㈠ 大腸桿菌的檢測方法
多管發酵法。
多管發酵法是一種檢測水體中大腸桿菌的傳統方法，這種方法是在44.5℃的含有熒光底物的培養基上連續培養24h，而後能產生分解熒光底物——葡萄糖醛酸酶，從而釋放出熒光產物，進而使培養基在紫外光照射下產生特徵熒光。此方法可被用來對原樣品中的菌落數作統計學估計。
在單料或雙料乳糖膽鹽發酵管內發酵，分離培養試驗，利用伊紅美藍培養皿分離，接著是在乳糖發酵管中進行二次發酵，最後通過芽孢染色、革蘭氏染色、顯微枝兄棗鏡觀察等來完成。多管發酵法對試驗條件要求不高，成本低，但是檢測時間較長，容易受其他條件干擾，進而影響到測定結果的精確度。猛拆
(1)大腸桿菌定量檢測方法實驗擴展閱讀：
注意事項：
1、檢樣時注意無菌操作。
2、稀釋時採用的稀釋液可以用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水，接種時可採用九管法，設置三個梯度，分別為0.1g/mL、0.01g/mL、0.001g/mL，每一個稀釋度的試管應充分混勻。
3、每次實驗需要有陰性對照。
4、使用小倒管培養基配製時，為排凈氣泡，滅菌時不要把塵唯試管的蓋子蓋的太緊，滅菌後注意觀察一下倒管中的氣體是否排完全、
5、高壓滅菌後等高壓滅菌鍋的壓力表達到0，取出培養基放到冰箱冷卻，效果會比較好。
㈡ 食品中大腸桿菌的檢測
用大腸桿菌顯色培養基，檢測原理：蛋白腖和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化鈉可維持均衡的滲透壓;瓊脂是培養基的凝固劑;十二烷基硫酸鈉抑製革蘭氏陽性菌;混合顯色底物分別與大腸菌群和大腸桿菌所對應的酶發生特異性反應，水解底物，釋放出顯色基團，在淡黃色平板上大腸菌群產生橙紅色的菌落，大腸桿菌產生藍綠色的菌落。
資料出自環凱官網。
㈢ 水中大腸桿菌的測定實驗步驟
1、配製培養基：在培養皿中配製伊紅美藍固體培養基。一式三到五份。
2、水樣稀釋：均勻稀釋。
3、接種並培養。
4、觀察每個培養皿中的大腸桿菌的菌落（在伊紅-美藍培養基上，大腸桿菌菌落特徵鮮明）數。取均值，即得實際值。這個菌落數就對應原水樣中大腸桿菌的個數。
㈣ 檢驗食品中的大腸菌群需要注意的實驗步驟有哪些
食品微生物學檢驗 大腸菌群計數：大腸菌群平板計數法（GB 4789.3-2010）
一 試劑和儀器
煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB肉湯）
結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）
恆溫培養箱
自動稀釋儀
均質器
振盪器
二 樣品處理
固體樣品應在無菌條件下充分粉碎。本次演示以乳粉為例，取密封狀態良好的試樣，備用待測。
三 檢測過程
實驗前准備
進入無菌操作室前應更換無菌實驗服，戴帽子、口罩、無菌手套。進入無菌操作室後，首先用鑷子夾取適量酒精棉全面擦拭雙手，然後才能進行實驗操作。
酒精易燃，因此在擦拭雙手的過程中應離開酒精燈火焰一定距離，防止出現危險，待手上的酒精揮發完全後，再進行實驗操作。
樣品的稀釋
取一潔凈無菌均質袋於自動稀釋儀上，用酒精棉充分擦拭樣品袋，將剪刀置於酒精燈外焰上充分灼燒，小心剪開樣品袋。將稱樣勺於酒精燈外焰灼燒片刻，准確稱取25g樣品於無菌均質袋中。用酒精燈外焰灼燒注水口片刻，在盛有樣品的均質袋中注入225mL無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液。取下均質袋，將均質袋放入拍擊式均質器中，用均質器拍打1min～2min，製成1:10的樣品勻液。
注意：樣品勻液的pH值應在6.5～7.5之間，必要時可用1 mol/L無菌氫氧化鈉或1mol/L無菌鹽酸溶液調節。
均質完畢後，做好標記，將均質袋置於樣品框中。
在裝有9mL生理鹽水的無菌試管上做好標記，用1mL無菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入裝有9mL生理鹽水的無菌試管中，稀釋前後試管口都應在酒精燈上灼燒片刻。加塞後於振盪器上混合均勻，製成1:100的樣品勻液。同理，按上述操作，依次製成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。稀釋樣品時，注意吸管或吸頭尖端不得觸及稀釋液面；每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。
接種及培養
在事先經滅菌處理的培養皿底部做好標記。根據對樣品污染狀況的估計，選取2～3個適宜的連續稀釋度。本次演示只做1:10和1:100的樣品稀釋液。
用無菌吸管吸取1:10樣品稀釋液1mL，加入到培養皿中，備用。同理，加入1:100稀釋液和空白液。注意，每個稀釋度應接種2個無菌培養皿，空白液即為以1mL生理鹽水代替1mL樣品稀釋液。
加完樣品梯度稀釋液後，即可傾倒培養基。傾倒前應將錐形瓶的瓶口在酒精燈上充分灼燒。灼燒後及時傾注15mL～20mL結晶紫中性紅膽鹽瓊脂於每個培養皿中，小心旋轉培養皿，將培養基與樣液充分混勻。傾注培養基時應將錐形瓶口盡量伸入培養皿內，防止傾倒時培養基掛在培養皿的內壁或外壁上，且傾倒過程應果斷，防止培養基沿錐形瓶外壁流出、滴落。培養基的溫度以46℃為宜，不能過高或過低，溫度過高不利於操作且對菌體有害，溫度過低培養基迅速凝固，菌體不能在培養皿內均勻的分布，導致菌落計數困難。轉動培養基時用力須均勻，防止培養基沾到培養皿上蓋或灑出。
倒完培養基後，靜置培養皿，等待培養基冷卻凝固。
待培養基凝固後，再加3mL～4mL 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂覆蓋平板表層。加兩次培養基的主要目的是：使菌體均在培養基內部生長，以便於觀察典型菌落形態。等待培養基冷卻凝固。待培養基凝固後，翻轉平板，置於培養箱中於36℃±1℃條件下培養18h～24h。
平板菌落計數
選取菌落數在15CFU～150CFU之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落，其中典型菌落的特徵為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉澱環，菌落直徑為0.5mm或更大。
證實實驗
先在煌綠乳糖膽鹽肉湯管上做好標注。將接種環置於紅外滅菌器中滅菌，再用接種環從結晶紫中性紅膽鹽瓊脂平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種於煌綠乳糖膽鹽肉湯管內，振搖均勻。每次接種後都應及時將接種環在滅菌器中滅菌。將接種完的煌綠乳糖膽鹽肉湯管置於培養箱中，於36℃±1℃條件下培養24h～48h。培養完畢後，觀察煌綠乳糖膽鹽肉湯管中產氣情況。凡管內倒管有氣泡者，即可報告為大腸菌群陽性。
㈤ 菌落總數大腸桿菌和致病菌的檢測方法
大腸菌群測定的操作細則
大腸菌群系指一群能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來於人畜糞便,故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量,推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。
食品中大腸菌群數系以100mL(g)檢樣內大腸菌群最可能數(MPN)表示。
1
設備和材料
1.1
溫箱：36±1℃。
1.2
冰箱:0～4℃。
1.3
恆溫水浴
:44.5±0.5℃。
1.4
天平。
1.5
顯微鏡。
1.6
均質器或乳缽。
1.7
平皿:直徑為90mm。
1.8
試管。
1.9
吸管。
1.10
廣口瓶或三角燒瓶:容量為500mL。
1.11
玻璃珠:直徑約5mm。
1.12
載玻片。
1.13
酒精燈。
1.14
試管架。
2
培養基和試劑
2.1
乳糖膽鹽發酵管:按GB
4789.28中4.9規定。
2.2
伊紅美藍瓊脂平板:按GB
4789.28中4.25規定。
2.3
乳糖發酵管:按GB
4789.28中4.10規定。
2.4
EC
肉湯:按GB
4789.28中4.11規定。
2.5
磷酸鹽緩沖稀釋液:按GB
4789.28中3.22規定。
2.6
生理鹽水。
2.7
革蘭氏染色液:按GB
4789.28中2.2規定。
3
操作步驟
3.1
檢樣稀釋
3.1.1
以無菌操作將檢樣25mL(或g)放於有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內予置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內,經充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質器,以8
000-10
000
r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。
3.1.2
用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內,振搖試管混勻,做成1:100的稀釋液。
3.1.3
另取1mL滅菌吸管,按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用1支1mL滅菌吸管。
3.1.4
根據食品衛生標准要求或對檢樣污染情況的估計,選擇三個稀釋度,每個稀釋度,接種3管。
3.2
乳糖發酵試驗
將待檢樣品接種於乳糖
膽鹽發酵管內,接種量在1mL以上者,用雙料乳糖膽鹽發酵管,1mL及1mL以下者,用單料乳糖膽鹽發酵管。每一稀釋度接種3管,置36±1℃
溫箱內,培養24±2h,如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣,則可報告為大腸菌群陰性,如有產氣者,則按下列程序進行。
3.3
分離培養
將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上,置36±1℃
溫箱內,培養18-24h,然後取出,觀察菌落形態,並做革蘭氏染色和證實試驗。
3.4
證實試驗
在上述平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1-2個進行革蘭氏染色,同時接種乳糖發酵管,置
36±1℃溫箱內培養24±2h,觀察產氣情況。凡乳糖管產氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌,即可報告為大腸菌群陽性。
3.5
報告
根據證實為大腸菌群陽性的管數,查MPN檢索表,報告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。
4
糞大腸菌群(faecal
coliform)
4.1
用接種環將所有產氣的乳糖膽鹽發酵管培養物(見3.2條)轉種於EC肉湯管內,置44.5±0.2℃水浴箱內(水浴箱內的水面應高於EC肉湯液面),培養24±2h,經培養後,如所有EC肉湯管均不產氣,則可報告為陰性;如有產氣者,則將所有產氣的EC肉湯管分別轉種於伊紅美藍瓊脂平板上,置
培養18-24h,凡平板上有典型菌落者,則證實為糞大腸菌群陽性。
4.2
結果報告
根據證實為糞大腸菌群的陽性管數,查MPN檢索表,報告每100mL(g)糞大腸菌群的MPN值。
㈥ 乳品中大腸桿菌檢測國標GB/T4789.38-2008的具體步驟及達標的標准
第一法大腸桿菌MPN 計數
操作步驟
6.1、 樣品的稀釋
6.1.1、 固體和半固體樣品：以無菌操作取259 樣品，置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌均質杯內，8000r / min ～1000r/ min 均質1 min～2 min ，製成l:10 樣品勻液，或置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min～2 min 製成1:10 的樣品勻液。
6.1.2、 液體樣品：以無菌吸管吸取樣品25 mL 置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的玻璃珠）中，充分振搖，製成1:10 的樣品勻液。
6.1.3、 樣品勻液的pH 值應在6.5～7.5 之間，必要時分別用1mol/L 氫氧化鈉（NaOH）或1mol/L 鹽酸（HCI）調節。
6.1.4、 用1mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1mL ，沿管壁徐徐注人盛有9 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管或吸頭反復吹打，使其棍合均勻，製成1:100 的樣品勻液。
6.1.5、 根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次製成10 倍遞增系列樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min 。
6.2、 初發酵試驗
每個樣品，選擇3 個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液）。每個稀釋度接種3 管月桂基磺酸鹽胰蛋白陳（LST ）肉湯，每管接種1 mL（如接種量超過1 mL ，則用雙料LST 肉湯）。36℃±1℃ 培養24h±2h ，觀察小倒管內是否有氣泡產生，如未產氣則繼續培養至48h±2h 。記錄在24h～48h 內產氣的LST 肉湯管數。如所有LST 肉湯管均未產氣，即可報告大腸桿菌MPN 結果；如有產氣者，則進行復發酵試驗。
6.3、 復發酵試驗
用接種環分別從所有培養48h±2h 內發酵產氣的LST 肉湯管中取培養物1 環，移種於已提前預溫至45 ℃ 的EC 肉湯管中，放人帶蓋的44.5℃ ±2 ℃ 水浴箱內。水浴的水面應高於肉湯培養基液面，培養24h±2h ，檢查小倒管內是否有氣泡產生，如未產氣則繼續培養至48h ±2h 。記錄在24h 和48h 內產氣的EC 肉湯管數。如所有EC 肉湯管均未產氣，即可報告大腸桿菌MPN 結果；如有產氣者，則進行EMB 平板分離培養。
6.4、 伊紅美藍平板分離培養
輕輕振搖各產氣管，用接種環取培養物劃線分別接種於EMB 平板，36 ℃ ±1 ℃ 培養18h～24h 。檢驗平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。
6.5、 營養瓊脂斜面或平板培養
從每個平板上挑5 個典型菌落，如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營養瓊脂斜面或平板上，36 ℃ ±1 ℃ ，培養18h～24h 。取培養物進行革蘭氏染色和生化試驗。
6.6 、生化試驗
6.6.1、 靛基質試驗：將培養物接種蛋白陳水，36 ℃±1℃ 培養24h±2h 後，加Kovacs 靛基質試劑0.2 mL～0.3 mL ，上層出現紅色為靛基質陽性反應。
6.6.2 、MR -VP 試驗：將培養物接種MR -VP 培養基，36 ℃ ±1 ℃ 培養48h±2h 。移取培養物1mL至13 mm×100mm 試管中，加5 % α-蔡酚乙醇溶液0.6mL、40 ％氫氧化鉀溶液0.2mL 和少許肌酸結晶，振搖試管後靜置2h ，如出現伊紅色，為VP 試驗陽性。
將MR 一VP 培養液的剩餘部分再培養48h 後滴加5 滴甲基紅指示劑。培養物變紅色，為甲基紅試驗陽性，若變黃色則為陰性反應。
6.6.3、 檸檬酸鹽利用試驗：將培養物接種Koser 氏檸檬酸鹽肉湯，36℃±1 ℃ 培養96h±2h,記錄有無細菌生長。
6.7、 大腸桿菌MPN 計數的報告
大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，發酵乳糖、產酸、產氣，IMViC 生化試驗為＋＋- -或-＋- -。只要有1 個菌落鑒定為大腸桿菌，其所代表的LST 肉湯管即為大腸桿菌陽性。依據LST 肉湯陽性管數查MPN 表，報告每克（或毫升）樣品中大腸桿菌MPN 值。
第二法大腸桿菌VRB - - MUG 平板計數法
8、樣品稀釋
按6.1 進行。
9、 檢驗
選取2 個～3 個適宜的連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度分別取1 mL 注人兩個無菌平皿。另取1 mL 稀釋液注人一個無菌平皿中，作空白對照。將45 ℃±0.5 ℃ 的VRB 瓊脂10 mL～15 mL 傾注於每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固後，再加3 mL～4mL VRB-MUG 瓊脂覆蓋平板表層。凝固後翻轉平板，36 ℃±1 ℃ 培養18h～24h 。選擇菌落數為10～ 100 的平板，暗室中360 nm～366 nm 波長紫外燈照射下，計數平板上發淺藍色熒光的菌落。
檢驗時用已知MUG 陽性菌株（如大腸桿菌ATCC 25922 ）和產氣腸桿菌（如ATCC 13048 ）做陽性和陰性對照。
10、 大腸桿菌平板計數的報告
兩個平板上發熒光菌落數的平均數乘以稀釋倍數，報告每克（或毫升）樣品中大腸桿菌數，以CFU/g ( CFU /mL ）表示。
第三法大腸桿菌PetrifilmTM 測試片計數法
12、 樣品稀釋按6.1 進行。
13、 檢驗
13.1、 接種和培養
選取2 個～3 個適宜的連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種兩張測試片。將測試片置於平坦實驗檯面，。揭開上層膜，用吸管吸取樣品勻液1ml勻液垂直滴加在測試片的中央，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產生和上層膜直接落下，將壓板（平面底朝下）放置在上層膜中央處，輕輕地壓下，使樣品勻液均勻覆蓋於圓形的培養膜表面，切勿扭轉壓板。拿起壓板，靜置至少1 min 以使培養基凝固。將測試片的透明面朝上置於培養箱內，堆疊片數不超過20 片，36℃±1 ℃ 培養。肉、家禽和水產品，培養時間為24h±2h；其他食品，培養時間為48h±2h 。
13.2、 判讀
可肉眼觀察計數，或用菌落計數器、放大鏡、PetrifilmTM 自動判讀儀計數。藍色有氣泡的菌落確認為大腸桿菌，不論藍色的深淺，部分藍色的帶氣泡菌落也判定為大腸桿菌。圓形培養膜邊緣及邊緣以外的菌落不計數。當測試片出現大量氣泡、不明顯的小菌落，培養區呈藍色時，需要進一步稀釋樣品勻液，重新檢驗。 14 大腸桿菌測試片計數的報告
選擇菌落數在15～150 之間的稀釋度，兩張測試片菌落平均數乘以稀釋倍數，即為每克（或毫升）樣品中大腸桿菌數，以CFU/g ( CFU/mL ）表示。
如果所有稀釋度測試片上的菌落數都小於15 ，計數最低稀釋度測試片上的平均菌落數乘以稀釋倍數報告；如果所有稀釋度的測試片上均無菌落生長，以「小於1 乘以最低稀釋倍數」報告；如果所有稀釋度的菌落數都大於150 ，計數最高稀釋度測試片上的平均菌落數乘以稀釋倍數報告。計數菌落數大於150 個的測試片時，可計數一個或兩個具有代表性的方格內的菌落數，換算成單個方格內的菌落數後乘以20 ，即為測試片上估算的菌落數（圓形生長面積為20 cm " ）。
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