1. 大腸桿菌 乳酸菌如何做實驗檢測
大腸桿菌的檢測：大腸菌群測定的操作細則
大腸菌群系指一群能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來於人畜糞便,故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量,推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。
食品中大腸菌群數系以100mL(g)檢樣內大腸菌群最可能數(MPN)表示。
1 設備和材料
1.1 溫箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。 1.3 恆溫水浴 :44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 顯微鏡。1.6 均質器或乳缽。 1.7 平皿:直徑為90mm。 1.8 試管。 1.9 吸管。 1.10 廣口瓶或三角燒瓶:容量為500mL。 1.11 玻璃珠:直徑約5mm。 1.12 載玻片。 1.13 酒精燈。 1.14 試管架。
2 培養基和試劑
2.1 乳糖膽鹽發酵管:按GB 4789.28中4.9規定。
2.2 伊紅美藍瓊脂平板:按GB 4789.28中4.25規定。
2.3 乳糖發酵管:按GB 4789.28中4.10規定。
2.4 EC 肉湯:按GB 4789.28中4.11規定。
2.5 磷酸鹽緩沖稀釋液:按GB 4789.28中3.22規定。
2.6 生理鹽水。
2.7 革蘭氏染色液:按GB 4789.28中2.2規定。
3.1 檢樣稀釋
3.1.1 以無菌操作將檢樣25mL(或g)放於有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內予置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內,經充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質器,以8 000-10 000 r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。
3.1.2 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內,振搖試管混勻,做成1:100的稀釋液。
3.1.3 另取1mL滅菌吸管,按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用1支1mL滅菌吸管。
3.1.4 根據食品衛生標准要求或對檢樣污染情況的估計,選擇三個稀釋度,每個稀釋度,接種3管。
3.2 乳糖發酵試驗
將待檢樣品接種於乳糖 膽鹽發酵管內,接種量在1mL以上者,用雙料乳糖膽鹽發酵管,1mL及1mL以下者,用單料乳糖膽鹽發酵管。每一稀釋度接種3管,置36±1℃ 溫箱內,培養24±2h,如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣,則可報告為大腸菌群陰性,如有產氣者,則按下列程序進行。
3.3 分離培養
將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上,置36±1℃ 溫箱內,培養18-24h,然後取出,觀察菌落形態,並做革蘭氏染色和證實試驗。
3.4 證實試驗
在上述平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1-2個進行革蘭氏染色,同時接種乳糖發酵管,置 36±1℃溫箱內培養24±2h,觀察產氣情況。凡乳糖管產氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌,即可報告為大腸菌群陽性。
3.5 報告
根據證實為大腸菌群陽性的管數,查MPN檢索表,報告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。
4 糞大腸菌群(faecal coliform)
4.1 用接種環將所有產氣的乳糖膽鹽發酵管培養物(見3.2條)轉種於EC肉湯管內,置44.5±0.2℃水浴箱內(水浴箱內的水面應高於EC肉湯液面),培養24±2h,經培養後,如所有EC肉湯管均不產氣,則可報告為陰性;如有產氣者,則將所有產氣的EC肉湯管分別轉種於伊紅美藍瓊脂平板上,置 培養18-24h,凡平板上有典型菌落者,則證實為糞大腸菌群陽性。
4.2 結果報告
根據證實為糞大腸菌群的陽性管數,查MPN檢索表,報告每100mL(g)糞大腸菌群的MPN值
乳酸菌的檢測：
一 概述
乳酸菌是指一群能分解葡萄糖或乳糖產生乳酸，需氧和兼性厭氧，多數無動力，過氧化氫酶陰性，革蘭氏陽性的無芽胞桿菌和球菌。這類細菌在自然界分布廣泛，可棲居在人和各種動物的口腔、腸道等器官內，在土壤、食品、飼料、水及一些臨床標本中都有乳酸菌的存在。乳酸菌在工業、農業和醫葯等與人類生活密切相關的領域應用價值很高，相當多的乳酸菌對人、畜的健康起著有益的作用，但個別菌種能對人畜致病，乳酸菌主要包括23個屬的細菌。
二 樣本採集
檢樣主要為含乳酸菌活菌的飲料和微生態制劑，樣本應放入冰箱保存，心快檢驗。
三 檢驗方法（中華人民共和國國家標准 乳酸菌飲料中乳酸菌的微生物學檢驗GB／T 16347-1996）
乳酸菌菌總數的測定：乳酸菌菌落總數是指標樣在一定條件下培養後，所得1ml檢樣中所含乳酸菌菌落的總數。
（一）檢驗程序
乳酸菌菌落總數檢驗程序如下：
（二）培養基和試劑
改良TJA培養基（改良番茄汁瓊脂培養基）；改良MC培養基（modified Chalmers培養基）；0.1％亞甲藍牛乳培養基；6.5％氯化鈉肉湯參照；pH9.6葡萄糖肉湯；40％膽汁肉湯；澱粉水解培養基；精氨酸水解培養基；乳酸桿菌糖發酵管；七葉苷培養基；革蘭氏染色液；3％過氧化氫溶液；蛋白腖水、靛基質試劑；明膠培養基；硝酸鹽培養基、硝酸鹽試劑；生理鹽水：定量分裝於三角瓶和試管內滅菌。
（三）操作步驟
1．以無菌操作將經過充分搖勻的檢樣25ml（或25g）放入含有225ml滅菌生理鹽水的來菌廣口瓶內做成1：10的均勻稀釋液。
2．用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1m，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內（注意吸管尖端不要觸及管內稀釋液）。
3．另取1ml滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍增稀釋液，如此每遞增一次，即換用1支1ml滅菌吸管。
4．選擇2～3個以上適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1ml稀釋液於滅菌平皿內，每個稀釋度作兩個平皿。
5．稀釋液移入平皿後，應及時將冷至50℃的乳酸菌計數培養基（改良TJA或改良MC）注入平皿約15ml，並轉動平皿使混合均勻。同時將乳酸菌計數培養基傾入加有1ml稀釋液檢樣用的滅菌生理鹽水的滅菌平皿內作空白對照，以上整個操作自培養物加入培養皿開始至接種結束須在20min內完成。
6．待瓊脂凝固後，翻轉平板，置36℃±1℃溫箱內培養72h±3h取出，觀察乳酸菌菌特徵，選取菌落數在30～300之間的平板進行計數。計算後，隨機挑取5個菌落數進行革蘭氏染色，顯微鏡檢查並做過氧氫酶試驗。革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，無芽胞的球菌或桿菌可定為乳酸菌。根據證實為乳酸菌菌落計算出皿內的乳酸菌數，然後乘其稀釋倍數即得每亳升樣品中乳酸菌數。例如，檢樣10－4的稀釋液在改良TJA瓊脂平板上，生成的可疑菌落為35個，取5個鑒定，證實的乳酸菌的4個，則1ml檢樣中乳酸菌數為：
35×4／5×104＝2.8×105
7．乳酸菌在改良TJA和改良MC培養基上菌落生長形態特徵。
（四）乳酸菌的鑒定
對上述分離到的乳酸菌需進行菌種鑒定時，則作以下試驗。
1．菌種制備 自平板上挑取菌落，接種於改良TJA或改良MC瓊脂斜面，於36℃±1℃，24～48h培養，刮取菌苔，分別進行下列試驗。
2．乳酸桿菌鑒定試驗 極少見還原硝酸鹽，不液化明膠，不產生靛基質和硫化氫。
3．常見乳桿菌屬內種的碳水化合物反應。
4．產酸乳的鏈球菌的鑒別試驗。
2. 乳酸菌可以從哪些地方分離出來
乳酸菌
乳酸菌不是一個分類學上的名稱，是指在代射過程中能產生乳酸的細菌的總稱。其中能進行乳酸發酵的大部分是細菌，有些為球菌、有些為桿菌，一般都不會運動。乳酸菌在自然界中種類很多，分布極廣：有些種類生活在動物的腸、胃、口腔之中，皮膚表面以及乳、乳製品、肉類製品中；有的生存在水果、蔬菜、穀物及植物製品上。它們以單糖（葡萄糖、果糖、半乳糖）、雙糖（蔗糖、麥芽糖、乳糖）為基質，代謝產物主要是乳酸。有些乳酸菌屬耐氣性厭氧微生物，它們的產能不需氧，但在有無氧的條件下都能進行典型的乳酸發酵。
常見的球形乳酸菌主要有：
鏈球菌屬 將糖類經雙磷酸已糖途徑分解產生右旋乳酸，屬正型乳酸發酵。多見於動物及動物性製品上。
明串珠菌屬 將糖經單磷酸己糖途徑分解產生左旋乳酸及乙醇等物質，屬異型乳酸發酵。多見於植物體及植物製品之上。
片球菌屬 將糖類經雙磷酸己糖途徑分解產生混旋的乳配。多數生活在植物及其製品上。
常見的桿形乳酸菌是乳桿菌屬，約有20多種，有些種類產生右旋乳酸、也有產生左旋和混旋的乳酸，動、植物及其製品上均可找到它們。
乳酸菌經乳酸發酵的方式將糖類分解為乳酸。從其生化機制來看，乳酸發酵分為兩大類型：若發酵產物中只有乳酸的（達到80％以上），稱為正型乳酸發酵，如乳酸鏈球菌（Strep－tococcus lactis）、乳酪鏈球菌（Streptococcus cre－moris）、乾酪乳桿菌（Lactobacillus easei）等。整個過程是葡萄糖經雙磷酸己糖途徑，經兩次磷酸化後形成1—6二磷酸果糖再經醛縮酶分解成兩個三碳化合物，然後脫氫氧化成為二分子丙酮酸，最後丙酮酸接受氫還原成乳酸，總反應式為
若發酵產物中除乳酸之外還有乙酸、乙醇、CO2、H2的，稱為異型乳酸發酵。如一些明串珠菌（Leuconostoc）、乳酸桿菌（Lactobacillus）。葡萄糖經單磷酸己糖途徑形成6-磷酸葡萄糖酸，然後脫羧形成5-磷酸木酮糖，再裂解成3-磷酸甘油醛和乙醯磷酸；3-磷酸甘油醛經丙酮酸轉化為乳酸；而乙醯磷酸接受氫還原成為乙醇，反應式
乳酸菌具有一些特殊的生活特點：
乳酸菌具有強抗酸能力，如在一含糖豐富的食物製作中，雖然其他很多的菌類也能生長，但因乳酸菌不斷地產生乳酸使得環境變酸而殺死多種不耐酸的細菌。
大部分乳酸菌具有很強的抗鹽性，都能耐5％以上的NaCI濃度。嗜鹽片球菌（Pediococ－cus halophilus）能在濃度為15～18％的鹽水中生存。這樣在腌製品中其他不抗鹽的有害菌不能生存而獨有乳酸菌能正常生長，增加了食物的風味。值得一提的是常見的乳酸菌都不具有細胞色素氧化酶，所以不大會使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，因而各種乳製品、腌製品中因乳酸菌代謝產生亞硝酸鹽的可能性極小，這對於保護人體健康是很有利的。乳酸菌也不具有氨基酸脫羧酶，不產生胺類物質，也不產生吲哚和H2S，因而乳酸菌不會使食物產生腐敗及異味。
一般乳酸菌沒有蛋白酶，只有肽酶，不能分解利用蛋白質而僅能利用蛋白腖、肽和氨基酸。合成氨基酸、核酸、維生素的能力極低，因而在乳酸菌生長的環境中適量地加入這類物質，能促進乳酸菌的正常生長。
人們利用乳酸細菌的乳酸發酵，製作泡菜、酸菜、乳酪、酸奶等食品。另青飼料經乳酸發酵後可增加貯藏時間和提高飼料的利用率。在工業上製取乳酸是用澱粉類物質先糖化後，再用乳酸菌進行乳酸發酵生產純乳酸。德氏乳酸桿菌（Lactobacillus delbruckii）是工業生產上常用的菌種。
參考資料：http://www.dhxx.net.cn/zxzr/source/czsw/XJ/473_SR.asp