內毒素檢測通常用的試驗方法

A. 細菌內毒素中什麼是定量法

目前,國內外廣泛應用且檢測技術比較成熟的細菌內毒素定量檢查法主要有以下四種。
1. 1凝膠法是目前最常用的細菌內毒素檢查法。即在10mm×75mm的小試管內,加入待檢樣品和鱟試劑各0. 1ml混合, 37℃、60 min保溫反應後, 180°倒轉,根據凝膠形成的情況(凝膠是否堅實)作為判定指標的一種半定量法。此法操作簡單,經濟而且不需要專用儀器。凝膠法既可限量檢測內毒素,也可在0. 03 EU•ml-1以上進行半定量測定。
1. 2顯色基質法(合成基質法、顯色合成基質法, Chromoge-nic Technique)系根據細菌內毒素與LAL(或TAL)試劑中的C系反應所激活的凝固酶,使用人工合成的鱟三肽(即與PNA相連的顯色基質如BOC-LEU-GLY-ARG-PNA等)作為顯色基質,水解鱟三肽中的精氨酸肽鏈,通過測量反應液中釋放出遊離的對硝基苯胺(PNA)的吸光值而進行定量的一種檢測方法。該法需要專用儀器。目前主要用於微量血漿、血清、全血、骨髓液及尿、乳汁等的臨床檢驗以及家禽、實驗動物、人工臟器的安全性評估等方面。根據測定原理的不同分為終點顯色法和動態顯色法。
1.2.1終點顯色法(EndopointColorimetric Assay)系根據在一定時間內游離出的PNA的量與細菌內毒素濃度成正比例關系進行測定的一種分析方法。PNA(黃色)的吸光度值可使用單波長405 nm或雙波長(測定波長405 nm、參照波長492 nm)測量,或利用游離的PNA與紅色偶氮試劑發生反應所形成的紅色偶氮藍復合物在545nm單波長或雙波長(測定波長545 nm、參照波長630 nm)進行檢測。一般可在0. 006~15 EU/ml范圍內進行定量。
1.2.2動態顯色法(Kinetic Colorimetric Assay)系根據游離的PNA的吸光度變化率(mAbs/min)與細菌內毒素濃度成正比例關系(比色反應速度法Pate Assay)或到達事先設定的反應吸光度變化值所需要的時間Ta的對數值與細菌內毒素濃度的對數值成反比例關系(比色反應時間法OD-Time As-say)進行測定的一種分析方法。一般可在0. 006~50 EU/ml范圍內進行定量。
1. 3酶聯免疫測定法(ELISA法)基於抗原抗體的酶聯免疫測定法,目前在國外應用十分普遍。主要由外加熱原質刺激巨嗜細胞後產生的內熱原物質(如TNF, TL-1等),而進行的定量測定方法。體外人全血熱原檢測方法是近年來國內外正在興起的一種研究熱原檢測的新方法,具有檢測范圍廣,靈敏度高,不同個體血液的結果差異小等優點[2, 3]。國內一些學者,已採用酶聯免疫測定法對體外人全血熱原檢測方法的可行性進行研究和優化,取得了可喜的進展[4]。1. 4濁度法(Turbidim etrc Technique)系微量的內毒素與TAL(LAL)試劑中的C因子發生反應,由內毒素引發激活的凝固酶,切斷凝固蛋白特定位置的精氨酸肽鍵,形成凝固蛋白從而產生凝膠過程中的濁度變化,採用適當的光學儀器測量的一種分析方法。此法操作比較簡單、經濟、靈敏度高,檢測范圍廣。通常在0. 006~300 EU/ml的范圍內進行定量,但需要專用儀器。根據測定原理的不同又可分為終點濁度法和動態濁度法。
1.4.1終點濁度法(EndopintTurbidimetric Technique)即根據到達規定點上反應液的最終濁度值(吸光度或透過光亮值)與細菌內毒素濃度成正比例或反比例的關系而進行測量的一種檢測方法。由於未形成標准化,目前國內外都很少使用,也未見有專門儀器使用。
1.4.2動態濁度法(Kinetic Turbidimetric Technique)即根據測定到達事先設定反應液的濁度變化(吸光度變化)值所需要的時間(Ta比濁反應法)或濁度變化(透過光量比)值所需要的時間(Tg:比濁時間分析法)的對數值與細菌內毒素濃度的對數值成反比例關系或濁度的(吸光度值)每分鍾變化(吸光度變化mAbs/min)與細菌內毒素濃度成正比例關系(比濁反應速度法)而進行測量的一種分析方法。通常,濁度法一般是指動態濁度法,而且在日、美、歐等國有專用儀器,並通過美國FDA認可,其中作為動態比濁儀一般要求為:恆溫槽(37±1℃)、光源、檢測器及內置數據分析等。其中檢測波長從80~660 nm,主要根據儀器的不同而各異,檢測時間為60~90 min之間。由於國內對細菌內毒素定量檢查法的研究起步較晚,專門用於定量的高靈敏度TAL(最低檢測限是0. 006EU/ml)還未研製開發出來,還受細菌內毒素檢查用水(內毒素的含量小於0. 005 EU/ml)、內毒素標准品質量不高等因素的制約,對儀器定量法研究較多且檢測技術較為成熟的就是動態濁度法。本法收載於2000年版《中國葯典》二部附錄中,在2005年版《中國葯典》二部附錄中,將濁度法和顯色基質法修訂為光度測定法,作為測定內毒素含量的方法。

B. 求助：注射用水的細菌內毒素檢查方法

《中國葯典》規定注射用水細菌內毒素限值為：0.25EU/ml
因注射用水無干擾成分存在，可以不用稀釋直接檢測，最簡便的方法是採用靈敏度0.25EU/ml的鱟試劑（TAL））直接檢查。
即 取8支靈敏度為0.25EU/ml的TAL，每支加0.1ml細菌內毒素檢查用水（BET水）復溶，再分別制樣品管2支（直接加入1ml注射用水）；陰性對照管2支；陽性對照管2支；PPC管2支，按葯典規定操作。
加果採用 靈敏度0.125EU/ml的鱟試劑 ，就要用BET水稀釋一倍後再進行實驗。

C. 細菌內毒素檢測

熱原系指由微生物產生的能引起恆溫動物體溫異常升高的致熱物質。它包括細菌性熱原、內源性高分子熱原、內源性低分子熱原及化學熱原等。所以熱原有外生致熱原和內生致熱原之分。
細菌內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的復合物，它的特殊性不是細菌或細菌的代謝產物，而是細菌死亡或解體後才釋放出來的一種具有內毒素生物活性的物質。
一般來說內毒素是熱原,但熱原不全是內毒素。歐洲葯典委員會副主席J.Van Noordwijk提出：「嚴格地講，不是每一種熱原都具有脂多糖的結構，但所有已知的細菌內毒素脂多糖都有熱原活性」。在葯品生產質量管理規范（GMP）條件下，葯品生產的質量控制一般可以接受的觀點是：不存在細菌內毒素意味著不存在熱原。
熱原檢查法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規定時間內，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規定的一種方法。
細菌內毒素檢查法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。
細菌內毒素檢查法，現已在《中國葯典》2010年版二部、三部內廣泛應用，但在《中國葯典》2010年版一部內一個葯品都未運用，這主要是由細菌內毒素檢查法的持點所決定的：細菌內毒素檢查法具有較家兔熱原檢查法靈敏、快速、簡便易行、重現性好、結果准確等優點，目前細菌內毒素檢查法已廣泛應用於西葯、生物製品。但同時也應該指出，細菌內毒素檢查是一復雜的酶促反應過程，生產工藝的細微變化都可能引起其干擾的增加，然而根據中葯制劑，成分復雜，影響因素多的特點，因此，中葯注射劑一般還是採用傳統的家兔熱原檢查法。但是對一些具有解毒降溫作用的葯物，因會干擾家兔的生理活性，引起體溫下降，用家兔法檢測不準，還是應考慮用細菌內毒素檢查法。
由此可見，熱原與細菌內毒素兩者之間既有許多相同之處，但還是有區別的。同時，還要請各位同仁注意，不要將「熱原」誤寫成「熱源」。

D. 內毒素的檢測

由於內毒素是細菌死亡裂解或自溶引起的，因此環境中大量存在內毒素。當內毒素通過機體消化道等方式時並無危害，少量通過注射等方式進入血液後被肝臟枯否細胞滅活，不造成機體損害。內毒素大量進入血液就會引起發熱反應—「熱原反應」。內毒素大量進入、集聚於血液中，超過機體各自衛系統的清除能力，則可導致不同程度的內毒素血症。對於易於引入內毒素的葯品醫療器械等必須通過內毒素檢測。內毒素的檢測常用家兔熱原法和鱟試驗法。中國葯典收錄的細菌內毒素檢查法包括2種方法：凝膠法和光度法，使用鱟試劑來定性或定量檢測內毒素。

E. 細菌內毒素的試驗要求應該怎麼做急急急提前感謝啦

細菌內毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，後者包括濁度法和顯色基質法。
凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法。我公司提供多種規格的靈敏度為0.03, 0.06, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 EU/ml的凝膠法鱟試劑。操作簡便，經濟，反應只需在37℃恆溫水浴內進行。
濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程過程中濁度變化而定量測定內毒素含量的方法。目前，我公司有提供動態濁度法鱟試劑盒，配套微板鱟試儀ELU808使用，其檢測范圍寬，檢測限可達到0.005EU/ml – 10 EU/ml，同時其樣本檢測量小，快速測定，多孔同時檢測，可提高工作效率。
同時，有顯色基質法鱟試劑盒定量測定內毒素含量，其檢測時間短，抗干擾能力強，檢測限為0.01EU/ml-1 EU/ml 。可配套使用微板鱟試儀ELU808 ， 通過96孔微板檢測，最適宜的測定波長為405nm。也可使用分光光度計，通過試管檢測，最適宜的測定波長為545nm。
凝膠法只能對樣品中內毒素含量進行定性判斷，也就是樣品中的內毒素大於或小於某一個值，不能准確測定中樣品的內毒素含量。而濁度法和顯色基質法是定量測定內毒素含量的方法。

廈門市鱟試劑實驗廠有限公司

F. 細菌內毒素檢測鱟試劑實驗方法有哪些

鱟試劑法就是細菌內毒素檢測方法，它包括凝膠法和光度測定法。
凝膠法又分為限度實驗和半定量實驗。
光度測定法是定量實驗，分為濁度法和顯色法，其中濁度法又分為動態濁度法和終點濁度法，顯色法又分為動態顯色法和終點顯色法還有重組鱟試劑法

G. 細菌內毒素國家葯典是怎麼檢測的

10版國家葯典
檢測內毒素可以用凝膠法
凝膠法是通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法。
鱟試劑靈敏度復核試驗

在本檢查法規定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。

以上摘自2010版中國葯典《細菌內毒素檢查法》