毒性滲出檢測方法

『壹』 求助各位朋友，測試細胞毒性的方法

測試細胞毒性的方法，目前還是蠻多的，檢測細胞存活與增殖的方法主要包括觀察DNA合成含量和檢測細胞代謝活性兩種，前者主要是DNA前體物質（胸腺嘧啶核苷類似物）摻入法，比如BRDU、EDU法；後者主要為MTT、XTT、MTS、CCK-8、WST-1及WST-8法等，在後者中現在最主流的就是CTG法。

『貳』 什麼叫急性毒性試驗為什麼這是測定化學物質毒性的常用方法

急性毒性試驗是指一次或24小時內多次染毒的試驗，是毒性研究的第一步。要求採用嚙齒類或非嚙齒類兩種動物。通常為小鼠或大鼠採用經口、吸入或經皮染毒途徑。急性毒性試驗主要測定半數致死量（濃度），觀察急性中毒表現，經皮膚吸收能力以及對皮膚、粘膜和眼有無局部刺激作用等，以提供受試物質的急性毒性資料，確定毒作用方式、中毒反應，並為亞急性和慢性毒性試驗的觀察指標及劑量分組提供參考。
一、概念和試驗目的
(一) 急性毒性概念
急性毒性是指機體(人或實驗動物)一次(或24小時內多次)接觸外來化合物之後所引起的中毒效應，甚至引起死亡。
但須指出化合物使實驗動物發生中毒效應的快慢和劇烈的程度，可因所接觸的化合物的質與量不同而異。有的化合物在實驗動物接觸致死劑量的幾分鍾之內，就可發生中毒症狀，甚至死亡。而有的化合物則在幾天後才顯現中毒症狀和死亡，即遲發死亡。此外，實驗動物接觸化合物的方式或途徑不同，「一次」的含義也有所不同。凡經口接觸和各種方式的注射接觸，「一次」是指在瞬間將受試化合物輸入實驗動物的體內。而經呼吸道吸入與經皮膚接觸，「一次」是指在一個特定的期間內實驗動物持續地接觸受試化合物的過程，所以「一次」含有時間因素。
(二) 實驗目的
1.求出受試化合物對一種或幾種實驗動物的致死劑量(通常以LD50為主要參數)，以初步估計該化合物對人類毒害的危險性。
2.闡明受試化合物急性毒性的劑量－反應關系與中毒特徵。
3.利用急性毒性試驗方法研究化合物在機體內的生物轉運和生物轉化過程及其動力學變化。也可用於研究急救治療措施。
二、實驗動物和染毒方法
(一) 實驗動物選擇
在衛生毒理學領域中，體內試驗以實驗動物為研究對象，最終是為了闡明受試外來化合物對人的急性危害性質和危害強度。所以選擇實驗動物時，要求在其接觸化合物之後的毒性反應，應當與人接觸該化合物的毒性反應基本一致，雖然利用任何一種或幾種實驗動物的急性毒性結果向人外推都必須十分慎重，但這一選擇實驗動物的原則仍非常重要。
1.物種選擇以選擇哺乳動物為主。目前實際應用中以大鼠和小鼠為主，尤以大鼠使用很多。需指出大鼠並非對外來化合物都最敏丅感。家兔常用於研究化合物的皮膚毒性，包括對粘膜的刺激。貓、狗也用於急性毒性試驗，但因價貴不易於大量使用。豬為雜食動物，對一些化合物的生物效應表現與人有相似之處，尤其是皮膚結構與人較近似。但因體大、價貴，不便大量使用。
歸納起來，在進行化合物急性毒性研究中，選擇實驗動物的原則是：盡量選擇對化合物毒性反應與人近似的動物；易於飼養管理，試驗操作方便；易於獲得、品系純化，且價格較低的動物。為了有利於預測化合物對人的危害，要求選擇兩種以上的實驗動物，最好一種為嚙齒類，一種為非嚙齒類，分別求出其急性毒性參數。
一般研究外來化合物急性毒性，需雌雄兩性動物同時分別進行，每個劑量組兩性動物數相等。急性毒性使用小鼠體重以18~25g、大鼠180~240g、豚鼠200~250g、家兔2~2.5kg、貓1.5~2.0kg左右為宜。
(二) 實驗動物喂養環境
實驗動物喂養室室溫應控制在22±3℃，家兔可控制在20±3℃，相對濕度30%～73%，無對流風。每籠動物數以不幹擾動物個體活動及不影響試驗觀察為度，必要時需單籠飼養。飼養室採用人工晝夜為好，早6點至晚6點進行12小時光照，其餘12小時黑暗，一般食用常規試驗室飼料，自由飲水。
(三) 實驗動物染毒方法
1.經口(胃腸道)接觸目的是研究外來化合物能否經胃腸道吸收及求出經口接觸的致死劑量(LD50)等。由於外來化合物可以污染飲水及食物，因此，此種染毒方式在衛生毒理學中佔有重要地位。
(1) 灌胃是將液態受試化合物或固態、氣態化合物溶於某種溶劑中，配製成一定濃度，裝入注射器等定量容器，經過導管注入胃內。
在每一試驗系列中，同物種實驗動物灌胃體積最好一致，即以單位體重計算所給予的毫升數應一致，即ml/kg或ml/g計。這是因為成年實驗動物的胃容量與體重之間有一定的比例。按單位體重計算灌胃液的體積，受試化合物的吸收速度相對較為穩定。小鼠一次灌胃體積在0.2~1.0ml/只或0.1~0.5ml/10g體重較合適，大鼠一次灌胃體積不超過5ml/只(通常用0.5~1.0ml/100g體重)，家兔不超過10ml/2kg體重，狗不超過50ml/10kg體重。

『叄』 土壤重金屬砷、鎳污染浸出毒性怎麼檢測，檢測方法是什麼

一、 污水灌溉
生活污水和工業污水中含有一些植物生長需要的營養成分。但用含有重金屬、酚類、氰化物等有毒物質污水灌溉時，這些有毒物質隨水進入土壤，使土壤受到污染。
二、施肥不合理
1、過量施入硝酸鹽化肥。過量施入硝酸曲化肥可使一些飼料作物中含有大量亞硝酸鹽成分，並釋放NO2有毒氣體，影響人畜健康。
2、施用粗磷礦粉和粗製磷肥可使土壤中氟的含量增高，影響土壤生物活動，進而影響土壤肥力。
3、施用石灰氮肥。石灰氮肥施入土壤後需經氰銨鹽類物質的生成轉化。氰銨鹽為有毒物質，使土壤受到一定程度的污染。
4、施用未經處理或處理不當的人畜糞便施入土壤，可使一些病原微生物在土壤中繼續繁殖，造成土壤生物污染。
5、施用未經處理的垃圾，常含一些有毒有害物質，施入土壤易造成土壤生物污染。
三、葯殘
化學農葯均為有毒物質。施用大量毒性和殘留量較大的農葯會造成土壤污染，還會破壞土壤。
四、廢氣
1、工業廢氣中常有一些含硫、含氟氣體。當含硫含氟氣體排放到空中後，分別以硫酸和氫氟酸的形式隨降水進入土壤.使土壤產生不同程度的酸性改變和氟含量的增高，從而造成土壤質量下降。

2、機動車尾氣中含鉛量較高.常造成公路沿線土壤含鉛量較高。
五、廢渣
工廠、礦山的廢渣、廢物常釋放出一些重金屬離子和一些有機化合物以及多種酸鹼鹽類，可造成土壤一定程度的污染。
土壤中重金屬快速檢測方案
1、探測器：超高解析度的硅漂移SDD探測器（大面積鈹窗25mm2）。採用了Peltier恆溫冷卻系統，保證控測器在-30°C下工作，保證儀器的檢測精度，和不受外界溫度的影響。
2、濾光片：不少於8組濾光片，根據測試元素自動切換。
展開

『肆』 黃麴黴毒素怎麼檢測

檢測方法

1、薄層分析法(TLC)

TLC法是檢測黃麴黴素最為經典的方法，也是以前最為常用的方法，至今仍為一些檢測機構所用，也是一種國標方法。其原理是針對不同的試樣，用適宜的萃取溶劑將黃麴黴素從試樣中萃取出來，經柱層析凈化後，再在薄板上展開後分離。

利用黃麴黴素的熒光特性，根據熒光斑點的強弱與標准比較確定其含量，對於一些組分很復雜的試樣要雙向展開，才能獲得較高的靈敏度。

TLC法設備簡單，檢測費用低，但操作繁瑣、費時，萃取和凈化效果不理想，靈敏度差，對操作人員的身體健康存在較大程度的危害。

2、液相色譜法(HPLC)

HPLC法是近年來發展起來的一種檢測方法。其原理是在高效液相色譜儀上添加柱後衍生系統分離，再用熒光檢測器測定。與其配套的柱後衍生系統有碘衍生化法、溴衍生化法及較為先進的電化學衍生化法和光化學衍生化法。當前，該方法大多用免疫親和柱來凈化、分離，其凈化效果優異。

該法能准確地分離不同種類的黃麴黴素(例如：AFB1、AFB2、AFG1和AFM1等)，檢測速度快且定性與定量准確，檢測限低，可作為仲裁法使用，但儀器設備價格昂貴，前處理方法相對繁瑣，若用到免疫親和柱則會使試樣檢測費用增加，對操作人員的身體健康仍存在一定的危害。

3、酶聯免疫法(ELISA)

ELISA法也是近年來研究開發出來的一種較為新穎的方法。其原理是根據抗體和抗原之間特異性的免疫學反應，最後用測定酶活力的方法來增加測定的靈敏度。

該方法檢測速度快、對人體危害小、但重復性差、試劑壽命短、需低溫保存、假陽性概率較高、需要配置專門的酶標儀，且對一些富含鹽和脂肪的試樣需進行額外的處理。

4、毛細管電泳法(CE)

毛細管電泳(CE)也是一種新發展起來的分析黃麴黴素的方法。該方法與激光減弱熒光檢測器(LIF)連用可很好地提高靈敏度。

Wei等用毛細管電泳一激光減弱熒光檢測器測定AFB1、AFB2、AFG1和AFG1，取得了較為理想的分離效果，其中對AFB2的測定最為靈敏。但CE法的成本較高，操作復雜，不適宜在試樣檢測中廣泛應用。

5、熒光光度法(IAC/SFB)

IAC/SFB法也是一種常用的國標方法。該方法的原理是利用各種黃麴黴素的熒光特性差異用熒光光度計測定試樣中黃麴黴素的含量。

該方法對檢測人員身體健康無危害，檢測速度迅速，靈敏度高，適用於大量試樣檢測，且定量准確，但檢測費用較高，需要配置專用設備，且不能對單一的毒素進行檢測。

6、金標試紙法

金標試紙法，實際就是一種固相免疫分析法。其原理是利用抗體與抗原的特異性結合反應，可一步檢測黃麴黴素。

該法可在5～10min內完成對試樣中黃麴黴素的定性測定，具有簡單、快速的特點，且無須其他儀器設備的配合，既可在實驗室中進行檢測，也可在現場進行實地測定，但是其檢測的准確度、精度有待進一步的研究。

7、生物感測器法

生物感測器是使用固定化技術將具有分子識別能力的生物活性物質與物理化學換能器結合，可以用來探測生物體內外的環境化學物質或與之起特異性交互作用後產生響應的一種裝置。其中利用分子間特異親和性制備的親和型生物感測器為免疫感測器口。

根據能量轉換器所傳導的物理或化學信號的不同，免疫感測器可分為電化學免疫感測器、光學免疫感測器、壓電晶體免疫感測器等。由於生物感測器具有選擇性高、響應快、操作簡單、攜帶方便和適合於現場檢測等優點，因此各國科研工作者正積極探索研製新型生物感測器用於檢測黃麴黴素。

(4)毒性滲出檢測方法擴展閱讀：

黃麴黴毒的危害

1993年黃麴黴毒素被世界衛生組織（WHO）的癌症研究機構劃定為1類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質，足以說明黃麴黴毒素對身體的危害是極大的。黃麴黴毒素毒性遠遠高於氰化物、砷化物和有機農葯的毒性，其中黃麴黴毒素B1毒性最大。

黃麴黴毒素進入體內後，主要在肝細胞內質網微粒體混合功能氧化酶系的作用下進行代謝。因此，黃麴黴毒素的危害性在於對人的肝臟組織有破壞作用，嚴重時可導致肝癌甚至死亡。當然，黃麴黴毒素沒有經過代謝活化是無致癌性的。

參考資料來源：網路-黃麴黴毒素檢測方法

『伍』 細胞活性和細胞毒性檢測的實驗方法

細胞數量確定

1.將細胞懸浮液（100μL/孔）接種在96洞孔板中。將板在潮濕的培養箱中預孵育（例如，在37℃，5％CO2下）。

2.向板的每個孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.讀數。

3.將培養板在培養箱中孵育1-4小時。

4.使用酶標儀測量450 nm處的吸光度。

細胞增殖和細胞毒性測定

1.將種子細胞以103-104個細胞/孔的密度在96孔板中在100μL培養基中培養。將細胞在CO2培養箱中於37℃培養24小時。

2.將不同濃度的待測物質加入板中。

3.將培養板在培養箱中孵育適當的時間（例如，6,12,24或48小時）。

4.使用重復移液器向板的每個孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.讀數。

5.將培養板在培養箱中孵育1-4小時。

6.在讀取孔板之前，重要的是在軌道振動器上輕輕混合1分鍾，以確保顏色均勻分布。

7.使用酶標儀測量450 nm處的吸光度。

數據分析

統計分析有幾種方法，您可以選擇使用O.D.值或細胞數量，我們提供其中一種方法。

細胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100

抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100

As =實驗孔吸光度（含有細胞，培養基，CCK-8和待測化合物的孔的吸光度）。

Ab =空白孔吸光度（含有培養基和CCK-8的孔的吸光度）。

Ac =對照孔吸光度（含有細胞，培養基和CCK-8的孔的吸光度）。

製作標准曲線

1. 細胞計數板計數細胞懸液中的細胞數。

2. 使用培養基，等比稀釋細胞懸液為一個濃度梯度，通常需要5-7個濃度梯度，每組幾個復孔。然後接種細胞。（注意每孔的細胞數量。如果您將細胞懸液稀釋在管中，在加入培養板的孔之前，請小心再次混勻細胞。每孔中細胞懸液的體積應該是一致的。）

3. 培養直至細胞貼壁（通常2-4小時），然後每100 μl培養基加入10 μl CCK-8。繼續孵育1-4小時，用酶標儀測量450nm處的吸光度。製作出一條以細胞數為X軸坐標，O.D.值為Y軸坐標的標准曲線。

可以基於該曲線確定待測樣品的細胞數。使用此標准曲線的先決條件是培養檢測條件相同。

注意事項

1. 確保葯物和CCK8均勻分布在培養基中。

2. 細胞增殖越多, 顏色越深; 細胞毒性越強，顏色越淺。

3. 對於貼壁細胞，每孔至少需要1000個細胞（100 μl培養基）。對於白細胞，由於靈敏度較低，每孔至少需要2500個細胞（100 μl培養基）。推薦的96孔板每孔最大細胞數為25000。如果使用24孔或6孔板進行該檢測，請計算相應的每孔的細胞數，並調整CCK-8的體積，使其為每孔總液體體積的10％。

4. 因為CCK8測定是基於活細胞中的脫氫酶活性，影響脫氫酶活性的條件或化學物質可能導致實際活細胞數與使用CCK-8測定活細胞數之間有差異。

5. WST-8可能與還原劑反應生成WST-8 formazan。如果使用還原劑 (例如一些抗氧化劑)會干擾檢測。如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。

6. 孵育2小時後，背景O.D.值一般為0.1-0.2單位。

7. 注意不要在孔中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.值。

8. 如果您想對CCK8溶液進行滅菌，請使用0.2 μm的膜過濾溶液。

9. 孵育時間因孔中細胞的類型和數量而異。通常，白細胞著色較弱，因此可能需要較長的孵育時間（長達4小時）或大量細胞（~105細胞/孔）。

10. 如果細胞懸液中存在高濁度, 測量並減去樣品在600nm或更高波長的O.D值。

11. CCK8不能用於細胞染色。

12. 培養基中的酚紅不會影響實驗結果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

13. CCK8的毒性非常低，在CCK8測定完成後，相同的細胞可用於其他細胞增殖測定，例如結晶紫測定，中性紅測定或DNA熒光測定。（除非細胞極為稀少，不推薦。）

14. 該試劑盒可用於大腸桿菌，但不能用於酵母細胞。

15. 在讀取平板之前，您可以在搖床上輕柔混勻。

16. 我們建議將細胞接種在靠近培養板中央的孔中，最外圍一圈孔中的培養基容易蒸發，可以用PBS，水或培養基填充這些孔。

17. 如果您沒有450nm濾光片。您也可以使用吸光度在430和490nm之間的濾光片, 450nm濾光片具有最佳靈敏度。

18. 測量450nm處的吸光度，如果您需要進行雙波長測定，作為參考波長可以測定650nm處的吸光度。

19. 葯物中金屬離子的存在可能會影響CCK8的靈敏度。終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制 5%、15%、 90% 的顯色反應，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM的話，將會100%抑制。

Glpbio是新啟的世界領先的高性能的生命科學產品供應商之一，產品涵蓋癌症、神經科學、抗感染、表觀遺傳學等20個熱門研究領域，覆蓋Akt、Jak等近千個細分靶點。

上海宏葉生物科技有限公司是GlpBio在中國區的總代理。

推薦測試劑 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

『陸』 化學品毒性鑒定技術規范的鑒定程序和方法

化學品毒性鑒定分為4個階段
（1）第一階段（急性毒性試驗、眼刺激試驗和皮膚刺激試驗）
主要是急性毒性參數的測定和了解受試樣品對皮膚、粘膜的刺激性以及致敏性，為毒性分級和標簽管理提供依據。同時，可了解受試樣品對機體造成急性損害的可能性和嚴重程度，並為第二階段各項試驗的劑量設計提供依據。在測定LD50時，一般要求用兩種動物，染毒途徑應包括所有人體可能的接觸途徑。
· 急性吸入毒性試驗
· 急性經皮毒性試驗
· 急性經口毒性試驗
· 急性眼刺激性/腐蝕性試驗
· 皮膚刺激性/腐蝕性試驗
· 皮膚變態反應試驗（皮膚致敏試驗）
（2）第二階段（亞急性毒性試驗和致突變試驗）
主要是了解受試樣品的亞急性毒性和遺傳毒性，為第三階段各項試驗劑量設計和觀察指標的選擇提供依據，並對受試樣品的致癌性進行預測。
· 鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗（Ames試驗）
· 體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗
· 體內哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗
· 體內哺乳動物骨髓嗜多染紅細胞微核試驗
· 哺乳動物精原細胞/初級精母細胞染色體畸變試驗，或
· 精子畸形試驗
· 嚙齒類動物顯性致死試驗
· 免疫毒性評價試驗方法
· 亞急性吸入（14/28天）毒性試驗
· 亞急性經皮（21/28天）毒性試驗
· 亞急性經口（28天）毒性試驗
（3）第三階段（亞慢性毒性試驗、致畸試驗、繁殖試驗）
通過亞慢性試驗進一步確定多次重復染毒的毒作用性質和靶器官，初步確定NOAEL或LOAEL，為第四階段各項試驗的劑量設計和觀察指標的選擇提供依據；通過致畸試驗判斷受試樣品的胚胎毒性及其是否有致畸性。通過繁殖試驗，可判斷受試樣品對生殖過程的損害作用。通過遲發性神經毒性試驗，可判斷受試樣品是否具有遲發性神經毒作用。
· 亞慢性吸入毒性試驗
· 亞慢性經皮毒性試驗
· 亞慢性經口毒性試驗
· 致畸試驗
· 兩代繁殖毒性試驗
· 遲發性神經毒性試驗
（4）第四階段（慢性毒性試驗和致癌試驗）
通過慢性毒性試驗可確定受試樣品的NOAEL和LOAEL，為推算受試樣品的安全接觸限值提供依據。通過致癌試驗可以確定受試樣品對受試實驗動物的致癌性。通過代謝動力學試驗可以了解受試樣品的吸收、分布、代謝和排泄特點，了解蓄積毒性作用及其可能的靶器官和毒作用機理。
· 慢性吸入毒性試驗
· 慢性經皮毒性試驗
· 慢性經口毒性試驗
· 致癌試驗或慢性毒性試驗合並致癌試驗
· 毒物代謝動力學試驗
參考方法
· 皮膚變態反應試驗-局部淋巴結法
· 大腸桿菌回復突變試驗
· 酵母菌基因突變試驗
· 體外哺乳動物細胞正向基因突變試驗
· 果蠅伴性隱性致死試驗
· 枯草桿菌基因重組試驗
· 體外哺乳動物細胞程序外DNA合成（UDS）試驗
· 體內哺乳動物外周血細胞微核試驗
· 體外哺乳動物姊妹染色單體交換（SCE）試驗
· 體內哺乳動物骨髓細胞姊妹染色體交換（SCE）試驗
· 繁殖/生長發育毒性篩選試驗
· 亞急性毒性合並繁殖/發育毒性篩選試驗
· 一代繁殖試驗
· 神經毒性篩選組合試驗