『壹』 基因表達量的研究方法
差異基因表達的研究受到了廣泛的關注，常用的技術有DD-PCR；GENE-FISHING；GENE CHIP等。簡單介紹如下：
DDRT—PCR技術即mRNA差異顯示聚合酶鏈式反應技術，此技術是以PCR技術和聚丙烯凝膠電泳技術為基礎，結合銀染或放射性自顯影等顯色技術，能快速有效地鑒定並克隆兩個或多個平行材料之間的差異表達基因。DDRT—PCR技術的基本過程如下：
①提取兩組平行材料中的總RNA或mRNA；
②在逆轉錄酶作用下，以Oligo dT12MN為錨定引物將mRNA反轉錄成cDNA；
③ 以cDNA為模板利用10一mer隨機引物和錨定引物進行PCR擴增；
④ 聚丙烯醯胺凝膠電泳分離PCR擴增產物，結合銀染等顯色方法獲得平行材料間的差異cDNA片段，回收並再擴增差異片段；
⑤Northern blotting檢測差異cDNA片段是否為陽性片段；
⑥克隆cDNA片段並測序；
⑦ 根據測序結果篩選cDNA文庫或使用RACE技術獲得cDNA片段側翼序列，進而獲得其全長cDNA基因。
GeneFishing技術用來檢測不同樣品間的表達差異。該技術著眼於解決目前用來檢測基因表達差異的方法所面臨的問題，如晶元技術和差異顯示技術。該技術的實驗包括以下三個步驟，反轉錄PCR (RT) 和兩步法PCR (GeneFishing PCR)。
第一步: 用dT-ACP1引物合成cDNAs的第一鏈。dT-ACP1引物的3′端與mRNA的多聚A互補。這樣第一鏈cDNA包含了dT-ACP1引物 5%26acute;端的通用序列。
第二步: 把第一步得到的第一鏈cDNA稀釋後和隨機ACP及dT-ACP2一起加到PCR管。隨機ACP引物的3′端序列能有效的結合到第一鏈cDNA的某一部位。在第一步PCR時，通過控制條件只能使隨機ACP的3′端特異的結合到第一鏈cDNA的特定位置，而阻止dT-ACP2的3′端退火結合到第一鏈cDNA。通過第一步PCR合成第二鏈cDNA，其3′端包含了dT-ACP1通用序列的互補序列，而其5′端包含了隨機ACP的通用序列。第三步: 來自第二步的PCR管的混合物在更嚴格條件下進行第二步PCR，這時使dT-ACP2和隨機ACP能各自退火結合到第二步得到雙鏈cDNA的3′ 端和5′端。既然第二鏈cDNA的3′端序列與隨機ACP引物的通用序列互補，而其5′端與dT-ACP2的通用序列互補，這樣保證了只擴增目標產物。該技術特點如下
(1) 無假陽性。GeneFishing技術鑒別的差異表達基因均可通過Northern Blot分析或RT-PCR證實！現有的DEG檢測方法，例如生物晶元和差異顯示技術的主要瓶頸就是假陽性的存在。無假陽性可以使研究者能快速辨別可信的差異表達基因。
(2) 無需PAGE（聚丙烯醯胺凝膠），瓊脂凝膠法即足夠。退火控制引物(ACP)極大地提高了PCR擴增的特異度和靈敏度，從而產生特異PCR產物。而且，GeneFishing 技術只需要少量的起始物質。PCR產物可以在標準的溴化乙啶染色的瓊脂凝膠中被檢測，因而省去了使用PAGE（聚丙烯醯胺凝膠）的繁瑣處理步驟。使用GeneFishing 技術在瓊脂凝膠中產生的條帶具有足夠濃度，可以被Northern Blot方法檢測。
(3) 無需昂貴的檢測方法。放射性/熒光檢測方法由於其成本和危險性而不能廣泛應用。昂貴的檢測方法是現今差別表達基因檢測的另一缺點。因此，可以使用標准溴化乙啶染色的瓊脂凝膠來進行檢測是GeneFishing 技術的一個主要優勢。
(4) 重復性保證。GeneFishing技術的所需反應試劑均由試劑盒提供。這樣防止了由於使用舊的，不匹配的試劑而帶來的變化，確保了可靠的重復性。
(5) 無需特殊技術。GeneFishing 技術是一種以PCR技術為基礎的創新方法，簡單易用。
(6) 快速經濟。GeneFishing技術使得研究者可以在5小時內確認有效的差異表達基因，不必因為假陽性而浪費時間。相比之下，所有其他DEG篩選方法都需要大量的後續工作和時間來鑒別有效的差異表達基因。
(7) 大范圍的PCR產物。每一個GeneFishing PCR反應產生從150bp至2kb長度范圍的PCR產物，這不僅提高了鑒別差異表達基因的機會，還為預測基因功能提供了更多的有效序列信息。
基因晶元技術的原理類似我們日常所說的計算機晶元，只是在固體基質上的不是集成著各種半導體管，而是成千上萬的基因探針，待分析的樣品通過和晶元中已知序列的DNA片段鹼基互補雜交，經過計算機的分析，從而確定待測核酸序列和性質，表現出基因表達量和一些序列本身的特性。該技術主要包括四個環節：晶元微列陣制備，樣品制備，生物分子反應和信號的檢測分析。目前的制備方法主要是採用表面化學的方法或是組合化學的方法來處理固相基質，如玻璃片或矽片。在固體材料中刻出微濾柵、微通道，並加上微泵、微閥來控制流體。然後將探針以預先設計的順序固定在固體基質上。微列陣制備技術主要有兩種基本方法：原位合成法和點樣法。
以上三項技術比較如下：
發現新基因
假陽性
PCR產物長度
檢測方法
重復性
GeneFishing
能
沒有
達到2kb
瓊脂糖凝膠
高
Gene Chip
否
高
N/A
熒光
低
DD-PCR
否
高
100-500bp
熒光或放射
低
參考資料：試驗方案
『貳』 檢測dna上的目的基因是否表達常用的檢測方法是
A 對目的基因的檢測和表達檢測的方法混淆，不能准確應用。目的基因的檢測常採用DNA分子雜交技術，即將含有目的基因的DNA片段用放射性同位素作標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA雜交，若出現雜交帶，則表明目的基因已插入到染色體中。DNA—RNA分子雜交與抗原——抗體雜交法是目的基因的表達檢測。目的基因是否轉錄出了相應的信使RNA分子，用DNA—RNA分子雜交法檢測。細胞內是否合成了由目的基因控制的蛋白質，使用抗原——抗體雜交法檢測。要准確區分目的基因的檢測和表達檢測使用的方法。顯微注射技術是目的基因導入受體細胞的方法。
『叄』 外源基因表達的檢測是什麼
檢測外源基因是否轉化成功，首先對報告基因進行檢測，然後再進行目的外源基因的檢測。目的外源基因的表達可分轉錄和翻譯兩個水平，轉錄是以DNA為模板合成mRNA的過程，翻譯則是指以mRNA為模板翻譯成蛋白質。目的基因表達檢測亦可在兩個水平上進行，在轉錄水平上對mRNA進行檢測，在翻譯水平上對蛋白質進行檢測。
1.報告基因的酶法檢測
主要的報告基因，例如Gus基因、Cat基因、冠癭鹼合成酶基因、NptⅡ搭慶汪基因和熒光素酶基因皆可根據各自的功能，採用酶法檢測。
2.外源基因轉錄水平上的檢測。
Northern雜交（Northernblotting）以RNA為探針，檢測外源基因轉錄產物特異mRNA。Northern雜交也有斑點雜交和印跡雜交。斑點雜交只需將RNA樣品點樣在固相膜上直接與探針雜交，但只能鑒定外源基因是否轉錄；而Northern印跡雜交則需將RNA樣品進行電泳分離，然後轉移到固相膜上，再與探針雜交，可對外源基因的轉錄狀況進行較詳細的分析。Dot-Northern雜交是將總RNA提取物經多孔過濾進樣器直接轉移到雜交膜上，其餘步驟與Northern雜交相同。Northern雜交對細胞中低豐度的mRNA檢出率較低。
3.外源基因翻譯水平上的檢測
外源基因翻譯水平上的檢測通常用Western雜交（Westernblotting）。Western雜交是將蛋白質電泳、印跡、免疫測定融為一體的知仔特異蛋白質檢測方法。轉化的外源基因正常表達時，轉基因植株細胞中含有一定量的目的蛋白。從植物細胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質樣品溶解在含去污劑和還原劑的溶液中，經SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳使蛋白質分離開來，將分離的各蛋白質條帶原位轉移到固相膜上，膜在高濃度的蛋白質溶液中溫育，以封閉非特異性座位。然後差岩加入特異性抗體（一抗），印跡上的目的蛋白與一抗結合後，再加入能與一抗特異性結合的二抗，二抗事先已經標記，根據二抗上標記化合物的性質檢出。由檢測結果，可知目的蛋白是否已在被檢植物細胞中表達、其濃度以及大致的分子量。
『肆』 檢測基因表達水平差異的方法有哪些
基因的表達是dna-rna-蛋白,期間有轉錄水平調控、轉錄後調控、翻譯後調控等多種調控機制影響該基因的表達.
所以蛋白水平高低的原因就可能是多方面的.蛋白表達多,可能是mrna多,也可能mrna變化不大,而是翻譯多了；蛋白表達少,原因亦然.
從2個水平檢測一個基因的表達,可以更全面地了解該基因在該組織某個時期或某種條件下的變化受到什麼水平的調控.
所謂基因表達,就是從dna到mrna再到蛋白的一個過程,基因表達水平一般是通過該基因轉錄的mrna的多少來衡量的.
每個基因轉錄產生的mrna的量,是受到時空等多種因素調控的,個體在不同的生長發育階段,或者不同的組織水平,基因轉錄出mrna的量都是不一樣的.
例如,當某種植物長期生長在高鹽的環境里,該植物體內與抗鹽相關的基因的表達量就會增加,以適應這種高鹽環境,是植物能夠生存下來,這時植物抗鹽相關的基因表達水平就相對高
檢測基因表達的方法：
轉錄水平檢測：rt-pcr，real-time pcr，northern blot
翻譯水平檢測：western blot
還有直接檢測，如報告基因、融合熒光蛋白等。
rt-pcr是反轉錄pcr，是半定量方式。real-time pcr可以精確定量。 二者不同。後者為了區別於rt-pcr，一般不縮寫。
各位觀眾老爺們大家好!我是吆五，打算從今以後不定期分享一些生物類的專業知識。
一方面供自己學習積累，另一方面也希望對大家有所幫助。
生物是很枯燥的呢
『伍』 如何檢測基因表達水平
1 western bloting
a.將編碼目標蛋白基因通過載體進行體外重組，然後導入宿主細胞表達
b.將目標蛋白注入兔子或其他動物體內獲得一抗
c.將樣品蛋白進行聚丙烯醯胺凝膠電泳、轉移、吸附固定
d.用一抗與之雜交再用二抗檢測其是否表達
2 fluorescent real-time PCR
a.提取樣品總RNA，再通過超速離心獲得mRNA
b.用逆轉錄酶獲得cDNA
c.加入特異性探針
d.利用專門的儀器檢測熒光強度即可
3半定量 PCR
a.提取樣品總RNA，再通過超速離心獲得mRNA
b.用逆轉錄酶獲得cDNA
c.做半定量PCR
4cDNA microarray
5蛋白質 晶元
實質就是高通量的分子雜交，免疫酶連反應再運用計算機處理
『陸』 想測試一個基因的MRNA表達量，用什麼方法最好如果是原位雜交和免疫組化是不是定量不準那RT-PCR呢
對於基因蛋白表達的定量一般不會用到原位雜交和免疫組化，這兩個方法的優點是更加直觀，但定量困難，適合用作定性實驗。個人認為定量實驗檢測最好用RT-PCR進行核酸層面的檢測，或者用免疫學方法直接檢測蛋白量，比如ELISA等；蛋白電泳（包括2D）可以進行半定量的實驗。另外定量實驗要注意的是選擇合適的內參，電泳要注意平衡好上樣量。
『柒』 檢測目的基因是否表達的方法是
基因工程第四步中包括導入檢測，轉錄檢測和翻譯檢測，方法分別是DNA分子雜交技術、分子雜交技術、抗原-抗體雜交技術。有的還可在個體水平是進行檢測，如抗性檢測等
『捌』 列舉3種研究基因在體內表達方式的試驗方法
目的比較不同途徑遞送質粒DNA至Balb/c小鼠體內所誘導的報告基因表達效果。方法將編碼熒光素酶(luc+)蛋白的重組質粒(pGL-3-CMV)或空載體質粒pGL-3-basic以肌肉注射或電脈沖方法將10μg或100μg上述質粒注入小鼠股四頭肌,基因槍法以三槍接種質粒於小鼠腹部(2μg質粒DNA/4.5Mpa/槍)。於質粒注入後24~144h,檢測小鼠體內的熒光素酶活性。結果肌肉注射10μg的小鼠未檢測到熒光素酶的表達;肌肉注射100μg、電脈沖法遞送10μg和100μg質粒的小鼠,接種後48h體內熒光素酶活性達到峰值,遞送100μg的小鼠體內表達量明顯高於10μg的小鼠。基因槍免疫小鼠在接種24h達到峰值。結論電脈沖和基因槍介導的基因遞送方式基因表達水平遠遠高於傳統注射方法,是基因疫苗免疫遞送的可靠方法