檢測方法區別細菌和支原體

❶ 肺炎衣原體的鑒定檢測方法

臨床依據患者的症狀和體征，很難鑒別細菌性、病毒性、肺炎支原體或肺炎衣原體的感染，以致在臨床用葯上存在困難，一般只能依賴實驗室通過人體體液標本進行病因檢測。碘染色法和姬姆薩染色法不適用於Cpn的檢測。細胞免疫組織化學法對組織切片進行生物素-抗生物素-過氧化物酶系統著色（又稱ABC法）。在冠狀動脈硬化斑塊上可檢出Cpn-EB，透射電鏡證明在AS泡沫細胞內有特徵性的0.4µm大小的EB。該系統設備價格高昂，技術要求高，只限於科研應用。故不適合直接塗片。
目前常用的檢測方法有如下幾種：
分離培養
分離培養是Cpn特異性實驗室診斷方法，可用鼻咽或喉拭子、痰和胸腔積液標本分離Cpn，鼻咽部拭子是進行分離的理想標本，喉和痰液分離Cpn有何差別還不清楚。Cpn需要在組織中進行培養，無細胞培養基不適合Cpn繁殖，Cpn能在呼吸道來源的細胞系如：HEp-2和HL細胞系中穩定生長。拭子採用滌棉、金屬線為好，拭子既應注意防污染，亦要防止細胞和Cpn受抑制，取得的標本通常置於加抗生素和小牛血清的蔗糖磷酸緩沖液（保存於4℃，不超過24h），標本置於室溫會降低其活性，如果不能在24h內處理，標本應置於−70℃冰箱保存。接種後72h，要證實菌株，可用Cpn特異性或衣原體種特異性（即抗LPS）熒光結合單克隆抗體進行染色。Cpn包涵體不包含糖原，因此不被碘染色。
但是，肺炎衣原體的組織培養較其他衣原體困難，在作分離培養時，常採取以下措施以增強肺炎衣原體的感染性及促進其在細胞中的生長：①接種物離心（3000r/min）。②培養細胞用30µg/ml的二乙氨基乙基葡聚糖（DEAE-dextran）預處理。③加入細胞生長抑制劑，如環己酞亞胺1µg/ml以抑制宿主細胞生長。Kuo等在研究肺炎衣原體培養所需氨基酸時發現，賴氨酸和蛋氨酸的部分或完全缺失可不同程度地促進肺炎衣原體的生長，但該促進作用在加入環己酞亞胺後變得不明顯。Theunissen等觀察了SPG保存液的pH、離子強度、溫度對肺炎衣原體感染HL細胞的影響，發現pH大於8或小於5，原體的存活率迅速減低；在含10%小牛血清的SPG中，外加NaCI濃度小於80mmol/L時原體的活性受到影響，而0.346～4mmol/L的Ca2+或0～2.5mmol/L的Mg2+對原體感染性的影響不明顯；在0～20℃24h內，SPG中原體95%以上存活，溫度超過20℃，原體的存活率隨存放時間的延長下降迅速 。
血清學檢測
最常用的血清學方法是補體結合反應。一般用加熱處理過的衣原體懸浮液作為抗原（屬特異抗原）來測定被檢血清（屬特異血清）。哺乳動物和禽類一般於感染後7d、10d出現補體結合抗體。通常採取急性和恢復期雙份血清，如抗體滴度增高4倍以上，認為系陽性。關於血清學普查判定標准，國內暫定1∶16或以上為陽性，1∶8為可疑，1∶4以下為陰性。
酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
ELISA已用於痰標本的Cpn抗原檢測。優點為特異性強、操作簡便、易於自動化，並且可用於大批量標本的檢測，另外，快速試驗過程僅需1h，臨界值易判斷，由於可檢測血清中IgM和IgG，故能區分急性感染和既往感染，適合於臨床實驗室作為Cpn感染的常規檢查；缺點為敏感性差，陽性預期值較低，不適合人群的篩查。
微量免疫熒光抗體檢測（MIF）
MIF技術對肺炎衣原體的診斷是特異的且敏感性高，因此被國內外學者譽為Cpn感染診斷的「金標准」。MIF抗體包括3種：IgM、IgG和IgA。初次感染（原發感染）時，IgM於發病後3周出現，IgG於發病後6～8周出現，而IgA反應較弱或不出現；再次感染（重復感染）時，IgG常在1～2周內出現，且效價可以很高，但往往沒有IgM出現或其效價很低。目前診斷標准為：①急性感染：雙份血清抗體效價升高4倍以上或IgM=1∶16或IgG≥1∶512；②既往感染：IgM<1∶16且1∶16≤IgG<1∶512；③未感染過∶IgG1∶8。總之，MIF試驗是經典的國際通用的方法，對Cpn的診斷具有高度的特異性。但該方法的抗原片製作過程復雜，實驗室要求條件高。
無論採用何種檢測方法，急性期及恢復期的雙份血清標本中，肺炎支原體特異性抗體滴度呈4倍或4倍以上增高或減低時，均可確診為肺炎支原體感染，這是目前國際上公認的標准。
分子生物學檢測
用分子生物學方法檢測血管組織中Cpn，結果取決於樣本收集和操作、引物設計、核酸抽提、擴增物的檢測以及假陽性、假陰性結果的預防與鑒別等環節。最常用的引物是omp1、16SrRNA、3SrRNA、Cpn特異性克隆PstI片斷等，測定擴增產物多應用瓊脂糖電泳、Southernblot、EIA、聚丙烯醯胺膠電泳等。目前分子診斷技術中已有聚合酶鏈反應（PCR）、套式聚合酶鏈反應（nPCR）、連接酶鏈反應（LCR）、轉錄介導擴增試驗（TMA）、基因探針雜交等方法。作為分子生物學方法，PCR法具有快速、簡便、靈敏的特點，是Cpn診斷的發展方向。總之，分子生物學方法具有快速、簡便、靈敏的優點，是Cpn感染診斷的重要手段。很多學者建議將各種分子生物學方法之間或與其他診斷方法聯合應用，並且證明了聯合應用能提高Cpn感染診斷的敏感性。如PCR與ELISA聯合應用的方法診斷Cpn感染的敏感性高於免疫熒光法、傳統PCR法以及ELISA法。此外，其中基因探針雜交和LCR單獨使用靈敏度不足，宜與PCR聯合應用。nPCR不僅特異性與靈敏度頗占優勢，而且由於無須增添任何設備，能開展PCR檢測的單位均可實施，是較為適合國情的方法 。

❷ 從血常規的檢驗單，如何判斷是細菌感染還是病毒感染還是支原體衣原體感染

白血病，中性粒細胞升高：細菌；淋巴細胞升高：病毒；支原體，衣原體感染血象可正常