葯材基因檢測方法

1. 中葯指紋圖譜的構建方法

目前，中葯指紋圖譜技術已涉及眾多方法，包括薄層掃描（TLCS）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和高效毛細管電泳法（HPCE）等色譜法以及紫外光譜法（UV）、紅外光譜法（IR）、質譜法（MS）、核磁共振法（NMR）和X—射線衍射法等光譜法。其中色譜方法為主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成為公認的三種常規分析手段。由於HPLC具有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高、分析速度快、應用范圍廣等特點；中葯成分絕大多數可在高效液相色譜儀上進行分析檢測，且積累較豐富的應用經驗。因此高效液相色譜法已成為中葯指紋圖譜技術的首選方法。隨著HPLC— MS和GC—MS等聯用技術的應用，中葯指紋圖譜技術更趨完善。
1 薄層色譜法（TLC） 薄層色譜具有選用范圍廣,重現性好等優點，常用於中葯各種成分的鑒別。用固定波長對薄層展開的各斑點作薄層掃描圖譜比目測的層析圖譜更為客觀准確，因而具有更好的指紋鑒別意義。但由於受薄層板的質量和開放式層析系統等外界因素的影響，易引起一定的實驗誤差。
2 氣相色譜法 (GC) 氣相色譜是封閉性色譜，受外界影響較少，具有高性能、高選擇性、高靈敏度等優點，適合於葯材及制劑中揮發性成分指紋圖譜的研究。一般使用質量型檢測器-氫火焰離子化檢測器（FID）。錢浩泉等[5]用氣相色譜法建立了高良姜及其邊緣植物揮發油成分的指紋圖譜。具體應用中多與質譜聯用，不僅具有 GC 的高分離效能，而且兼備了質譜鑒定的高靈敏度和准確性。
3 高效液相色譜法 (HPLC) 高效液相色譜具有分離效率高，分析速度快，定量精密度高，檢測器種類多，穩定性好等特點。不受樣品揮發度和熱穩定性的限制，比氣相色譜法應用范圍更廣，樣品中大多數成分均可在高效液相色譜儀上進行分析檢測，是構建指紋圖譜的主要方法之一。由於中葯成分的復雜性，構建指紋圖譜一般採用梯度洗脫，因為逐步提高流動相洗脫能力可獲得較多色譜峰，提供更多指紋信息。在考察條件時，要對指標成分和非指標成分都予以考慮，由於葯材中各種成分的吸收波長及對不同檢測器的響應不同，在構建指紋圖譜時也需要加以考慮。實際應用中多使用多種聯用技術，充分利用各檢測器的互補性，從不同角度反映葯材及制劑的全貌，從各種圖譜中得到結構信息。
4 高速逆流色譜法 (HSCCC) 它是目前國際上較新型的液－液分配色譜技術，利用相對移動的兩種互不相溶溶劑，在處於動態平衡的兩相中將具有不同分配比的組分分離。已有報道[6]將 HSCCC應用於生物鹼、黃酮、木脂素、蒽醌等天然產物的分離分析。具有分離效率高，溶劑用量少，無吸附，樣品回收率高,重現性好和適用范圍廣等優點。
5 高效毛細管電泳法 (HPCE) 高效毛細管電泳技術是以高壓電場為驅動，毛細管為分離通道，依據樣品中各組分淌度和分配行為上的差異而實現高效快速分離的新型電泳技術。毛細管電泳的廣泛應用取決於其多變的分離模式，幾乎涉及分析化學中所有的分離對象，小到無機離子，大到蛋白質和高分子聚合物，也能夠分析不帶電荷的中性物質[7]。具有所需樣品少、溶劑消耗少、抗污染能力強、可直接分析水溶液等優點。其中毛細管區帶電泳 (CZE) 和膠束電動毛細管電泳色譜 (MECC) 是中草葯分析中最常見的兩種模式。但該方法的重現性有待提高。
6 紫外可見光譜 (UV) 紫外可見光譜反映不同化學物質的電子共扼體系特徵，具有加和性，對於混合物的鑒別專屬性差，解析度低，故紫外光譜很少用於指紋圖譜的構建。
7 紅外光譜和近紅外光譜 (IR) 紅外光譜是由分子的振動－轉動能級躍遷產生的光譜，紅外光譜具有高度的特徵性。近紅外光譜法在中葯質量控制方面有較好的應用前景。
8 核磁共振法 (NMR) 從純有機化合物的核磁共振氫譜上可獲得結構信息，包括各類質子的化學位移、數量核偶合關系。核磁共振譜具有高度的重現性和特徵性，易於解析和進一步研究，可評價葯材和中成葯質量的均一性和穩定性。
9 質譜法 (MS) 將中葯提取液置質譜儀中進行電子轟擊電離，可獲得提取液中化學成分的質譜指紋譜，不同中葯提取液所含成分不同，所得質譜圖顯示的分子離子峰及進一步，裂解碎片峰不一致，可供鑒別。
10 X射線衍射法 物質被X射線照射可產生不同程度的衍射現象，只要某一混合物的組成是恆定的，其衍射圖譜可以作為該混合物的特徵圖譜。該法具有圖譜指紋專屬性強，信息量大,所需樣品量小等諸多優點，X射線衍射法在動物類葯材鑒定與辨別中有獨特的優勢[8]。
11 分子生物學法 (DNA) 利用聚合酶鏈反應從不同生物樣品中人工合成 DNA片斷，而這種 DNA片斷的大小、數目可因不同的生物而異，故稱之為 DNA指紋圖譜。該技術具有重復性好、靈敏度高的優點。限制性內切酶片段長度多態性（RFLP）是最常用的構建 DNA指紋圖譜的方法，但該法費時費力，應用受到限制。隨機擴增多態 DNA（RAPD）標記，可以在特異 DNA序列尚不清楚的情況下，檢測DNA的多態性，這是構建中葯指紋圖譜的新方法，具有極好的應用前景。 羅志勇等[9]採用 RFLP技術,分析了人參、西洋參基因 DNA指紋圖譜。

2. 中國葯典的特點

《中國葯典》2015年版第一個重要特點是，將上一版葯典中葯、化學葯、生物製品三部分別收載的附錄(凡例、制劑通則、分析方法、指導原則、葯用輔料等)三合一，獨立成卷作為第四部(收載通則總數317個，其中制劑通則38個，檢測方法240個，指導原則30個，標准物質和對照品相關通則9個;葯用輔料收載270種，其中新增137種、修訂97種)，制定了統一的技術要求，以解決長期以來各部葯典收載的方法、通則重復收錄，不協調、不統一、不規范等不足，使分類更加清晰明確，葯典標准更加系統化、規范化。
同時，擴大現代分析技術的應用，進一步將先進、成熟的檢測技術應用到葯品檢驗中，建立了靈敏度高、專屬性強、穩定性好的檢測方法。比如，為加強對中葯材殘留農葯的控制，完善了原有的氣相色譜法，將農葯殘留檢測種類由原來的9種增加到可以檢測22種;建立氣相色譜-串聯質譜法和液相色譜-串聯質譜法，將可檢農葯殘留種類能力提高到229種。此外，還增加了國家葯品標准物質、葯包材通則和指導原則，形成了涵蓋原料葯及其制劑、葯用輔料、葯包材和標准物質的葯品標准體系。
第二個特點是增加了檢測葯品的限量指標，進一步提升了葯品安全保障水平。
在中葯方面，《中國葯典》2015年版系統構建了中葯安全性控制體系，控制范圍涵蓋了二氧化硫殘留、重金屬及有害元
2、彰顯四大特點
素、農葯殘留量、真菌毒素、色素、內源性有害物質、微生物、致病菌等;完成了67個中成葯薄層色譜檢測項中展開劑中毒性溶劑的替換工作;制定了中葯材及飲片中二氧化硫殘留量限度標准;建立了珍珠、海芹等海洋類葯物標准中有害元素限度標准;制定了人參、西洋參標准中增加有機氯等16種農葯殘留的檢查;對柏子仁等14味易受黃麴黴毒素感染葯材及飲片標准中增加了「黃麴黴毒素」檢查項目，並制定相應的限度標准等。
在化學葯方面，加強雜質定性和定量測定方法的研究，實現對已知和未知雜質的區別控制，優化了抗生素聚合物測定方法;設定合理的控制限度;加強對包括催化劑在內的無機雜質檢測方法的研究與修訂，提高了方法的准確性，如雷米普利原料葯中採用原子吸收光譜法對合成工藝中使用的催化劑鈀進行檢查;針對劑型特點設置了安全性項目，如靜脈輸液及滴眼液的滲透壓控制，大輸液增加細菌內毒素檢查，乳狀注射液增訂乳粒大小檢查等。
在生物製品方面，增加了單克隆抗體總論、疫苗總論和生物技術產品總論，增訂「生物製品生產用原輔材料質量控制通用性技術要求」;制定了產品關鍵指標限度，如疫苗製品增訂滲透壓摩爾濃度檢測，生產用種子批規定進行基因序列測定;加強有機溶劑殘留以及產品中雜質的控制，建立了生產用宿主細胞DNA和蛋白殘留量檢測方法及其限度。
特點之三是增設了專屬性檢驗項目設定，葯品有效性控制能力進一步加強。
在中葯方面，《中國葯典》2015年版對部分中葯材增加了顯微鑒別檢查;對中葯材加強了專屬性鑒別和含量測定，如採用LC-LC-MS對膠類葯材進行鑒別，採用PCR檢測方法對川貝進行鑒別檢查，對某些中葯材增加特徵氨基酸的含量測定等;對六味地黃丸系列品種建立了主要成分-莫洛苷的檢測方法;建立了丹參、沉香、棗仁安神膠囊等30多個應用指紋特徵圖譜等。
在化學葯方面，增加了對制劑有效性指標的設置;完善溶出度和釋放度檢查法，加強對常釋口服固體制劑和緩控釋制劑有效性的控制;加強腸溶制劑釋放度和耐酸力、治療胃酸葯品的制酸力的控制;增加了難溶性晶型原料葯的粒度、注射劑的復溶時間等指標的控制;加強專屬性強、適用性廣的方法學研究用於制劑含量測定;加強了與放射性葯品活性相關的檢查方法研究和增訂。
在生物製品方面，進一步提高了效力測定方法的規范性、准確性和可操作性。

特點之四是完善了葯用輔料標准，進一步提高了葯物制劑質量。《中國葯典》2015年版新增葯用輔料品種139個，修訂95個，收載總數達270個，收載品種增加105%，修訂數量占總品種的70%，覆蓋面廣泛。如收載了聚山梨酯80(供注射用)、聚乙二醇300、聚乙二醇400以及可溶性澱粉、二氧化碳、活性炭等適用范圍廣泛的輔料。

3. 利用RAPD可以鑒定兩個物種嗎又是怎樣鑒定的

可以

隨機擴增多態性 DNA( RAPD) （ random amplified polymorphic DNA ）和任意引物 PCR(AP-PCR) （ arbitrary primer PCR ）

RAPD （ random amplified polymorphic DNA ）是 1990 年美國杜邦公司科學家 J. G. K. Williams 和加利福尼亞生物研究所 J. Welsh 領導的兩個小組幾乎同時發展起來的一項新技術。 Williams 稱之為 RAPD （ random amplified polymorphic DNA ） ， Welsh 稱之為 AP-PCR （ arbitrary primer PCR ）。 RAPD 技術建立在 PCR 技術基礎上，它是以任意序列的寡核苷酸單鏈 ( 通常為 10 個鹼基， AP-PCR 則為 20 ～ 30 個鹼基 ) 為引物，對所研究的基因組 DNA 進行隨機擴增。 RAPD 所用的一系列引物的 DNA 序列各不相同，但對於任一引物，它同基因組 DNA 序列有特定的結合位點。這些特定的結合位點在基因組某些區域內的分布如符合 PCR 擴增的反應條件，即在一定范圍內模板 DNA 上有與引物互補的反相重復序列時，就可擴增出此范圍的 DNA 片段。在不同物種基因組 DNA 中，這種反相重復序列的數目和間隔的長短不同，就可導致這些特定的結合位點分布發生相應的變化，而使 PCR 擴增產物增加、減少或發生分子量的變化。 通過對 PCR 產物的檢測和比較，即可識別這些物種基因組 DNA 的多態片段。

與常規 PCR 相比， RAPD 主要有以下特點： ① 無需專門設計 RAPD 擴增反應的引物，也無需預知被研究的生物基因組核苷酸順序，引物是隨機合成或是任意選定的。引物長度一般為 9 ～ 10 個寡核苷酸。 ② 每個 RAPD 反應中，僅加單個引物，通過引物和模板 DNA 鏈隨機配對實現擴增，擴增沒有特異性。 ③ 退火溫度較低，一般為 36℃ ，這能保證短核苷酸引物與模板的穩定配對，同時也允許了適當的錯誤配對，以擴大引物在基因組 DNA 中配對的隨機性。 ④ 較之常規 PCR ， RAPD 反應易於程序化。利用一套隨機引物，得到大量 DNA 分子標記，可以藉助計算機進行系統分析。

該方法已被廣泛用於遺傳指紋作圖、基因定位、系統進化以及動植物、微生物物種及中葯材的鑒定等各個領域。在生葯鑒定方面，該方法在人參及其偽品、甘草、黃連、冬蟲夏草及其偽品、貝母等葯材的鑒定中有應用。

http://bioop.com/html/bioarticle/2006110114766.html

http://q.163.com/waitfor/blog/guochy163/54722472007112103349404/

4. 高通量葯物篩選的簡介

1. 化合物樣品庫
化合物樣品主要有人工合成和從天然產物中分離純化兩個來源。其中,人工合成又可常規化學合成和組合化學合成兩種方法。
2.自動化的操作系統
自動化操作系統利用計算機通過操作軟體控制整個實驗過程。操作軟體採用實物圖像代表實驗用具，簡潔明了的圖示代表機器的動作。自動化操作系統的工作能力取決於系統的組分，根據需要可配置加樣、沖洗、溫解、離心等設備以進行相應的工作。
3.高靈敏度的檢測系統
檢測系統一般採用液閃計數器、化學發光檢測計數器、寬譜帶分光光度儀、熒光光度儀等。
4.資料庫管理系統
資料庫管理系統承擔4個方面的功能: 樣品庫的管理功能;生物活性信息的管理功能; 對高通量葯物篩選的服務功能; 葯物設計與葯物發現功能。 常用的篩選模型都在分子水平和細胞水平，觀察的是葯物與分子靶點的相互作用，能夠直接認識葯物的基本作用機制。
1.分子水平的葯物篩選模型:受體篩選模型;酶篩選模型;離子通道篩選模型
1.1受體篩選模型:指受體與放射性配體結合模型。以受體為作用靶的篩選方法,包括檢測功能反應、第二信使生成和標記配體與受體相互作用等不同類型。
1.2酶篩選模型:觀察葯物對酶活性的影響。根據酶的特點,酶的反應底物,產物都可以作為檢測指標,並由此確定反應速度。典型的酶篩選包括1) 適當緩沖液中孵化;(2)控制反應速度,如:溫度,緩沖液的pH值和酶的濃度等;(3)單時間點數器, 需測量產物的增加和底物的減少。
1.3離子通道篩選模型: (1)貝類動物毒素的高通量篩選,其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素結合位點，用放射性配體進行競爭性結合試驗考察受試樣品。(2)用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子，尋找新型鈣通道拮抗劑。
2.細胞水平葯物篩選模型
觀察被篩樣品對細胞的作用,但不能反映葯物作用的具體途徑和靶標,僅反映葯物對細胞生長等過程的綜合作用。包括: 內皮細胞激活; 細胞凋亡; 抗腫瘤活性; 轉錄調控檢測; 信號轉導通路; 細菌蛋白分泌; 細菌生長。
高通量篩選技術與傳統的葯物篩選方法相比有以下幾個優點:反應體積小；自動化；靈敏快速檢測；高度特異性。但是，高通量篩選作為葯物篩選的方法,並不是一種萬能的手段，首先，高通量篩選所採用的主要是分子、細胞水平的體外實驗模型，任何模型都不可能充分反映葯物的全面葯理作用；其次，用於高通量篩選的模型是有限的和不斷發展的，要建立反映機體全部生理機能的理想模型，也是不現實的。但我們應該相信，隨著對高通量篩選研究的深入，隨著對篩選模型的評價標准、新的葯物作用靶點的發現以及篩選模型的新穎性和實用性的統一，高通量篩選技術必將在未來的葯物研究中發揮越來越重要的作用。 光學測定技術。美、英兩國研究人員在高通量篩選檢測中，努力進行了光學測定方法的研究，建立了大量的非同位素標記測定法，如用分光光度檢測法篩選蛋白酪氨酸激酶抑制劑、組織纖溶酶原激活劑等，均獲得成功。
放射性檢測技術。美國學者GanieSM在高通量葯物篩選研究中，應用放射性測定法，特別是親和閃爍（SPA）檢測方法，使在96孔板上進行的樣本量實驗得到發展。該方法靈敏度高，特異性強，促進了高通量葯物篩選的實現，但存在環境污染問題。
熒光檢測技術。美國學者GiulianokA研究認為，採用FLIPR（fluor ometricimaging readet）熒光檢測法，可在短時間內同時測定熒光的強度和變化，對測定細胞內鈣離子流及測定細胞內pH和細胞內鈉離子流等，是非常理想的一種高效檢測方法。
多功能微板檢測系統。由西安交通大學葯學院研製的1536孔板高通量多功能微板檢測系統，是國際上先進的高通量檢測系統，它可使篩選量進一步提高，現已在該院投入使用。
1．基本原理
高通量葯物篩選技術是將多種技術方法有機結合而形成的新的技術體系，它以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統執行實驗過程，以靈敏快速的檢測儀器採集實驗數據，以計算機對實驗獲得的數據進行分析處理。它的正常開展需要有一個高容量的化合物庫、自動化的操作系統、高靈敏度的檢測系統、高效率的數據處理系統以及高特異性的葯物篩選模型。
1.1 化合物樣品庫
高通量篩選是一種利用已有的化合物進行的體外隨機篩選。因此通過高通量葯物篩選發現先導化合物(leading compounds)的有效性取決於化合物樣品庫中化合物的數量及其質量。化合物樣品的數量是指不同樣品的數量。化合物樣品的質量主要由化合物結構的多樣性決定的。許多活性反應基團(reactive groups)使初篩的假陽性大量增加，剔除這些化合物可以提高化合物樣品庫的質量。
化合物樣品主要有人工合成和從天然產物中分離純化兩個來源。
人工合成又可分為常規化學合成和組合化學合成兩種方法。採用常規化學合成的純化合物一直是國外製葯企業建立化合物樣品庫的主要來源。它們通過長年積累的化合物建立化合物樣品庫，通過購買和化合物交流使化合物樣品庫的數量和質量大幅度提高。
組合化學(combinatorial chemistry)的出現為大量增加化合物的數量提供另外一種來源。組合化學的基本原理是採用適當的化學方法，在特定的分子母核上加入不同的基團，在同樣條件下，產生大量的新化合物。這種方法在化合物的結構改造和優化方面已經表現出強大的優勢。但是，由於該方法是基於母核結構的改造，因此產生的大量化合物在結構多樣性方面尚有極大的不足。解決組合化學產物結構多樣性的問題，已經成為化學研究人員的研究課題。
從天然產物中分離出來的化合物，母核結構和活性基團是長期的自然選擇形成的，它們通過高通量篩選所表現出來的生物活性在葯物發現中具有人工合成化合物所不能比擬的優勢。因此，增加樣品庫中具結構多樣性的天然化合物及其衍生物是提高樣品庫質量的一個重要途徑。跨國制葯企業為了增加高通量篩選的陽性率，已經或正在尋求助買我國的天然產物單體。
1.2 自動操作系統
高通量葯物篩選每天要對數千化台物樣品進行檢測，工作枯燥、步驟單一，人工操作容易疲勞、出錯。自動化操作系統採用微孔板作為反應容器，具有固定的分布模式(format)；不同的微孔板通過條形碼加以標記。自動化操作系統通過光電閱讀器對特定的微孔板上的特定位置進行操作，並將操作結果及相關數據存貯在計算機內，使篩選結果准確，實驗過程快速。
自動化操作系統編程過程簡潔明了，可操作性強。自動化操作系統的工作能力取決於系統的組成都分，根據需要可配置加樣、沖洗、溫解、離心等設備以進行相應的工作。
除了實驗步驟的需要以外，自動化的加樣方式是決定篩選速度的重要因素。主要有單孔、8孔、96孔、384孔等幾種方式。單孔一般用於對照樣品以及復篩中零散樣品的轉移。96孔、384孔在酶活性檢測以及需同時開始、同時終止反應的篩選模型中是必需的。
自動化操作系統的一個重要組成部分是堆棧(hotel)。所謂堆棧是指在操作過程中用來放置樣品板、反應板以及對它們進行轉移所需的騰挪空間。因此，高通量篩選的樣品數量取決於堆棧的容量。
由此可見，高通量葯物篩選的自動化操作系統由計算機及其操作軟體、自動化加樣設備、溫孵離心等設備、堆棧4個部分組成。不同的單位可根據主要篩選模型類型、篩選規模選購不同的部分整合成為一個完整的操作系統。
1.3 檢測系統
快速、高靈敏度的檢測技術是高通量葯物篩選的關鍵技術之一。檢測儀器靈敏度的不斷提高，即使對微量樣品的檢測，也可以得到很好的檢測效果。
1.3.1 液閃計數 放射性同位素廣泛用於受體結合測定、細胞毒性、細胞增殖實驗、葯物代謝示蹤以及基因分析中。由於採用了雙光電倍增管及時間分辨偶合迴路(time-resolved coincidence circuit)技術，有效地降低了背景信號的干擾，使測定靈敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析檢測中，背景信號可控制在10cpm左右。
親和閃爍分析(scintil1ation proximity assay，SPA)是一種新的液閃分析法。該方法在細胞表面受體葯物篩選中應用較為普遍。在高通量篩選測定細胞表面受體親合結合作用時，放射配體標記濾過分析技術由於需要進行分離，現已被親合閃爍分析所取代。親合閃爍分析技術通過親合結合，將放射性配基結合到具有受體的閃爍球上，從而產生光子，減少了放射配體標記分析中的游離配基與結合配基的分離過程，使得放射配基分析可完全以自動化的方式進行，適於進行高通量篩選。產生低能量放射粒子的同位素可被用來進行放射性標記，而這種低能量放射粒子在短距離內可被重吸收，以確保只有結合到受體表面的配基才被檢測到。SPA技術被廣泛的應用到激酶、核酸處理酶分析以及受體配體的相互作用分析中。
1.3.2 分光光度法 為了適應高通量葯物篩選，許多公司都生產了具備計算機介面並能對多孔板進行同時檢測的分光光度計。以Molecular Device公司的spectra 190為例，它採用8條光導纖維同時對8孔進行測定。測定波長以2nm為間隔，可以在190nm一850nm間進行選擇。對未知物質，可在該范圍內進行掃描以確定其特徵吸收光譜。因此，大大增加了建立模型的多樣性。檢測數據以不同文件格式輸出，可用隨機軟體或通用數據處理軟體進行處理。方便、快速、准確、自動化程度高。分光光度法高靈敏儀器同自動化操作系統的連接，使得基於紫外、可見光譜的高通量葯物篩選模型成為主要模型種類。
1.3.3 化學發光檢測 化學發光指生色物質在酶促作用下，化學能以光子的形式釋放出來。化學發光根據發光的形式和種類分為輝光型和閃光型發光兩種。輝光型化學發光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等為基礎的發光反應。其發光時間較長且穩定。而以發光蛋白、ATP、熒光素酶等為底物的發光反應則是閃光型發光反應，其發光時間較短。由於時間分辨及偶合迴路技術的使用，對於背景的去除更為有效，使得化學發光的檢測靈敏度達到0.1pg數量級。在單孔多點噴射技術中，用於檢測化學發光的光導纖維末端帶有一噴頭，用來加入反應性底物。反應性底物從100個小孔噴出，使反應性底物加入孔中後即可均勻混合。發光反應同時啟動後，可立即進行測定，對於閃光性化學發光的測定更為有利。
1.3.4 激發熒光檢測 新型激發熒光檢測儀在傳統儀器的基礎上，用連續的激發光諧和測定光譜取代固定光譜，使模型的建立更具備靈活性。熒光檢測方法靈敏是因為多數熒光基團都有短暫的半衰期，即使用較弱的激發光源也能獲得大量的光子流。這種特性以及多種可採用的熒光模式，使得熒光檢測技術成為高通量篩選必不可少的應用手段。熒光技術在均相篩選分析中廣為應用。其中，包括熒光共振能量轉移(FRET)，熒光偏振(FP)，時間分辨熒光(TRET)以及熒光相關譜(FCS)等技術。
1.4 資料庫管理系統
高通量葯物篩選的特點是對數以萬計的化合物樣品進行多模型的篩選。與高通量葯物篩選相適應的資料庫管理系統主要承擔4個方面的功能。
樣品庫的管理功能：化合物樣品庫對進行高通量葯物篩選的化合物樣品的各種理化性質進行存儲管理。對每一個新入庫的化合物進行新穎性分析，排除結構雷同的化合物，避免不必要的篩選。由於高度反應性基團增加了假陽性出現的機率，樣品庫對新入庫的化合物進行反應基因檢測以去除這類化合物。
生物活性信息的管理功能：生物活性庫存貯每一化合物經過不同模型檢測後的結果，並根據多個模型的檢測結果對化合物的生物活性進行綜合評價。
對高通量葯物篩選的服務功能：高通量葯物篩選的工作量大，自動化程度高，也涉及到許多繁瑣的工作。高通量葯物篩選資料庫管理系統對與葯物篩選相關的業務往來通訊、檔案管理以及各種樣品標簽的列印進行管理，使高通量葯物篩選的各個環節程序化、標准化。
葯物設計與葯物發現功能：高通量葯物篩選產生大量的化合物結構信息，隨著篩選的進行，生物活性信息也特大幅度提高。高通量葯物篩選資料庫管理系統通過對同一模型不同的呈現陽性反應的化合物結構進行分析，找出其構效關系，從而為葯物設計提供參考。
1.5 篩選模型
是指用於檢測葯物作用的實驗方法。由於高通量篩選要求反應總體積小，而且，反應具有較高特異性和敏感性，因此對於篩選模型也要求較高。這些模型主要集中在受體、酶、通道以及各種細胞反應方面。基因水平的葯物篩選模型，使葯物篩選模型的范圍更為廣泛。
1.5.1 以酶為靶的高通量篩選 以酶為作用靶的高通量篩選方法，絕大多數是直接檢測酶活性。具體方法根據酶的不同而不同，主要有基於放射性的方法和基於比色、熒光的方法兩大類。
基於放射性的方法多是將底物標記，測定放射性產物的生成。Taft等建立了(1,3)β-葡聚糖合酶抑制劑(抗真菌)的高通量篩選方法。將含有酶的菌絲提取物、α-澱粉酶和UDP-14C-葡萄糖加入96孔板的孔中，溫孵、反應。終止反應後，濾去未被合成進入的底物。閃爍計數檢測濾器上保留的(1,3)β-葡聚糖，指示酶活性大小。
也有將酶標記，測定被特異結合的酶的方法。Vollmer等建立了一種以青黴素結合蛋白(PBP)為靶的抗生素的高通量篩選方法。PBP既是糖基轉移酶又是肽轉移酶，該法是篩選其糖基轉移結構域的活性位點上的可結合物。將莫諾黴素(moenomycin)結合於一種小球上，製成混懸液，加入96孔板，然後加入3H標記的PBP(細菌膜粗提物)和受試化合物，孵育、過濾去掉非結合的放射性，閃爍計數測得的放射性指示PBP與莫諾黴素結合的情況及受試化合物對其影響。
另外，基於放射性而無需過濾分離的SPA也有應用。Brown等建立了內源性肽酶的水解活性檢測方法，用以研究其抑制劑。用3H標記的肽底物，通過生物素(biotin)與抗生物素蛋白(avidin)包裹的SPA閃爍球相連。酶解使3H隨肽的斷裂而離開閃爍球。測定3H放射性作用於閃爍球產生的閃爍信號的丟失量，即指示酶活性大小。
基於比色、熒光等的方法有一些報道。Waslidge等建立了脂氧合酶抑制劑的篩選方法。酸性條件下，脂的過氧化物能把Fe2+氧化為Fe3+，然後氧化二甲酚橙(xylenol orange)，產物在可見光區620nm有強烈吸收。在96孔板上測定。Zhang等建立了HIV逆轉錄酶抑制劑(抗病毒葯物)的高通量篩選方法。方法使用了「同質時間分辨熒光」(homogenous time resolved fluorence，HTRF)技術，既實現了非分離操作(同質)，又避免了放射性同位素的使用。該方法基於逆轉錄酶能很容易地將核苷酸類似物(如生物素-11-dUTP)引入新生DNA鏈。在96或384孔板上，將生物素化的引物/模板與抗生蛋白鏈菌素-銪在板孔中混合孵育，加入逆轉錄酶，再加入生物素-dUTP和d-TTP混合物啟動反應。反應60min後，加入鏈親和素-別藻藍蛋白(streptavidin-allophycocyanin)，孵育，用HTRF分析儀讀取數據。該法也可用於多種其他的核酸聚合酶。
1.5.2 以受體為靶的高通量篩選 以受體為作用靶的高通量篩選方法。檢測功能反應的優點是易於區分激動劑和拮抗劑。經典的功能檢測方法通量低，而引入基於重組技術的報告基因檢測方法極大地提高了篩選通量，既高效且節省成本。檢測第二信使或下游機制如磷酸化，傳統方法也比較麻煩，不適於高通量檢測，但將這些機制與報告基因相偶聯則能克服。
1.5.3 以離子通道為靶的高通量篩選 Negri等建立了貝類動物毒素的高通量篩選方法。其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素(STX)結合位點，用放射性配體(3H-STX)進行競爭性結合試驗考察受試樣品。Yong等用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子，尋找新型鈣通道拮抗劑。
1.5.4 以核酸為靶的高通量篩選 Hamasaki等建立了以16S rRNA編碼區結構和HIV-RRE RNA結構為靶的抑制劑的高通量篩選方法。尋找類似氨基糖甙類抗生素而親和力更高或作用於相同核酸的其他位點的新化合物，以及不易被代謝失活的新化合物。方法基於當含芘的氨基甙類似物結合於RNA時，芘的熒光被淬滅的原理。在96孔板上，將芘碳醯巴龍黴素(PCP)，RNA結構配成溶液後加入有受試化合物的板孔中，用熒光讀板器考察熒光恢復的程度。
1.5.5 以細胞功能為基礎的高通量篩選
1.5.5.1 內皮細胞激活 內皮細胞激活是急慢性炎症過程中重要的組成環節。Rice等以E選擇蛋白在細胞表面的表達作為標志，建立了內皮細胞激活抑制劑的高通量篩選方法。建立人臍靜脈內皮細胞培養系統。IL-1刺激下，E選擇蛋白在內皮細胞表面的表達用ELISA方法定量。方法包括細胞固定、加液、加受試化合物等操作，能保持細胞完整，不昂貴，可重復，篩選速度可達每星期1000種化合物。適用化合物范圍很寬，並且方法用細胞作為檢測對象，使能夠較早地發現細胞對化合物的攝取及化合物的細胞毒性。
1.5.5.2 細胞凋亡 Erusalimsky等建立了新型細胞凋亡調節物的高通量篩選方法。細胞預先用3H 胸苷標記，與凋亡誘導物孵育後，連續經過兩種玻璃濾器。一個是中性的，捕獲完整的染色質和高分子量DNA。另一個裝有DEAE活性基團，捕獲低分子量DNA碎片。通過對濾器上放射性的測量，可以對DNA的破碎情況定量。
1.5.5.3 抗腫瘤活性 Lu等建立了用高通量「生物活性指紋」篩選抗肺癌葯物的方法，考察受試分子(類維生素A及類維生素A相關分子)對許多不同細胞系的效應特點。檢測指標包括：(1)肺癌細胞生長抑制檢測。選擇了約50種腫瘤和非腫瘤細胞，包括了大量不同的組織和(或)腫瘤來源。細胞暴露於受試化合物5d後，用標准比色法測定存活細胞百分率。20%生長抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制檢測，用以區分細胞生長抑製作用和細胞殺傷作用。6孔板上加NCI-H292非小細胞肺癌細胞，暴露於受試物一定時間。然後對細胞進行清洗，植於無受試物的培養介質共7d。用結晶紫對細胞染色，考察集落形成情況。(3)凋亡檢測，用ELISA方法測量細胞DNA破碎。(4)轉錄調控檢測，用以考察受試化合物是否有類維生素A受體介導的轉錄抑製作用。方法是將HeLa TK-細胞用73Col-CAT報告基因連同受體的表達載體轉染，與受試物一起培養，用ELISA方法檢測CAT活性。
1.5.5.4 G2檢查點(G2 checkpoint) Roberge等建立了G2期檢查點抑制劑的高通量篩選方法。將MCF-7m p53細胞培養，種在96孔聚苯乙烯組織培養板上。照射使細胞進入G2靜止期，加入受試化合物用ELISA方法檢測核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，從而得到從G2期釋放進入M期的細胞數量，即抑制G2檢查點程度。
1.5.5.5 信號轉導通路 Su等建立了TGFβ3通路作用物的高通量篩選方法。構建融合報告基因，轉染細胞，選擇蟲熒光素酶表達能被TGFβ高誘導的克隆。將細胞植於96孔板，與受試化合物孵育後，稀釋並加入Steady-Glo底物測蟲熒光素酶活力，與對照比較，計算相對酶活性增加值。
1.5.5.6 細菌蛋白分泌 Alksne等建立了以抑制細菌蛋白分泌為作用方式的新型抗生素的高通量篩選方法。該方法基於SecA-lacZ融合報告基因。SecA是一種自我調控翻譯的蛋白，當細菌蛋白分泌被干擾時，該報告基因被誘導。
1.5.5.7 細菌生長 Chung等建立了抑制分枝桿菌生長化合物的高通量篩選方法。選擇了一種腐生性分枝桿菌代替結核分枝桿菌，因其具有生長迅速以及非感染性的特點。通過測定細胞攝入放射性標記的尿嘧啶，考察受試化合物對分枝桿菌活力的作用。用96孔板的形式，1d內可以測試數千個樣品。
2．生葯活性成分的高通量篩選
樣品是高通量葯物篩選的物質基礎，樣品庫來源的化學多樣性是決定高通量篩選技術能否成功的關鍵因素之一。前面我們談到，化合物樣品主要有常規化學合成、組合化學合成和從天然產物中分離純化幾個來源。而從天然產物中分離出來的化合物，由於其母核結構和活性基團是長期的自然選擇形成的，它們具有人工合成化合物所不能比擬的優勢。
我國擁有非常豐富的葯材資源，幾十年來，我們應用葯理學手段，對我國的傳統葯物進行了大規模的研究和篩選，取得了巨大成就。但是，僅僅依靠傳統的葯理實驗方法，既耗時，勞動強度又大，還需要使用大量實驗動物，顯然不能適應大量樣品的同時篩選。雖然經過努力，已從生葯中分離、提取、純化出大量化合物，但由於研究手段的落後，使大量分離出的化合物得不到充分的利用，造成了化合物資源的極大浪費。
因此，將高通量篩選技術應用於生葯的活性成分研究，既是對高通量篩選技術的不斷完善，又是將這一技術應用於中葯現代化研究的有益嘗試。
如何對生葯的活性成分進行高通量篩選呢？其原理、方法和人工合成化合物的高通量篩選基本一致，區別主要在於篩選前需要從生葯中將化合物提取出來並進行適當的分離和化學多樣性的評價。相同的就不再贅述，這里主要談一下提取、分離和多樣性評價的問題。
2.1 提取 由於高通量篩選需要大量的樣品來源，所以常規的提取方法顯然不能滿足這一要求。尋找一個快速、高效、連續、自動化的提取方法顯得迫在眉睫。加速溶劑提取技術是一個新的提取技術，在准備好樣品和對提取方法（或程序）進行設定後，自動進樣和自動收集裝置就可以連續對最多24個不同樣品自動完成樣品的提取和提取液的收集，簡單方便。應用這一技術，可以得到大量的生葯的提取物。
2.2 分離及化學多樣性評價 我們都知道，生葯的化學成分相當復雜，通過提取得到的提取物往往是大量單體組成的混合物，所以篩選前需要對生葯的提取物進行適當的分離。在眾多的分離手段中，制備型HPLC應該是最為理想的，它具有快速、高效、自動化等諸多優點。
分離完成後還需要對分離的物質進行化學多樣性的評價，以提高高通量篩選的效率。以前，這種評價多是基於物種的地理分布、生物學分類、化學分類以及基源等關系，隨著科技的進步，多種現代化手段開始應用於化學多樣性的評價。其中，色譜-電噴霧質譜聯用（HPLC-ESI-MS）技術在這方面做出了有力的嘗試。首先，它做出成分的離子信號（m/z）對保留時間的平面圖，然後對這些數據進行統計學的相似度評估從而對樣品的多樣性進行定量的評價。接著，三維的HPLC數據被轉換為CDF文件格式並傳輸到UNIX工作站。數據文件中的每一個離子（包括保留時間、質量、離子強度等數據）被定位在一個二維圖譜中，保留時間和質量分佔一個軸，離子強度數據儲存在位點中。濾除雜訊以後，離子的中心時間和中心質量被計算出來。根據對LCMS的數據處理，混合物間的相似度被定量地計算出來。這種數據處理基於以下的一種關系，這種關系表徵了樣品1中的離子i和樣品2中的離子j的「化學空間」距離。
其中，ti表示離子i的色譜保留時間，mi表示離子i的質荷比（m/z），wt是保留時間的權重系數，wm是質量的權重系數。dij是離子i和離子j的歐幾里的距離，n1和n2分別是樣品1和樣品2中確認的離子數。sij是離子i和離子j之間的相似度（0-1），相似度值為1表明是相同樣品，相反，相似度值接近0則表明樣品具有很高的化學多樣性。通過這種方法，可以很好的解決樣品化學多樣性的評價問題。