大腸菌的三種檢測方法

A. 怎麼檢驗飲料中的大腸桿菌

大腸桿菌檢驗（包括(一)檢驗方法；(二)培養基 ）

(一)檢驗方法
1．乳糖發酵試驗。以無菌操作採取樣品，採取量及稀釋倍數，依據國家或當地衛生標准要求及樣品污染情況而定。將待檢樣品接種於乳糖膽鹽發酵管內，接種量在l m J以上者，用雙料乳糖膽鹽發酵管，lm1及1mI以下者，用單料乳糖膽鹽發酵管。每一稀釋度接種3管，置36±l℃溫箱內，培養24±2小時，如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性；如有產氣者，則按下列程序進行。
2．分離培養。將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36±l℃溫箱內，培養18～24小時，然後取出，觀察菌落形態，並作革蘭氏染色和證實試驗。
3．證實試驗。在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落l～2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發酵管，置36±1℃ 溫箱內培養24±2小時，觀察產氣情況。凡乳糖管產氣，革
蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。
4．報告。根據證實為大腸菌群陽性的管數，查MPN檢索表，報告每l 00ml(g)大腸菌群的最可能數。
———————————————————————————
(二)培養基

①乳糖膽鹽發酵培基

成分：蛋白腖：20g
豬膽鹽(或牛，羊膽鹽)：5g
乳糖:10g
0．04％溴甲酚紫水溶液: 25m1
蒸餾水: 1 000m1
製法：將蛋白腖、膽鹽及乳糖溶於水中，校正pH，加入指示劑，分裝每管l 0ml，並放入一個小倒管，高壓滅菌115℃15分鍾。
附註：雙料乳糖膽鹽發酵培基除蒸餾水外，其他成分加倍。
用途：乳糖發酵試驗用。
原理：細菌分解糖類是依靠細菌細胞所產生的各種酶類的作用，細菌產生的分解糖類的酶，隨細菌種類不同而異，可以此來鑒別細菌。
乳糖是雙糖，細菌分解雙糖的酶大多是胞外酶。乳糖被乳糖酶水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖可直接被細菌利用，而半乳糖則需在細胞內轉化為葡萄糖後再被利用。
糖發酵試驗主要是測定細菌分解糖類以後所產生的酸，以培基pH降低(指示劑變色)作為觀察結果的指標。
大腸桿菌等細菌在酸性環境中，由於甲酸脫氫酶的作用，可使甲酸分解成CO2和H2，在培基中產生大量氣體，進入倒管中，以便觀察。
註：常用於供發酵試驗的各種糖類、醇類和糖苷類(見表3-1)

②伊紅美藍瓊脂培基
成分：蛋白腖 10g
乳糖 10g
磷酸氫二鉀 2g
瓊脂 17g
2％伊紅Y溶液 20ml
0．65％美藍溶液 10ml
蒸餾水 1000ml
pH7.1
製法：將蛋l白腖、磷酸鹽和瓊脂溶解於蒸餾水中，校正pH，分裝於燒瓶內，高壓滅菌121℃15分鍾備用。臨用時加入乳糖，並加熱溶化瓊脂，冷至50一55℃，加入伊紅和美藍溶液，搖勻，傾注平板。
原理：大腸菌群細菌發酵乳糖產酸，使伊紅與美藍結合而成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有時還可產生金屬光澤。黑色程度與光澤產生情況與伊紅、美藍二者比倒有關。不發酵乳糖的細菌(如沙門氏菌、志賀氏菌)則為無色菌落。

③乳糖發酵培基
成分：蛋白腖 20g
乳糖 10g
O．04％溴甲酚紫水溶液 25ml
蒸餾水 1000ml
pH7．4
製法：將蛋白腖及乳糖溶於水中，校正pH，加入指示劑，按檢驗要求分裝30ml、10ml或3ml，並放入一個小倒管，高壓滅菌115℃15分鍾。
附註： 』
(1)雙料乳糖發酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。
(2)30ml和10ml乳糖發酵管專供醬油及醬類檢驗用．3ml乳糖發酵管供大腸菌群
證實試驗用。
4．蛋白腖水
成分：蛋白腖(或胰蛋白腖) 20g
氯化鈉 5g
蒸餾水 1 000ml pH7．4

B. 純凈水的大腸菌群的檢測方法

2.7細菌總數：（詳見衛標） 2.7.1方法：以無菌操作方法用已滅菌過1 ml吸管,吸取已搖勻的水樣1 ml注入已經過121℃20分鍾滅菌的90ml生理鹽水的三角燒瓶中,搖勻,稱1：10的供試液.另取滅菌吸管1支,從三角燒瓶分別吸取為1：10的供試液1 ml注入經160℃2小時滅菌平皿中（共注三個平皿）.然後各平皿倒入已滅菌熔化的肉湯瓊脂培養基約15ml,搖勻.另再倒空白平皿,作對照.待冷卻凝固後,翻轉平皿（底朝上）置36.5℃恆溫培養箱內培養48小時後進行細菌計數.2.7.2細菌計數：將三個平皿中的平均菌落數,以稀釋度的選擇乘以其稀釋倍數,即為水樣的細菌總數.一般都是檢測細菌總數的!

C. 食品中大腸桿菌的檢測

用大腸桿菌顯色培養基，檢測原理：蛋白腖和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化鈉可維持均衡的滲透壓;瓊脂是培養基的凝固劑;十二烷基硫酸鈉抑製革蘭氏陽性菌;混合顯色底物分別與大腸菌群和大腸桿菌所對應的酶發生特異性反應，水解底物，釋放出顯色基團，在淡黃色平板上大腸菌群產生橙紅色的菌落，大腸桿菌產生藍綠色的菌落。
資料出自環凱官網。

D. 大腸桿菌怎麼鑒定

大腸桿菌測定
伊紅美藍平板上典型大腸桿菌菌落接種到營養瓊脂平板，在(36土1)℃培養18h -24 h 。每個平板至少挑選2個菌落。挑取上述菌落純培養物接種3.6.3生化培養基和乳糖發酵管，(36士1)0C培養24h 後觀察結果。

大腸桿菌與非大腸桿苗鑒別試驗方法

靛基質試驗:
滴加Kovacs氏靛基質試劑0.1 m L於靛基質試驗培養基中混合，靜置，觀察結果。
出現紅色環的為反應陽性;出現黃色環的為反應陰性。

甲基 紅(MR)試驗:
滴加甲基紅指示劑0.2 m 1於MR-VP培養基中混合，觀察結果。
出現紅色為陽性反應;出現黃色為陰性反應。

維 培(VP)試驗:
滴加VP試劑甲液0. 2 mL於MR-VP培養基中混勻，再滴加VP試劑乙液0.1mL混勻，靜置，觀察結果。在15min內出現紅色的為陽性反應;無顏色變化的為陰性反應。陰性結果1h後再觀察一次出現紅 色也為陽性反應。

西蒙氏檸檬酸鹽試驗:觀察培養基顏色變化，出現藍色為陽性反應;不變色為陰性反應。

大腸桿菌鑒定結果
靛基質 MR VP 西蒙氏檸檬酸鹽 鑒定
＋
－ ＋
＋ －
－ —
－ 典型大腸艾希氏桿菌
非典型大腸艾希氏桿菌
＋
－ ＋
＋ －
－ ＋
＋ 典型檸檬酸鹽桿菌
非典型檸檬酸鹽桿菌
－
＋ －
－ －
－ ＋
＋ 典型產氣腸桿菌
非典型產氣腸桿菌

如出現表1以外的生化反應類型，表明培養物可能不純，應重新劃線分離，必要時做重復試驗。

結果報告
1M Vic 試 驗結果為++一一、一+一一和乳糖發酵管產氣者，查其EC肉湯產氣管數及其稀釋倍
數，對照附錄B(資料性附錄)中MPN檢索表報告樣品中大腸埃希氏桿菌MPN /a (mL)值

E. 如何鑒定大腸桿菌

1、發酵法

這種方法主要是在44.5℃下的培養基上進行大腸桿菌的培養，該培養基含有熒光底物，需要培養 24 h。然後對熒光底物進行釋放，需要採用葡萄糖醛酸進行，讓培養基能夠在紫外光的照射下發出熒光。

採用這樣的方式方法，還可以進行統計學估計原來樣品中的菌落。主要步驟包括發酵、分離培養、二次發酵、顯微鏡觀察等 。

2、濾膜法

該方法主要過程：加入 10 mL 左右的無菌水於濾器中，然後摻入一些無菌水進行清潔濾器的內壁，再進行過濾，將濾膜放在 M-FC 培養基中，兩者之間不能夠有氣泡，然後進行密封，存放溫度為 44.5℃，存放時間約 24 h，直到大腸桿菌的菌群變成藍色或藍綠色。

然後記錄數據，估算每一單位的水溶液菌群數量，然後進行大腸桿菌量值的換算 。

(5)大腸菌的三種檢測方法擴展閱讀：

大腸桿菌是短桿菌，兩端呈鈍圓形，革蘭陰性。有時因環境不同，個別菌體出現近似球桿狀或長絲狀 ；大腸桿菌多是單一或兩個存在，但不會排列呈長鏈形狀。

大多數的大腸桿菌菌株具有莢膜或微莢膜結構，但是不能形成芽孢；多數大腸桿菌菌株生長有菌毛，其中一些菌毛是針對宿主及其他的一些組織或細胞具有黏附作用的宿主特異性菌毛 。

生化特性

大腸桿菌在常用的生化特性檢測項目中，甲基紅試驗呈陽性，吲哚產生和乳糖發酵是陽性（個別菌株表現陰性），維-培試驗是陰性，尿素酶和檸檬酸鹽利用呈陰性（極個別菌株表現陽性），硝酸鹽還原試驗表現陽性，氧化酶表現陰性，氧化-發酵試驗表現為F型