上清液中細胞因子的生物活性或抗原性。現已可用核酸雜交技術，即從組織中或細胞中提取RNA，與同位素或酶標記的該種細胞因子的cDNA探針作分子雜交試驗，即印跡（dot blotting）或Northern印跡，若查出有某種因子的mRNA存在，即說明該細胞在所處培養條件下有產生某種細胞因子的能力。

Ⅱ 今天檢查淋巴細胞亞群

淋巴細胞亞群分析正是檢測免疫功能的重要指標
它能反映機體當前的免疫功能、狀態和平衡水平，並可以輔助診斷某些疾病（如自身免疫病、免疫缺陷病、惡性腫瘤、血液病、變態反應性疾病等），對分析發病機制，觀察療效及檢測預後都有重要意義

一、什麼是淋巴細胞亞群？

人體的免疫細胞包括T細胞、B細胞、NK細胞等。T細胞主要參與細胞免疫，表達CD3抗原；B細胞主要參與體液免疫，表達CD19抗原；NK細胞表達CD16和/或CD56，在機體中不依賴抗原刺激自發地發揮細胞毒效應。其中，T細胞又包括輔助T細胞（Th）和抑制T細胞（Ts），它們分別表達CD4和CD8。

2、CD4+/CD8+細胞比值改變：表明機體細胞免疫功能紊亂。不管是CD4+或CD8+細胞數發生變化均影響該比值。（1）CD4淋巴細胞減少：見於惡性腫瘤、遺傳性免疫缺陷病、艾滋病、應用免疫抑制劑患者。（2）CD8淋巴細胞增多：見於自身免疫性疾病，如SLE、艾滋病初期、慢性活動性肝炎、腫瘤及病毒感染等。（3）CD4/CD8>2.5表明細胞免疫功能處於“過度活躍”狀態，容易出現自體免疫反應，見於類風濕性關節炎、I型糖尿病等。（4）CD4/CD8<1.4稱為“免疫抑制”狀態，常見於：A.免疫缺陷病，如艾滋病時的比值常顯著小於0.5；B.惡性腫瘤；C.再生障礙性貧血、白血病；D.某些病毒感染。CD4/CD8降到1.0以下為“倒置”，是較為明顯的異常。（5）若移植後CD4/CD8較移植前明顯增加，則可能發生排斥反應。

3、NK細胞（CD3-CD16+和/或CD56+）能夠介導對某些腫瘤細胞和病毒感染細胞的細胞毒性作用。

四、什麼人該檢測淋巴細胞亞群？

原則上來講，在機體的免疫（防禦、自穩、監視）功能受損的情況下要考慮檢查淋巴細胞亞群，下面列出了一些常見情況：

（1）免疫防禦功能受損（反復、嚴重、多重感染，常規治療效果不佳）

（2）免疫自穩和耐受功能受損（過敏性疾病、自身免疫/炎症疾病表現）

（3）免疫監視功能受損（腫瘤性改變）

（4）其他特殊情況（血常規中淋巴細胞明顯異常、家族免疫缺陷病史、長期使用免疫抑制劑）

近年來，新的細胞表面位點的發現、新單克隆抗體的問世、高新儀器的更新換代等都為淋巴細胞亞群檢測的發展提供了可能性，進一步為臨床診斷和治療提供指導和幫助。希望大家也能多多了解和關注淋巴細胞亞群檢測，為自己的免疫功能保駕護航。

Ⅲ 如何分析流式細胞儀檢測t淋巴細胞亞群結果

最常見的是分析CD4， CD8亞群。

先在FSC， SSC散點圖上劃出淋巴細胞gate。然後在此gate基礎上選取T細胞標志染色陽性的細胞群（一般是CD3）。在把CD34陽性的細胞根據CD4 和CD8染色情況形式為散點圖，得到CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, 以及雙陽性的比率。如果還有其他細胞標志的染色，再進一步分析。