怎麼提高免疫學檢測方法的特異性

① 外國只有快速核酸檢測嗎

美國FDA批准抗原快速檢測技術 核酸檢測不再是唯一檢測方法

CACLP
2020-09-07 19:40:28
近日，美國食品葯品監督管理局（FDA）將針對抗原檢測的緊急使用授權發布給雅培的BinaxNOW COVID-19 Ag卡。該產品是一種快速、可靠、高度便攜且價格低廉的新冠檢測工具，可用於大規模檢測冠狀病毒感染。這類檢測技術可以從卡條上直接讀取結果，類似於家庭妊娠測試。雅培稱，該產品「使用成熟的側向流技術，在不需要儀器的情況下，只需15分鍾即可獲得結果，臨床研究顯示其靈敏度為97.1％，特異度為98.5％」。

美國FDA官方消息
FDA設備和放射健康中心的主任Jeff Shuren指出：
這項新的COVID-19抗原測試是對現有測試的重要補充，因為在幾分鍾內就可以從測試卡上直接讀取結果。這意味著人們能幾乎實時地知道他們是否感染了該病毒，鑒於其更簡單的設計以及該公司預計在未來幾個月內將進行的大量測試，這種新的抗原測試會是我們抗擊疫情的重要進步。
休斯敦貝勒醫學院分子病毒學和微生物學的教授兼主任Joseph Petrosino指出：
這種測試和應用程序的大規模應用，將讓上千萬的人獲得快速且可靠的測試。
抗原檢測方法簡介
新型冠狀病毒基因編碼多個結構蛋白，例如N蛋白、E蛋白和S蛋白等，這些蛋白包括多個抗原表位，利用抗原與抗體特異性結合的原理，可通過抗體檢測抗原的存在，從而直接證明樣本中含有新型冠狀病毒。抗原檢測試劑的適用樣本類型一般為感染部位樣本，如鼻拭子、咽拭子等。

抗原檢測試劑卡條示意圖
快速檢測新冠病毒抗原的測試卡條是將能夠結合同一抗原的一對抗體分別固定於免疫層析檢測試紙條的檢測線（T線）與結合墊上，結合墊上的抗體帶有顯色標記（熒游標記或膠體金標記）。在試紙條滴樣處滴加樣品，樣品會向試紙條另一端流動，當流動至結合墊，樣品中的抗原會與結合墊上的標記抗體結合，形成「標記抗體-抗原」復合物；當樣品流動至檢測線時，抗原會被T線上的抗體捕獲，形成「標記抗體-抗原-捕獲抗體」復合物，隨著T線上捕獲抗原的不斷增加，T線會出現愈加明顯的顏色變化。C線處固定了二抗，無論樣品中是否含有待測抗原都會顯色。所以如果T線顯示顏色，則說明待測樣本中含有待測抗原。
與核酸檢測法相比，抗原檢測技術的優勢是什麼
任何一種檢測都有其優劣勢，關鍵是在合適的場景運用，操作過程尤其是采樣環節需符合規范。分子檢測固然有著優異的敏感度和特異性，而且近年來分子診斷的檢測速度也在大大提升，但不可否認分子診斷依舊存在著一些局限：比如，不是所有的醫院門急診都有條件配備 RT-PCR 或其他分子檢測，而且普遍情況下分子檢測耗時相對較長，且成本相對較高。因此，病原體的免疫學檢查以其快速、便捷和低成本的優勢更容易被普及。
1、快速：檢測一個樣本僅需10-15分鍾，可以做到現場快檢。RT-PCR方法需要4-6小時才能得到檢測結果，且由於設備等原因，不能做到現場快檢。
2、操作簡便，無需特殊設備和人員培訓；而RT-PCR方法檢測需要特殊的昂貴儀器設備，如熒光定量PCR儀。核酸檢測是一項精密的實驗，對操作人員的要求也較高，需要經過專門的操作培訓。
3、特異性高：雙抗夾心法保證了抗體交叉反應低，從而有效提高了免疫學方法的特異性，減少假陽性的發生。
4、靈敏度穩定：理論上，由於核酸檢測可以將病毒模板擴增，其靈敏度高於免疫學檢測方法。而免疫學方法對樣本的要求相對較低，抗原蛋白較穩定，因而抗原檢測試劑盒靈敏度表現穩定。
總之，新型冠狀病毒（SARS-COV-2）抗原檢測法診斷快速、准確、對設備和人員要求低，其特點非常適合大規模新冠病毒感染疑似病例的快速排查，對疫情集中暴發的快速診斷非常有效。
國內IVD企業從未示弱
本次新冠疫情爆發以來，國內的很多IVD企業一直表現優異，國外能做出來的檢測技術我們「中國速度、中國技術、中國製造」也從未示弱。編者從江蘇美克醫學技術有限公司了解到，在疫情前期公司就研發生產出抗體檢測試劑支援全國和全球各地疫情防控，在此之後公司繼續在抗原檢測、中和抗體檢測等技術方面進行突破。據悉，該公司的抗原檢測產品和中和抗體檢測產品已獲得歐盟CE認證，可正式出口到對歐盟CE認可的國家和地區。

相關測試數據對比表媲美國外廠家（由公開數據整理）

抗原檢測產品
除了抗原檢測產品外，美克醫學還研發出更加快速、方便的中和抗體檢測產品，目前產品已經在多家醫療機構對疫苗接種人群和新冠肺炎康復人群體內的中和抗體水平進行了驗證，與中和實驗的檢測結果一致性達到

② 免疫檢測的基礎知識

免疫檢測的基礎知識匯總2017

ELISA是一種免疫測定。免疫測定(immunoassay，IA)是應用免疫學技術測定標本的方法。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反應檢測體液中的抗體或抗原性物質。下面是我為大家帶來的免疫檢測的基礎知識，歡迎閱讀。

1抗原

抗原是能在機體中引起特異性免疫應答的物質。抗原進入機體後，可刺激機體產生抗體和引起細胞免疫。在免疫測定中，抗原是指能與抗體結合的物質。能在機體中引起抗體產生的抗原多為分子量大於5000的蛋白質，例如乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、甲胎蛋白(AFP)等。小分子化合物在與大分子蛋白質結合後能引起機體產生特異性抗體的，稱為半抗原(hapten)。例如某些激素、葯物等。抗原的反應性取決於抗原決定簇(antigenic determinant)，或稱為表位(epitope)。一個抗原分子可帶有不同的決定簇，例如中可帶有等決定簇。

2抗體

2.1抗體的結構

抗體是能與抗原特異性結合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關的Ig主要為IgG和IgM。Ig由兩個輕鏈(L)和兩個重鏈(H)的單體組成。Ig的輕鏈是相同的，有κ(kappa)和λ(Lambda)兩種型別。五類Ig的重鏈結構不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ(gamma)鏈和μ(mu)鏈。IgG的結構見圖。

① 木瓜酶裂解部位

② 胃蛋白酶裂解部位

重鏈和輕鏈的N端的氨基酸排列順序

因各種抗體而異，稱為可變區，分別用

VH和VL表示。兩者構成抗體的抗原結合

部位，只與相應的抗原決定簇匹配，發生

特異性結合(見圖)，是抗體專一性結合

抗原的結構基礎。

IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個區段，其中兩個相同的區段稱抗原結合片段(Fab)。每個Fab都保存結合抗原的能力，但只有一個抗原結合位點，是單價的，與抗原結合後不出現凝集或沉澱。另一區段稱Fc段，無抗體活性，但具有IgG特有的抗原性。

IgG可被胃蛋白酶分解為兩個片段，一個Fab雙體，稱F(ab')2，能和兩個相同的抗原結合;另一片段類似Fc，隨後被分解成小分子多肽，無生物活性。

IgM是由五個單體組成的五聚體，含10個重鏈和10個輕鏈，具有10個抗原結合價，由於空間位置的影響，只表現為五個抗原結合價。IgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000。

機體被微生物感染後，先產生IgM抗體，然後產生IgG抗體。經過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊癒後可持續數年之久。

IgM抗體一般為保護性抗體具有免疫性。

因此IgM抗體的測定，對某些傳染病如甲

型肝炎有較高的臨床診斷價值。

右圖為為甲型肝炎病人血清中IgG抗體和

IgM抗體出現的時間和水平。

2.2 抗體的產生

機體受抗原刺激後，B淋巴細胞產生相應的抗體。含有抗體的血清稱為抗血清(antiserum)。每一系B細胞只產生針對某一抗原決定簇的抗體。如將多種抗原或含有多個抗原決定簇的抗原注入機體，則將由多系的B細胞產生相應的多種抗體，這些抗體均存在於免疫血清中。免疫測定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或馬製得。產生抗體的B細胞可在體外與繁殖力強的腫瘤細胞融合成雜交瘤細胞。將單個雜交瘤細胞分離，在體內或體外培養而分泌的抗體單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb或Mab)。單克隆抗體僅針對一種抗原決定簇，具有很高的特異性。單克隆抗體通常用抗原免疫小鼠制備。將免疫的脾細胞(含產生抗體的B細胞)與小鼠腫瘤細胞融合，分離雜交瘤細胞，接種於小鼠腹腔，產生的腹水中含有濃度很高的單克隆抗體。

3抗原抗體反應

3.1可逆性

抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態平衡，其反應式為：Ag+Ab→Ag·Ab抗體的親和力(affinity)是抗原抗體間的固有結合力，可以用平衡常數K表示：K=[Ag·Ab]/[Ag][Ab]Ag·Ab的解離程度與K值有關。高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離後的抗原或抗體均能保持原有的結構和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的IgG抗體僅占總IgG中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱為親和層析純抗體，應用於免疫測定中可得到更好的效果。

3.2最適比例

在恆定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復合物(沉澱)的量見圖1-4。曲線的高峰部分是抗原抗體比例最合適的范圍，稱為等價帶(zone of equivalence)。在等價帶前後分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。如果抗原或抗體極度過剩，則無沉澱物形成，在免疫測定中稱為帶現象(zone phenomenon)。抗體過量稱為前帶(prezone)，抗原地過量稱為後帶(postzone)。在用免疫學方法測定抗原時，應使反應系統中有足夠的抗體量，否則測得的'量會小於實際含量，甚至出現假陰性。

3.3特異性

抗原抗體的結合實質上只發生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由於兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗體(HBcAg)，隨來源於同一病毒，但僅與其相應的抗體結合，而不與另外兩種抗體反應。抗原抗體反應的這種特異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質化合物(例如血清)中測定某一特定的物質，而不需先分離待檢物。

但是這種特異性也不是絕對的。假使兩種化合物有著部分相同的結構，在抗原抗體反應中可出現交叉反應。例如：絨毛膜促性腺激素(hCG)和黃體生成激素(LH)均由α和β兩個亞單位組成，其結構的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的。用hCG免疫動物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG兩種抗體，抗α-hCG抗體將與LH中的α酶位發生交叉反應。在臨床檢驗中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用於hCG濃度較高的試驗，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發生交叉反應。因此在作為早孕診斷(敏感度應達到0mIu/mlhCG)的實際中必須應用只對hCG特異的抗β-hCG，以避免與其它激素的交叉反應的發生。

3.4敏感性

在測定血清中某一物質的含量時，化學比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應測定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿。標記的免疫測定的敏感度可提高數千倍，達ng/ml水平。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg，其敏感度可達0.1ng/ml。

4免疫測定在臨床檢驗中的應用

由於各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應的抗原，因此免疫測定的應用范圍極廣，在臨床檢驗中可用於測定：

1) 體液中的各種蛋白質，包括含量極少的蛋白質如甲胎蛋白等。

2) 激素，包括小分子量的甾體激素等。

3) 抗生素和葯物。

4) 病原體抗原，HBsAg、HBeAg等。

5) 另外，也可利用純化的抗原檢測標本中的抗體，例如抗-HBs等。

5. 標記的免疫測定

如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體反應後直接測定形成的沉澱或濁度，敏感度可達5~10μg/ml，但在臨床檢驗中，某些待測物在標本中的含量遠低於這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質加以標記，通過測定標記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標記物分別為放射性核素和酶，最後用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉澱物提高數百至數千倍。在標記免疫測定中，一般加入過量的標記試劑以保證與待測物徹底反應。以標記抗體(Ab※)檢測抗原(Ag)為例，反應式如下：Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※

在反應產物中有與Ag結合的Ab※和游離和Ab※，如不將兩者分離而測定標記物，測得的結果將為兩者之和。因此，游離標記物與結合標記物的分離是標記免疫測定中的重要步驟。可採用多種手段，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然後再與標記的抗原或抗體直接反應，結合的標記物被固定在載體上，而游離的標記物留於溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab※除去，結合標記物的測定可在固相上進行。

6. 酶免疫測定

酶免疫測定(enzyme immunoassay)可分為均相(homogenous)和非均相(heterogenous)兩種類型。在均相EIA中可不需進行游離的和結合的標記物的分離而直接測定標記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應後形成的酶標記抗原抗體復合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標記物。均相EIA在臨床檢驗中較少應用。非均相EIA需先進行游離的和結合的標記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay)，簡稱ELISA，在國內有譯作酶聯免疫吸附試驗的，雖然含義不完全確切，但已慣用。

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③ 免疫測定法與液相色譜串聯質譜法的優缺點

免疫測定法與液相色譜串聯質譜法的優缺點如下，
認識到液相色譜-質譜/質譜是一項戰略技術，許多臨床實驗室現在正在使用它來代替其他方法。傳統上，免疫測定主要用於測量低分子量化合物。然而，它們受到一些限制，包括特異性問題、不同製造商的測試之間缺乏一致性，以及由於抗體的交叉反應性不同，同一製造商的批次之間存在差異。此外，異嗜抗體和鉤效應可能會限制許多免疫測定的動態測量范圍。

另一方面，質譜/質譜對許多分析物具有優異的選擇性，因為它通過至少兩個物理特徵來識別它們，——它們的母離子和產物離子質量。隨著軟電離技術(如電噴霧電離和大氣壓化學電離)的引入，低分子量分子可以在液相中電離，從而實現高性能液相色譜和質譜/質譜的耦合.當質譜與液相色譜結合使用時，保留時間增加了另一個屬性，以正確識別分析物，從而提高特異性。

檢驗科也經歷過廠家意外將免疫檢測退出市場的情況，這讓實驗室瘋狂尋找替代方法將檢測結果返還給訂購醫生。這些經驗為實驗室改用液相色譜-串聯質譜法提供了另一個理由

質譜/質譜還顯示出靈活性和多功能性，使實驗室能夠在美國食品和葯物管理局批準的用於測量生物標志物或新批准葯物的試劑盒或免疫測定進入市場之前，提供新的實驗室開發的測試(LDT)。此外，與免疫分析和其他方法相比，液相色譜-質譜/質譜的靈敏度可能會使某些分析物(如類固醇)的檢出限較低。

液相色譜-質譜/質譜的另一個優點是，它使臨床實驗室能夠同時對各種感興趣的分析物進行多重分析、鑒定和定量。多路復用降低了每次測試的成本。與固相萃取或衍生化等更耗時、更昂貴的樣品制備方法相比，液相色譜-質譜/質譜通過簡化或最大限度地減少某些應用(如稀釋和注射或蛋白質碰撞)的樣品制備，提供了其他成本節約和更高的通量。在其他方法中，如氣相色譜(GC)，極性化合物的衍生化或化學修飾是必要的，因為這些化合物必須具有足夠的揮發性才能進行分析。然而，衍生化過程增加了樣品制備的時間、人力和成本。

④ 免疫檢測方法

免疫檢測方法大全2017

免疫學檢測技術的用途非常廣泛，它們可用於有關免疫疾病的診斷、療效評價及發病機制的研究。如對傳染病、免疫增殖性疾病、免疫缺損病、超敏反應、自身免疫病、移植排斥反應腫瘤的免疫學檢測，對診斷、治療均有很大幫助。此外在醫學生物學研究中對抗原性物質或細胞的定性、定量檢查不僅推動了對各種免疫學現象的研究，而且擴大免疫學與醫學生物許多領域的聯系。本章僅介紹常用免疫學檢測方法的原理，簡要過程和實用意義。下面是我為大家帶來的關於免疫學檢測法的知識，歡迎閱讀。

第一節抗原或抗體的檢測

一、檢測的原理

藉助抗原和抗體在體外特異結合後出現的各種現象，對樣品中的抗原或抗體進行定性、定量、定位的檢測。

1.抗原與抗體的親和力(affinity)抗原抗體的結合就像酶與底物的結合，激素與其受體的結合一樣不是化學的反應，而是非共價鍵的可逆的結合。抗原決定簇和抗體分子可變區互補構型，造成兩分子間有較強的親和力。空間構型互補程度不同，抗原和抗體分子之間結合力強弱也不同。互補程度高，則親和力強。此外，反應溫度、酸鹼度和離子濃度對抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響，抗體與抗原決定簇之間的結合力大小可用親合力來表示。高親合力的抗體與抗原的結合力強，即使抗原濃度很低時也有較多的抗體結合抗原形成免疫復合物。

2.抗原或抗體外檢測原理根據抗原抗體結合形成免疫復合物的性狀與活性特點，對標本中的抗原或抗體進行定性、定位或定量的檢測。定性和定位檢測比較簡單，即用已知的抗體和待檢樣品混合，經過一段時間，若有免疫復合物形成的現象發生，就說明待檢樣品中有相應的抗原存在。若無預期的現象發生，則說明樣品中無相應的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測樣品中是否有相應抗體。

對抗原或抗體進行定量檢測時，以反應中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫復物的濃度呈函數關系。

(1)根據免疫復合物產生的多少來推算樣品中抗原(或抗體)的含量：在一定的反應條件下，加入的已知抗體(或抗原)的濃度一定，反應產生的免疫復合物多少與待檢樣品中含有相應抗原(或抗體)量成正比。也就是抗體濃度一定時，免疫復合物越多則樣品中的抗原量也越多。可用實驗性標准曲線推算出樣品中抗原(或抗體)的含量。如免疫單向擴散試驗、免疫比濁試驗和酶聯免疫檢測等都屬於這類方法。

(2)抗原或抗體效價滴定的原理：當抗原抗體復合物形成多少不能反應抗原抗體反應強弱時，就不能以檢測反應強度來對抗原或抗體進行定量。在實際工作中，把濃度低的反應成分(抗原或抗體)的濃度固定，把濃度高的另一種反應成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3隻家兔，比較3隻家兔產生抗體的多少，即滴定3隻兔血清抗體效價，可用雙向瓊脂擴散法來滴定，例如將抗體濃度固定，將抗原作不同的稀釋度，分別將抗原或抗體滴入瓊脂的相應小孔中，觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現明顯沉澱淺的抗原稀釋度(如甲兔的抗體效價為1/2000，而丙免的是1/8000則可比較出後者比前者產生抗體的效價要高)。也就是表示效價的稀釋度越高，樣品中所含待檢成分越多。因人血清(抗原)和抗體(免疫兔血清)相比，濃度高，故應稀釋抗原。

二、抗原或抗體檢測的實用意義

1.抗體檢測的意義檢測抗體可用於評價人和動物免疫功能的指標。抗體用於臨床治療或實驗研究時也需做純度分析和定量測定。臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、抗過敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體，對有關疾病的診斷有重要意義。

2.抗原檢測的意義可做為抗原進行檢測的物質可分為以下四類：

(1)各種微生物及其大分子產物：用於傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以及對菌苗、疫苗的研究。

(2)生物體內各種大分子物質：包括各種血清蛋白(如各類免疫球蛋白、補體的各種成分)、可溶性血型物質、多肽類激素、細胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進行檢測。在對這些成分的生物學作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。

(3)人和動物細胞的表面分子：包括細胞表面各種分化抗原(如CD抗原)、同種異型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相關抗原和腫瘤相關性情抗原等。檢測這些抗原對各種細胞的分類、分化過程及功能研究、對各種與免疫有關的疾病的診斷及發病機制的研究，均有重要意義。

(4)各種半抗原物質：某些葯物、激素和炎症介質等屬於小分子的半抗原，可以分別將它們偶聯到大分子的載體上，組成人工結合的完全抗原。用其免疫動物，制備出各種半抗原的抗體，應用於各種半抗原物質的檢測，例如對某些病人在服用葯物後進行血中葯物濃度的監測。對運動員進行服用違禁葯品的檢測，都是應用半抗原檢測的方法。

三、抗原或抗體檢測的方法

由於各種檢測方法中所用的抗原性狀不同，出現結果的現象也不同。最廣泛應用方法有下述幾種：

(一)沉澱反應

可溶性抗原與抗體結合，在兩者比例合適時，可形成較大的不溶性免疫復合物。在反應體系中出現不透明的沉澱物，這種抗原抗體反應稱為沉澱反應(precipitation neaction)。

1.環狀沉澱試驗先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小於0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊於上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復合物沉澱環，故名為環狀沉澱試驗(ring precipitationtest),此法簡便易行，需用材料較多是其缺點。

2.單向免疫擴散試驗單向免疫擴散試驗(single immunodiffusion)是在凝膠中進行的沉澱反應。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注於玻片上，製成含有抗體的瓊脂板，在適當位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復合物。當復合物體積增加到一定程度時停止擴散，出現以小孔為中心的圓形沉澱圈，沉澱圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關。本方法簡便，易於觀察結果，可測定抗原的靈敏度(最低濃度)約為10～20μg/ml，常用於定量測定人或動物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點是需1～2天才能看結果

3.免疫比濁法 當抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見的小免疫復合物，它可使通過液體的光束發生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復合物也增多，光散射現象也相應加強。免疫比濁法(immunonephelomytry)就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經過一段時間，用光散射濁度計(nephelometry)測量反應液體的濁度，來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便，可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。

4，雙向免疫擴散試驗 雙免疫擴散試驗(double immunodiffusion)是在瓊脂板上按一定距離打數個小孔，在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現2～3條沉澱線，本法常用於抗原或抗體的定性或定量檢測，或用於兩種抗原材料的抗原相關性分析。

5.對流免疫電泳對流電泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴散。將瓊脂板放入電泳槽內，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，於負極側的孔內加入抗原，於正極側的孔內加入抗體，通電後，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉澱線。只需1小時左右即可觀察結果。

6.免疫電泳 免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個步驟，即先進行電泳，再進行瓊脂擴散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然後在適當的位置上沿電泳方向挖一直線形槽，於槽內加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散，可形成多答卷沉澱線。常用此法進行血清的蛋白種類分析。對於免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義

7.免疫印跡法免疫印跡法(immunoblotting)又稱為Western印跡法，用於AIDS的血清抗體檢測。第一步，為電泳分離HIV抗原，在電場中根據分子量大小不同病毒抗原各成分散開。第二步，將電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維膜上(電印跡)，然後將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕於病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾種抗原相對應的抗體的話，則在該抗原印跡部位形成免疫復合物沉澱。在洗去未沉澱的抗原和抗體後，在膜上加標記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復合物發生反應，最後加入顯色底物(如果抗人Ig是用酶標記的)或做放射自顯影(抗人Ig用125Ⅰ標記)以顯示結果

第一步：經電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離;

第二步：將已分離的抗原經電印跡轉移到硝酸纖維膜上;

第三步：將待檢病人血清加入覆蓋於硝酸纖維膜上;

第四步：加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上;

第五步：加入顯色底物(或放射自顯影)顯現第二抗體

(二)凝集反應

細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆粒抗原，當與相應抗體結合，抗原與抗體結合形成凝集團塊，即稱為凝集反應(agglutination)。

1.直接凝集 直接凝集(direct agglutination)是將細菌或紅細胞與相應抗體結合產生的細菌凝集或紅細胞凝集現象。可用於傳染病診斷如肥達氏反應(Widal reaction)診斷傷寒病。或利用血細胞凝集現象檢查血型。

2.間接凝集 間接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳膠顆粒或紅細胞表面，與相應抗體混合出現的凝集現象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測類風濕關節炎病人血清中的類風濕因子，用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用於檢測甲狀腺球蛋的抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標本中的抗原，如細菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒，一旦與含有相應抗原的腦脊液混合，便可發生凝集，可進行快速診斷。故凝集反應即可測定抗原，也可測抗體，方法簡便、敏感。

3.抗球蛋白試驗 抗球蛋白試驗(antiglobulin test,coombs test)的原理為間接凝集試驗。例如應用於診斷自身免疫溶血性貧血症時，Rh+紅細胞與抗Rh血清間的反應。因抗Rh抗體是IgG只有兩個結合價，分子較小(不如IgM結合價多，分子大)很難直接引起Rh+紅細胞凝集。如果加入抗IgG的抗體，就可幫助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細胞。也就是經抗Ig的作用提高凝集反應的'靈敏度。

(三)補體參與抗原抗體反應

這一類反應主要包括溶血反應(hemolytic assay)、補體介導的細胞毒試驗(complement mediated cytotoxicuty test)及補體結合試驗(complement fixation test)。

1.溶血反應 抗體與紅細胞表面抗原相遇，形成紅細胞-抗體復合物即可使加入反應中的補體活化，導致紅細胞溶解，此方法可用於紅細胞的各種抗原或相應抗體的檢測，此法比凝集反應敏感。溶血反應也是用於抗體分泌細胞即空斑形成細胞(PFC)檢測的原理。

2.補體介導的細胞毒試驗各種有核細胞與針對其表面抗原的抗體相遇，所形成的免疫復合物能活化反應中的補體，引起細胞膜穿孔，在一定時間內，細胞仍能維持一定的形態不破碎，加入水溶性染如伊紅Y(eosin Y)或台盼藍(trypan blue)後，染料即可進入被活化補體穿孔的細胞，不帶相應抗原細胞膜保持完整的活細胞不著色。此方法可用於帶各種抗原的細胞的檢測，如進行細胞MHC抗原的鑒定，和進行淋巴細胞中T細胞總數或其亞類的計數。在一些免疫學實驗中也可用這種方法，根據需要特異地消除帶某種抗原的細胞。

3.補體結合試驗當抗原(可溶性或顆粒性)與相應抗體結合，由於濃度低不出現可見反應時，應用補體結合試驗可檢出此抗原抗體反應，它比凝集反應或沉澱反應靈敏度高。本法包括兩個抗原抗體系統。一為檢測系統由待檢樣品與已知抗原(或抗體)組成;另一為指示系統，由綿羊紅細胞(SRBC)和抗SRBC組成。另加入作為補體的新鮮豚鼠血清。試驗時試管中先加入檢測系統和補體，混合經37℃30分鍾使抗原、抗體、補體形成復合物，再加入指示系統，如出現溶血現象，說明檢測系統中沒有相對應的抗原抗體，補體是游離的指示系統的SRBC和抗體結合而出現溶血，即為反應陰性。如不出現溶血，表明檢測系統中有抗原抗體復合物並結合補體，則指示系統無多餘的補體作用而沒有溶血現象，即為陽性。

在敏感的抗原、抗體檢測方法(如酶標方法)出現之前補體結合試驗曾廣泛用於檢測各種細菌、病毒或螺旋體(如梅毒)的抗原或抗體，由於本試驗影響因素多，結果不穩定現已被新檢測方法所代替。

四、用標記抗體或抗原進行的抗原、抗體反應

用熒光素、同位素或酶標記抗體或抗原，用於抗原或抗體檢測是目前廣泛應用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標記物與抗原或抗體化學連接之後不改變後者的免疫特性。本方法可用於定性、定量或定位檢測。

1.免疫熒光技術免疫熒光技術(immunofluorescence techni)是用化學方法使熒光素標記的抗體(或抗原)與組織或細胞中的相應抗原(或抗體)結合，進行定性定位檢查抗原或抗體的方法。

(1)直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細胞懸液，細胞塗片或組織切片上進行染色，經抗原抗體反應後，洗去未結合的熒光抗體，將待檢標本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應抗原存在，此法可用於病毒感染細胞、帶某種特異抗原的細胞(如T細胞和B細胞)或病原菌的檢查，也可用於組織中沉著的免疫復合物的檢查。本法的缺點是檢查多種抗原，就需分別制備相應的多種標記抗體。

(2)間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復雜操作。將組織或細胞上的抗原直接與相應抗體(不標記熒光)結合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結合的熒游標記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒游標記的第二抗體，觀察結果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用於檢查抗原的第一抗體是人或動物的只需制備一種抗人或動物的免疫球蛋白熒光抗體

免疫熒光技術在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查抗原或抗體，如查出IgM抗體，可做為近期接觸抗原的標志，所以使用熒游標記抗IgM可診斷近期感染。除微生物學方面的應用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細胞的亞類。使用流式細胞儀(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自動檢測細胞的大小、熒光強度。針對細胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素(FITC)發黃綠熒光，用羅丹明(TMRITC)發紅色熒光。由於熒光顏色不同標記兩種不同的抗體，對同一細胞進行雙標記染色。對淋巴細胞亞類鑒定起著巨大推動作用。應用間接熒光法也用於自身免疫病的抗核抗體檢查。

2.放射免疫分析法 放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)應用競爭性結合的原理，應作放射性同素標記抗原(或抗體)與相應抗體(或抗原)結合，通過測定抗原抗體結合物的放射活性判斷結果，本方法可進行超微量分析，敏感性高，可用於測定抗原、抗體、抗原抗體復合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。

放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：

(1)液相法：將待檢標本(例如含胰島素抗原)與定時的同位素標記的胰島素(抗原)和定時的抗胰島素抗體混合，經一定作用時間後，分離收集抗原抗體復合物及游離的抗原，測定這兩部分的放射活性，計算結合率。在反應系統中，待檢標本的胰島素抗原與同位素標記的胰島素競爭奪戰性與胰島素抗體結合。非標記的抗原越多，標記抗原與抗體形成的復合物越少。非標記抗原含量與標記抗原抗體復合物的量呈一定的函數關系。預先用標準的非標記抗原作成標准曲線後，即可查出待檢標本中胰島素的含量

(2)固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然後加待檢標本，最後加標記抗體。測定固相載體的放射活性，常用的固相載體有溴化氰(CNBr)海豹化的紙片或聚苯乙烯小管

放射免疫分析法應用范圍廣泛，包括多種激素(胰島素、生長激素、甲狀腺素等)維生素、葯物、IgE等。

3.酶聯免疫分析法 酶聯免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是當前應用最廣泛的免疫檢測方法。本法將抗原抗體反應的特異性與酶對底物高效催化作用結合起來，根據酶作用底物後顯色，以顏色變化判斷試驗結果，可經酶標測定儀作定量分析，敏感度可達ng水平。常用於標記的酶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酶(alkaline phosphatase)等。它們與抗體結合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩定性，製成酶標抗體可保存較長時間。目前常用的方法有酶標免疫組化法和酶聯免疫吸附法。前者測定細胞表面抗原或組織內的抗原;後者主要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。

(1)酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是與上述固相RIA相似的原理，將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行政區。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。

(2)夾心法(sandwich assay):將已知的特異抗體包裝在固相載體(塑料板凹孔或紙片上)，加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。

間接法(indirecr ELISA)常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本(可能含有相應抗體)，再加入酶標抗Ig的抗全(即第二抗體)，經加底物顯色後，根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。

(3)BAS-ELISA：近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素(avidin)分子可以結合4個生物素分子(biotin)。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合，而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA)，它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統，同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。

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