濃縮集菌檢測塗片方法

❶ 結核分枝桿菌的微生物學檢查程序

（1）病料採集：取病畜禽的組織，肝，肺，脾等體液、分泌物及局部病灶的滲出液。

（2）鏡檢：對原始病料塗片進行革蘭氏染色，鏡檢，應為革蘭氏陰性。用印度墨汁等染料染色，可見清晰的莢膜。

（3）培養：同時接種鮮血瓊脂和麥康凱瓊脂培養基，37℃培養24h，觀察細菌的生長情況，菌落特徵、溶血性，並染色鏡檢。

（4）生化試驗：多殺性巴氏桿菌在48h內可分解葡萄糖、果糖、單奶糖、蔗糖和甘露糖，產酸不產氣。

微生物學的主要任務：

1、在自然界物質循環中的作用。

2、空氣和水凈化、污水處理。

3、工農業生產：細菌、代謝產物、代謝活性。

4、對生命科學的貢獻。

(1)濃縮集菌檢測塗片方法擴展閱讀：

微生物必須藉助於顯微鏡才能看見的生物。在空氣、陸地、河流和海洋里都有微生物分布，在人、畜和植物體內也有許多種微生物存在，有些是致病的，對人類有害，但是也有許多微生物對人類有益。

如制酒用的酒麴就是用某些微生物做的，整個發酵工業都離不開微生物。存在於土壤中的微生物叫作土壤微生物，它的種類也很多，大致可以分成細菌、真菌、放線菌等幾大類，還有一些藻類、線蟲等也可歸入土壤微生物中。

❷ 結核病的實驗室檢查具體有什麼呢

結核病的實驗室檢查有這些：

（1）結核菌細菌學檢查痰塗片查抗酸桿菌是WHO推薦的肺 結核診斷方法，是全世界的結核病實驗室都在使用的最基本的細菌學檢 查方法。痰塗片檢查不僅可以明確結核病傳染源，而且十分經濟，符合 我國國情。塗片的優點是簡便、快速、價廉。塗片的缺點是陽性率低。 結核菌培養仍是目前診斷支氣管結核病（MTB)的金標准，缺點是培養 時間長，特異性差。(2) 免疫學檢測技術

① 皮膚變態反應：結核菌素或PPD實驗，臨床意義同前。

② 結核抗體測定：目前常用的檢測方法主要有ELISA、免疫層析試 驗、免疫印跡試驗和蛋白晶元技術等檢測血清抗體方法。

③ 結核抗原測定和循環免疫復合物（CIC)測定。

(3) 干擾素分析為體外測定結核菌抗原刺激誘發的T淋巴細胞分 泌y干擾素（IFN-y)的方法。(4) 分子生物學方法檢測核酸雜交、聚合酶鏈式反應（PCR)可 檢測樣本中的結核桿菌核酸，並能鑒別耐葯株。

(5) 血沉多增快，結合臨床表現及X線檢查可協助判斷結核病的 活動性。

❸ 敘述結核桿菌的檢驗程序

結核桿菌與麻風桿菌是分枝桿菌屬中的主要病原菌。
結核桿菌菌體細長略帶彎曲，有分枝生長趨勢。菌體含脂量高，與其抗酸特性、抵抗力特性、致病性與免疫性等都有密切關系。該菌營養要求高，生長緩慢，形成「菜花狀」菌落。

一、結核桿菌檢驗程序
結核病人病灶中查到結核桿菌，是病原學診斷的重要依據，根據感染部位不同，可採集病人的痰、尿、糞便、腦脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序進行檢驗。

二、結核桿菌培養特性
1. 液體培養基（蘇通氏培養基、小川培養基、血清酸性培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理（即酸鹼處理，可液化標本，也可殺死雜菌，還可濃縮集菌）後接種液體培養基，35℃培養1-2周，由於表面生物，可在培養基表面表成污灰、乾燥、有皺褶的菌膜。
2. 固體培養基（改良羅氏培養基、丙酮酸鈉培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理後，接種固體培養基，37℃培養2-4周，在培養基表面可形成乳白或米黃色、不透明、粗糙顆粒狀或節狀堆聚的菌落，呈現「菜花狀」。
3. 結核桿菌快速培養檢測方法：無菌手續將前處理後的材料塗片，置液體培養基中，35℃恆溫箱CO2培養箱內培養，3-5日後，每隔日取出一玻片，染色鏡檢，可快速獲得結果。

三、齊~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法
【原理】
結核桿菌對苯胺染料不易著色，若加溫或延長染色時間使其著色後，再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色，再經美蘭復染，結核桿菌及其他分枝桿菌仍呈紅色，而非抗酸菌和細胞雜質等呈藍色。
【材料】
1. 結核病人痰液：採取清晨第一口粘痰，或濃縮集落菌法處理過的痰標本。
2. 抗酸染色液
3. 載物玻片、玻片夾、酒精燈、臘筆等。
【方法】
1. 無菌手續採取痰液塗片，自然乾燥，火焰固定。
2. 用臘筆將塗面局部隔開，滴加石炭酸復紅染液，酒精燈上加熱至出現蒸氣。切勿沸騰，亦不可使染液乾涸。如有乾涸的趨勢，應及時補加染液。持續染色5-8分鍾，待冷後流水漂去多餘的染液。
3. 用3%鹽酸酒精清脫色，脫至塗面無色為止，約1-3分鍾，自來水沖洗。
4. 滴加呂氏美蘭染液復雜30秒~1分鍾，水洗。自然乾燥或吸干後油鏡檢查。
【結果】
1. 結核桿菌呈現細長，略有彎曲的紅色菌體，有的可表現出分枝特徵，有的菌體表現有多數濃染顆粒。結核桿菌大多分散排列，亦可以見到有縱行條索狀排列。
2. 塗片染色能查到結核桿菌者，一般需要每毫升痰液內含菌量至少應有500個以上，甚至需達到5萬以上。故材料多進行濃縮集菌處理，以提高檢出陽性率，也造成在染色標本片觀察中，不一定每個視野都能看到結核桿菌。
3. 結核桿菌易發生變異，在陳舊培養基或臨床治療後標本材料中，結核桿菌往往菌體斷裂，或形成非抗酸性革蘭氏陽性的短桿狀、球狀顆粒，亦稱Much顆粒。
4. 標本已經高壓滅菌處理，不影響染色結果，也保證操作者的安全。

四、熒光染色法
此系用金胺熒光素染擴酸性細菌的方法，簡便易行，但不具特異性。金胺染色法有多種、現列於後表，可選擇使用，應用熒光顯微鏡檢查結果。

五、結核桿菌毒力試驗——動物試驗法

【材料】
1. 動物：體重200~250克豚鼠2隻
2. 結核桿菌培養物或結核病人檢驗材料（痰、尿、糞、腹水等材料經濃縮集菌）
3. 注射器及消毒用材料等。
【方法】
1. 選取結核菌素試驗為陰性的豚鼠兩只。
2. 吸取結核桿菌懸液或病人檢材，注入豚鼠腹股溝皮下0.1ml
3. 注射後每周定期檢查一次，觀察豚鼠腹股溝淋巴結是否腫大，局部變硬，化膿及體重減輕、體溫升高等症狀。
4. 給豚鼠作結核菌素試驗，是否出現陽性結果。
5. 6周後，將豚鼠進行解剖，觀察淋巴結是否腫大，有無乾酪性病變，肝、脾、肺等是否腫大，表面有無灰白色結節病灶，取可疑病灶進行塗片染色鏡檢和分離培養。若為陽性結果，可報告「動物接種後××天查到有結核菌感染」。如無症狀及病變者，可報告為陰性。

六、結核桿菌濃縮集菌法（以處理痰標本為例）
【材料】
結核病人24小時痰液，細口瓶，0.02%酚紅液、汽油，NaOH，無菌生理鹽水等。
【方法】
(一)漂浮法：
1. 取24小時痰液15毫升，裝入細口瓶內，加入2倍量0.5%NaOH搖勻，高壓滅菌或煮沸20—30分鍾殺菌。
2. 待冷後加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振盪20—30分鍾，用生理鹽水加至液面與瓶口齊，靜置半小時。
3. 取瓶口表面油狀物塗於載物玻片上，微微加熱，干後再加，如此重復5—6次，至厚度適宜，烘乾待冷，抗酸染色，油鏡頭檢查。

(二)沉澱法：
1. 取痰液1份或2倍量4%NaOH，高壓無菌或煮沸20—30分鍾後，加入0.02%酚紅指示劑0.1毫升，劇烈振盪混勻，亦可置37℃水浴消化30分鍾。
2. 矯正PH為7.0，3000轉/分離心30分鍾，棄去上清液。
3. 取沉澱物塗片染色鏡檢。若進行分離培養和動物接種，可免去高壓滅菌或煮沸的程序。

附錄：抗酸染液的配製
1. 石炭酸復紅液：稱取鹼性復紅4克，溶於95%酒精100毫升中成飽和液。再取飽和液10毫升與5%石炭酸溶液90毫升混勻即成。
2. 3%鹽酸酒精：取濃鹽酸3毫升，95%酒 97毫升混合。
3. 呂弗勒氏鹼性美蘭液：稱取美蘭2克，溶於95%酒精100毫升中，配成飽和液，取飽和液30毫升，再加入蒸餾水100毫升及10%氫氧化鉀水溶液0.1毫升即成。