赤黴素的鑒別方法

㈠ 農葯920是什麼

920是指赤霉酸，這是一各作物生長調節劑，主要作用是促進植物生長，能促進植物細胞伸長、打破休眠、誘導開花、減少落花落果、促進作物提早成熟等。

赤黴素九二零(gibberellin,GA)是在研究水稻惡苗病時發現的，它是指具有赤霉烷骨架，能剌激細胞分裂和伸長的一類化合物的總稱。常見劑型：4%赤霉酸乳油、40%赤霉酸顆粒劑、20%可溶性片劑、75%結晶粉、 85%結晶粉等。

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GA促進生長具有以下特點：

1、促進整株植物生長用GA處理，顯著促進植株莖的生長，尤其是對矮生突變品種的效果特別明顯見。

但GA對離體莖切段的伸長沒有明顯的促進作用，而IAA對整株植物的生長影響較小，卻對離體莖切段的伸長有明顯的促進作用。 GA促進矮生植株伸長的原因是由於矮生種內源GA的生物合成受阻，使得體內GA含量比正常品種低的緣故。

2、促進節間的伸長GA主要作用於己有的節間伸長，而不是促進節數的增加。

3、不存在超最適濃度的抑製作用即使GA濃度很高，仍可表現出最大的促進效應，這與生長素促進植物生長具有最適濃度的情況顯著不同。

4、不同植物種和品種對GA的反應有很大的差異在蔬菜（芹菜、萵苣、韭菜）、牧草、茶和薴麻等作物上使用GA，可獲得高產。

㈡ 論述從環境中篩選目標菌中的方法，一種就可以，詳細點

5.6 菌種篩選方法

所有的微生物育種工作都離不開菌種篩選。尤其是在誘變育種工作中，篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟。經誘變處理後，突變細胞只佔存活細胞的百分之幾，而能使生產狀況提高的細胞又只是突變細胞中的少數。要在大量的細胞中尋找真正需要的細胞，就象是大海撈針，工作量很大。簡潔而有效的篩選方法無疑是育種工作成功的關鍵。 為了花費最少的工作量，在最短的時間內取得最大的篩選成效，就要求採用效率較高的科學篩選方案和手段。因為誘變育種中的篩選工作最復雜，所以，本節主要討論誘變育種的篩選方法，這些方法也為其它育種方法的篩選提供了借鑒。

5.6.1菌種篩選方案 在實際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復篩兩步進行。初篩的目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產性狀類似的菌株盡量保留下來，使優良菌種不致於漏網。因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次。初篩的手段應盡可能快速、簡單。復篩的目的是確認符合生產要求的菌株，所以，復篩步驟以質為主，應精確測定每個菌株的生產指標。

5.6.2 菌種篩選的手段 篩選的手段必需配合不同篩選階段的要求，對於初篩，要力求快速、簡便，對於復篩，應該做到精確，測得的數據要能夠反映將來的生產水平。

5.6.2.1 從菌體形態變異分析 有時，有些菌體的形態變異與產量的變異存在著一定的相關性，這就能很容易地將變異菌株篩選出來。盡管相當多的突變菌株並不存在這種相關性，但是在篩選工作中應盡可能捕捉、利用這些直接的形態特徵性變化。當然，這種鑒別方法只能用於初篩。有人曾統計過3,484個產維生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的變異菌落，發現高產菌株的菌落形態有以下特點：菌落直徑呈中等大小（8-10毫米），凡過大或過小者均為低產菌株；色澤深黃色，凡淺黃或白色者皆屬低產菌株。又如，在灰黃黴素產生菌蕁麻青黴(Penicillium urticae)的育種中，曾發現菌落的棕紅色變深者往往產量有所提高，而在赤黴素生產菌藤倉赤霉（Gibberella fujikuroi）中，卻發現菌落的紫色加深者產量反而下降。

5.6.2.2 平皿快速檢測法 平皿快速檢測法是利用菌體在特定固體培養基平板上的生理生化反應，將肉眼觀察不到的產量性狀轉化成可見的"形態"變化。具體的有紙片培養顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等，見圖5.6.1。這些方法較粗放，一般只能定性或半定量用，常只用於初篩，但它們可以大大提高篩選的效率。它的缺點是由於培養平皿上種種條件與搖瓶培養，尤其是發酵罐深層液體培養時的條件有很大的差別，有時會造成兩者的結果不一致。 圖 5.6.1 平皿快速檢測法示意圖 平皿快速檢測法操作時應將培養的菌體充分分散，形成單菌落，以避免多菌落混雜一起，引起"形態"大小測定的偏差。

1) 紙片培養顯色法 將飽浸含某種指示劑的固體培養基的濾紙片擱於培養皿中，用牛津杯架空，下放小團浸有3%甘油的脫脂棉以保濕，將待篩選的菌懸液稀釋後接種到濾紙上，保溫培養形成分散的單菌落，菌落周圍將會產生對應的顏色變化。從指示劑變色圈與菌落直徑之比可以了解菌株的相對產量性狀。指示劑可以是酸鹼指示劑也可以是能與特定產物反應產生顏色的化合物。

2) 變色圈法 將指示劑直接摻入固體培養基中，進行待篩選菌懸液的單菌落培養，或噴灑在已培養成分散單菌落的固體培養基表面，在菌落周圍形成變色圈。如在含澱粉的平皿中塗布一定濃度的產澱粉酶菌株的菌懸液，使其呈單菌落，然後噴上稀碘液，發生顯色反應。變色圈越大，說明菌落產酶的能力越強。而從變色圈的顏色又可粗略判斷水解產物的情況。

3) 透明圈法 在固體培養基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養成分，造成渾濁、不透明的培養基背景。將待篩選在菌落周圍就會形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物質的能力。 在培養基中摻入可溶性澱粉、酪素或CaCO3可以分別用於檢測菌株產澱粉酶、產蛋白酶或產酸能力的大小。

4) 生長圈法 利用一些有特別營養要求的微生物作為工具菌，若待分離的菌在缺乏上述營養物的條件下，能合成該營養物，或能分泌酶將該營養物的前體轉化成營養物，那麼，在這些菌的周圍就會有工具菌生長，形成環繞菌落生長的生長圈。 該法常用來選育氨基酸、核苷酸和維生素的生產菌。工具菌往往都是對應的營養缺陷型菌株。

5) 抑制圈法 待篩選的菌株能分泌產生某些能抑制工具菌生長的物質，或能分泌某種酶並將無毒的物質水解成對工具菌有毒的物質，從而在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈。例如：將培養後的單菌落連同周圍的小塊瓊脂用穿孔器取出，以避免其它因素干擾，移入無培養基平皿，繼續培養4-5天，使抑制物積累，此時的抑制物難以滲透到其它地方，再將其移入塗布有工具菌的平板，每個瓊脂塊中心間隔距離為2厘米，培養過夜後，即會出現抑菌圈。抑菌圈的大小反映了瓊脂塊中積累的抑制物的濃度高低。該法常用於抗生素產生菌的篩選，工具菌常是抗生素敏感菌。由於抗生素分泌處於微生物生長後期，取出瓊脂塊可以避免各菌落所產生抗生素的相互干擾。典型的例子是春雷黴素生產菌的篩選，見圖5.6.2。

5.6.2.3 搖瓶培養法 搖瓶培養法是將待測菌株的單菌落分別接種到三角瓶培養液中，振盪培養，然後，再對培養液進行分析測定。搖瓶與發酵罐的條件較為接近，所測得的數據就更有實際意義。但是搖瓶培養法需要較多的勞力、設備和時間，所以，搖瓶培養法常用於復篩。但若某些突變性狀無法用簡便的形態觀察或平皿快速檢測法等方法檢測時，搖瓶培養法也可用於初篩。 初篩的搖瓶培養一般是一個菌株只做一次發酵測定，從大量菌株中選出10-20%較好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而復篩中搖瓶培養一般是一個菌株培養3瓶，選出3-5個較好的菌株，再做進一步比較，選出最佳的菌株。

5.6.3 特殊變異菌的篩選方法 上述一般的篩選菌株方法的處理量仍是很大的，為了從存活的每毫升106左右細胞的菌懸液中篩選出幾株高產菌株，要進行大量的稀釋分離、搖瓶和測定工作。雖然平皿快速檢測法作為初篩手段可減少搖瓶和測定的工作量，但稀釋分離的工作仍然非常繁重。而且有些高產變異的頻率很低，在幾百個單細胞中並不一定能篩選到，所以，建立特殊的篩選方法是極其重要的。例如營養缺陷型和抗性突變菌株的篩選有它們的特殊性，營養缺陷型或抗性突變的性狀就象一個高效分離的"篩子"，以它為篩選的條件，可以大大加快篩選的進程並有效地防止漏篩。在現代的育種中，常有意以它們作為遺傳標記選擇親本或在DNA中設置含這些遺傳標記的片段，使菌種篩選工作更具方向性和預見性。本節還將簡單介紹其它一些特殊變異株的篩選方法。

5.6.3.1營養缺陷型突變株的篩選 經誘變處理後的菌懸液在篩選前一般應先進行誘變後培養，以促使變異細胞發生分離，防止出現表型延遲現象，篩選出不純的菌株。營養缺陷型的篩選一般包括濃縮、進一步檢出和鑒別營養缺陷型等步驟。

1) 濃縮營養缺陷型菌株 誘變後的細胞群體中大部分存活菌是野生型，而營養缺陷型占的比例相當小，這對分離是很不利的，所以，應該淘汰大量的野生型，以達到濃縮營養缺陷型的目的。常用的濃縮方法有抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和飢餓法等。

2)進一步檢出所需缺陷型 濃縮後的菌液中營養缺陷型的比例較大，但並非全部都是。並且營養缺陷型中也有不同的類型，還需要進一步檢出所需要的營養缺陷型。這樣就需要採用逐個檢出法、夾層培養法和限量補給法等方法進一步檢出所需要的營養缺陷型。

3)營養缺陷型的鑒定 獲得的營養缺陷型菌株還應進一步確認其生長的所需物。菌株較少時，可用生長譜法， 若菌株較多時，常採用組合補充培養基法

5.6.3.2 抗性突變菌株的篩選 抗性突變株的篩選相對比較容易，只要有10-6頻率的突變體存在，就容易篩選出來。抗性突變株的篩選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段。

1) 一次性篩選法 一次性篩選法就是指在對出發菌株完全致死的環境中，一次性篩選出少量抗性變異株。 噬菌體抗性菌株常用此方法篩選。將對噬菌體敏感的出發菌株經變異處理後的菌懸液大量接入含有噬菌體的培養液中，為了保證敏感菌不能存活，可使噬菌體數大於菌體細胞數。此時出發菌株全部死亡，只有變異產生的抗噬菌體突變株能在這樣的環境中不被裂解而繼續生長繁殖。通過平板分離即可得到純的抗性變異株。 耐高溫菌株在工業發酵中的應用意義在於它可以節約冷卻水的用量，尤其是在夏季，並能減少染菌的機會。耐高溫菌株所產生酶的熱穩定性較高，適用於一些特殊的工藝過程。耐高溫菌株也常採用此法篩選。將處理過的菌懸液在一定高溫下處理一段時間後再分離。對此溫度敏感的細胞被大量殺死，殘存的細胞則對高溫有較好的耐受性。 耐高濃度酒精的酵母菌的酒精發酵能力較高，也適宜提高發酵醪濃度，提高醪液酒精濃度。而耐高滲透壓的酵母菌株具有積累甘油的性能，可用於甘油發酵。耐高酒精度、高滲透壓的菌株也可分別在高濃度酒精或加蔗糖等造成的高滲環境下一次性篩選獲得。

2)階梯性篩選法 葯物抗性即抗葯性突變株可在培養基中加入一定量的葯物或對菌體生長有抑製作用的代謝物結構類似物來一次性篩選，大量細胞中少數抗性菌在這種培養基平板上能長出菌落。但是在相當多的情況下，無法知道微生物究竟能耐受多少高濃度的葯物，這時，葯物抗性突變株的篩選需要應用階梯性篩選法。 因為葯物抗性常受多位點基因的控制，所以葯物的抗性變異也是逐步發展的，時間上是漸進的，先是可以抗較低濃度的葯物，而對高濃度葯物敏感，經"馴化"或誘變處理後，可能成為抗較高濃度葯物的突變株。階梯篩選法由梯度平板或紙片擴散在培養皿的空間中造成葯物的濃度梯度，可以篩選到耐葯濃度不等的抗性變異菌株，使暫時耐葯性不高，但有發展前途的菌株不致於被遺漏，所以說，階梯性篩選法較適合於葯物抗性菌株的篩選，特別是在暫時無法確定微生物可以接受的葯物濃度情況下

5.6.3.3 組成酶變異株的篩選

許多水解酶是誘導酶，只有在含有底物或底物類似物的培養環境中，微生物才會合成這些酶類，所以，誘導酶的生產不僅需要誘導物，而且受到誘導物的種類、數量以及分解產物的影響。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）往往會引起酶合成的減少，誘導物有時又比較昂貴。這些都可能造成這些水解酶工業生產的波動以及生產成本提高。如果控制這些酶合成的調節基因發生了變異，誘導酶就可能轉變成組成酶，它的合成與細胞的其它組織蛋白一樣，不再需要誘導物的存在。由誘導型的出發菌株誘變篩選出組成型變異株對於水解酶的工業生產具有重要的現實意義。具體的篩選方法有恆化器法、循環培養法和誘導抑制物法。

1) 恆化器法 恆化器常被用於微生物的"馴化"。在培養基中添加不能起誘導作用的低濃度底物，接入處理後的菌懸液進行培養，此時出發菌株由於不能被誘導，無法合成有關的誘導酶而不能分解該底物，從而生長速率極慢，而群體中少數組成型變異株則可合成有關的酶，分解利用該底物，生長速率較快。為了提高組成酶變異株的優勢，即它在群體中的比例，可以應用恆化器培養技術。隨著恆化器培養中不斷加入新鮮基質而逐漸增大組成酶變異株的優勢，這樣就能夠比較容易地做進一步的純化分離。

2) 循環培養法 利用不含誘導物的培養環境和含有誘導物的培養環境進行交替循環培養待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。當接種到不含誘導物而含有其它可利用碳源的培養基中時，兩種類型菌株同樣能較好地生長，但在此環境中組成型突變株已能合成有關的水解酶，而誘導型菌株就不能合成。 進而將它們轉接入含誘導物的培養基中時，變異株能迅速利用誘導底物進行生長繁殖，而誘導型出發菌株需經歷一個誘導合成酶的階段，兩類菌株的生長就不同步了，隨著循環交替培養的繼續，組成酶變異株所佔的比例將逐漸增大。

3) 誘導抑制劑法 有些化合物能阻止某些誘導酶的合成，如α-硝基苯基-β-岩藻糖苷對大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的誘導合成有抑製作用，稱為誘導抑制劑。當在誘導物和誘導抑制劑同時存在的培養環境中培養待分離菌群時，誘導型菌株不能產生誘導酶，無法正常生長，只有組成型變異株能夠利用底物進行生長繁殖。

5.6.3.4高分子廢棄物分解菌的篩選 隨著石油化工和塑料工業的發展，各種高分子包裝廢棄物日益增多，這些"白色污染"在自然界很難被消化而進入物質循環。設法選育能分解利用這些高分子材料的微生物對於環境保護至關重要。這些高分子材料大多是不溶於水的，直接分離具有分解功能的微生物很困難。為此，有人設計了階段式篩選法，首先尋找能在與聚乙二醇結構相似的含兩個醚鍵的三甘醇上生長的微生物，接著，誘變篩選能分解聚乙二醇的變異株；或者篩選能以乙二醇、丙二醇為碳源的菌株，繼而誘變篩選出能利用聚乙二醇等物質的變異株。這種由簡單的聚合物單體入手逐級篩選高分子廢棄物分解菌也許是一條有效的篩選思路。

5.6.3.5無泡沫菌株及高凝聚性菌株的篩選 有些菌在發酵過程中會產生大量的泡沫，從而造成發酵液滿溢，增大了染菌的機會，使發酵體系反應不均勻，也有可能引起某些發酵產物的生物活性喪失，如蛋白酶變性失活。為了避免泡沫的產生，常常需通過犧牲發酵液的裝量或加入大量的消泡劑來消除泡沫的不利影響。發酵過程產生泡沫是菌體代謝、培養基和發酵工藝等方面的原因造成的，而菌種是產生泡沫的關鍵，選育無泡沫或少泡沫菌株可以從根本上解決泡沫問題。 有人用氣泡上浮法篩選出了無泡沫的酒精酵母。將變異處理後的菌懸液接種入生長培養基中，培養器皿的底部放置無菌壓縮空氣噴口，培養過程中不斷通入無菌空氣，形成鼓泡，易產生泡沫的酵母菌會隨泡沫而除去，留下的是不易產生泡沫的變異菌株；也有人用苯胺藍染色法進行篩選，將經過變異處理的菌懸液經培養後塗布在含葡萄糖3%、酵母膏0.5%、苯胺藍0.005%的平板上培養4天，出發菌株呈淺藍色，變異菌株因細胞壁成分和結構改變造成與染料結合力改變，少泡沫的變異菌株呈深藍色。 啤酒發酵和單細胞蛋白培養都希望由凝聚性較好的酵母菌株擔任發酵菌種，以便於啤酒的澄清和保持良好的風味，以及單細胞蛋白的收集。採用上述的泡沫上浮法也可以除去不易凝聚的細胞，通過改變鼓泡速度的調節，可以獲得具不同凝聚性的菌株。