㈠ 誰知道測DNA甲基化的方法
http://www.ebiotrade.com/emgzf/genenews200404/gene5.htm您自己看吧！好多圖片粘貼不過來，還不如你自己看。
一種全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技術
DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學性修飾鹼基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區域，在哺乳動物中mC約佔C總量的2－7％。一般說來，DNA的甲基化會抑制基因的表達。DNA的甲基化對維持染色體的結構、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發生發展都起重要的作用。
CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區段，CpG保持或高於正常概率，這些區段被稱作CpG島。CpG島主要位於基因的啟動子和第一外顯子區域，約有60％以上基因的啟動子含有CpG島。 CpG甲基化的研究在腫瘤的研究中有著非常主要的地位。通過基因啟動子區及附近區域CpG島胞嘧啶的甲基化可以在轉錄水平調節基因的表達，從而引起相應基因沉默，去甲基化又可恢復其表達。DNA甲基化在生理情況下就參與了控制基因的時空表達，在腫瘤發生時，腫瘤細胞全基因組低甲基化是一個重要特徵。腫瘤細胞基因組甲基化的程度與正常細胞相比僅為20-60% , 同時伴有局部區域基因的高甲基化,包括腫瘤抑制基因、抑制腫瘤轉移和浸潤的基因、細胞周期調節基因、DNA修復基因、血管形成抑制基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的廣泛研究。
近年來，研究者不斷探索定性及定量檢測單個或多個甲基化位點的方法，但由於甲基化多態性區域存在的密度很高，所以對於延伸反應其引物的位置很難設計。Pyrosequencing技術作為一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。
從原理上來看，Pyrosequencing是一種通過合成方法進行序列分析的方法，它通過核苷酸和模板結合後釋放的焦磷酸引發酶級聯反應，促使熒光素發光並進行檢測。這項技術曾經被用作單核苷酸多態性（SNP）的基因型和單倍型的檢測，以及細菌和病毒的鑒定和分型研究。這項技術的一個主要特點是在Pyrogarm™軟體上顯示的峰值高度來自於序列分析的原始數據，通過峰值的高度可以精確的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率。
目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的報道採用亞硫酸氫鹽處理甲基化樣本，並用混合的PCR產物
作為校正。其主要原理是：亞硫酸氫鹽可以將沒有甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而在適當的實驗條件下甲基化的胞嘧啶保持不變。因而，用它處理樣本後，再進行PCR擴增，甲基化的位點可以被當作一個C/T的SNP來處理，它的基因頻率為0－100％。在此，我們給大家介紹一個研究人員使用Pyrosequencing技術分析並精確定量DNA甲基化水平的例子。
研究者在一個Pyrosequencing反應中同時檢測了6個甲基化位點。這種方法同樣可以用於石蠟包埋的組織，並且具有較高的重復性和精確性。實驗選擇谷胱甘肽-S-轉移酶π（GSTP1）轉錄啟動位點的CpG島進行檢測。這些位點在正常前列腺組織中是非甲基化的，而在腫瘤樣本中高甲基化。通過PCR擴增一個包含17個甲基化多態位點140bp的片段，並用4個測序引物研究其中15個位點（Table 1）。使用在線的SNP測序引物設計軟體（Pyrosequencing AB）設計測序引物，其中一些甲基化多態性位點用最可能的鹼基所代替，以減少計算的數量。再通過人工檢測測序引物可能存在的錯配。此外，同時在PSQ 96MA DNA分析儀上運行空白對照，扣除由測序引物、生物素標記的引物或是模板引起的背景。
PCR引物設計完全與模板相匹配，不覆蓋任何甲基化多態性區域。使用10ng亞硫酸氫鹽轉化的DNA樣本或是10 fmol純化的PCR產物，10 pmol 正向（5』-GTGATTTAGTATTGG-3』）和反向（5』-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3』）引物擴增GSTP1轉錄啟動位點的基因片段，擴增片段長度為144bp。反應體系為60 mM Tris-SO4, pH 8.9, 18 mM (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，終體積為50μL。PCR循環設置：首先在95℃下變性4分鍾，然後在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S條件下重復50個循環，最後一步延伸步驟在72℃下4分鍾，中止反應。PCR反應在Eppendorf的Mastercycler 96
哺乳動物基因組中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化. DNA甲基化是一種基因外修飾，不改變DNA的一級結構; 他在細胞正常發育、基因表達模式以及基因組穩定性中起著至關重要的作用. 全基因組低甲基化，維持甲基化模式酶的調節失控和正常非甲基化CpG島的高甲基化是人類腫瘤中普遍存在的現象. DNA高甲基化是導致抑癌基因失活的又一個機制.
http://www.wjgnet.com/1009-3079/abstract_cn.asp?f=1420&v=11
㈡ 易基因 | ACE-Seq：羥甲基化檢測簡介
DNA序列中胞嘧啶（C）5』 碳位結合一個甲基基團而轉變成5mC的現象稱為DNA基甲基化。在5mC去甲基化的過程中，其會被氧化成5hmC，這種新的修飾稱為DNA羥甲基化。
因為5hmC是5mC去甲基化的中間產物，所以對於多細胞來說，同一個C位點上不同細胞往往會存在5mC或5hmC不同修飾，而5mC與5hmC對基因表達的調控作用又完全不同：啟動子區的DNA甲基化對基因表達的有抑製作用，DNA羥甲基化則會促進基因的表達。因此，對5mC及5hmC的水平進行精確地定量並分別研究十分有必要。
ACE-seq是一種全新的檢測DNA羥甲基化的技術，由美國賓夕法尼亞大學Emily K Schutsky等在2018年發表在Nature Biotechnology雜志上。不同於傳統的BS-Seq，該技術使用AID/APOBEC家族DNA脫氨酶APOBEC3A (A3A)代替化學脫氨，保證了DNA的完整性。A3A能夠特異地脫去C及5mC的氨基使其變為U，而5hmC則因為不被該酶識別，測序時仍被檢測為C。這樣，便將5hmC與C及5mC區分開來。該技術原理示意圖如下：
首先，利用T4 β-葡糖基轉移酶（βGT）將5hmC轉化成5ghmC，5ghmC不會被A3A酶脫氨基；然後，利用A3A酶特異去除C和5mC的氨基，使其轉變成U，而5hmC保持為C，從而將5hmC和C/5mC區分開來。
ACE-Seq具有以下優勢：
（1）檢測范圍為全基因組，可以得到基因組上大部分C位點的羥甲基化水平。
（2）單鹼基解析度。能夠檢測單個C鹼基的羥甲基化水平，精確度高。
（3）低起始量。ACE-Seq利用脫氨酶實現5hmC與C及5mC的區分，反應條件溫和，不破壞基因組，大大減少基因組DNA的損失，因此起始DNA量比常規的oxBS技術降低100倍。
（4）高准確性。絕大部分甲基化修飾的C都被轉化成U，而絕大部分經過糖基化修飾的5hmC（5ghmC）則保持為C，表明該技術具有充分的可靠性。如下圖：
（5）經濟性。僅需一個文庫解決問題，羥甲基化研究成本大大降低。 ACE-Seq獨有的優勢使其在羥甲基化檢測領域擁有巨大的潛力。
為了讓大家全面理解掌握自己究竟該選擇哪種羥甲基化研究技術，我們再來溫習一下oxWGBS-Seq。該技術將傳統的BS-Seq技術與化學氧化相結合，先利用高釕酸鉀將DNA上的5hmC氧化成5fC，再用重亞硫酸鹽處理，5fC和沒有任何修飾的C就被轉化成U，而5mC則不會被轉化，仍然保持為C。原理示意圖如下：
該技術需要構建兩個文庫，圖中藍色虛線標出的為BS文庫，紫色虛線標出的為OXBS文庫。利用BS文庫可以得到5mC和5hmC總的水平，利用OXBS文庫可以得到精確的5mC的水平，兩個文庫相減，即可得到精確的5hmC的水平。根據該技術的原理可知，該技術可以同時得到精確的甲基化水平和羥甲基化水平。
oxWGBS具有以下優勢：
（1）可以同時檢測甲基化和羥甲基化的水平。
（2）檢測范圍為全基因組，可以得到基因組上大部分C位點的甲基化和羥甲基化水平。
（3）單鹼基解析度。能夠檢測單個C鹼基的甲基化和羥甲基化水平，精確度高。
由於以上優點，oxWGBS被稱為精準甲基化和羥甲基化檢測的「金標准」。
根據oxWGBS還可以衍生出oxRRBS技術。oxRRBS是簡化代表性重亞硫酸鹽測序（RRBS-Seq）技術與化學氧化技術的結合，可以針對基因組上CpG含量高的區域（如CGI，啟動子等重要的調控區域）進行甲基化及羥甲基化水平檢測。由於oxRRBS只針對CpG含量高的區域進行檢測，而這些區域往往是重要的調控區域，使得oxRRBS技術能夠以較低的成本檢測關鍵基因組區域的甲基化及羥甲基化水平。
然而以上兩種技術有兩個共同的缺點。首先，由於重亞硫酸鹽處理對DNA有強烈的破壞作用，導致建庫過程中會損失大量DNA，因此該技術需要的DNA起始量較高；另外，由於該技術需要構建兩個文庫，會導致成本的上升。
此外，還可以利用hMeDIP-Seq技術來檢測DNA羥甲基化。hMeDIP利用5hmC特異性抗體富集基因組上發生羥甲基化的DNA片段，結合高通量測序，檢測基因組上羥甲基化的區域。原理示意圖如下：
該技術針對羥甲基化的片段進行測序和定量，成本大大降低。但該技術無法達到單鹼基解析度，也無法得到精確的羥甲基化率，只能得到羥甲基化修飾的信號強度。
㈢ 簡化甲基化測序和甲基化測序的區別
普通的測序不能找到甲基化位點。
這里有幾種常用的找甲基化位點的測序方法：
第一種是重亞硫酸鹽測序。重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴增(引物設計時盡量避免有CpG，以免受甲基化因素的影響)所需片段，則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶。最後，對PCR產物進行測序，並且與未經處理的序列比較，判斷是否CpG位點發生甲基化。此方法一種可靠性及精確度很高的方法，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態。在尋找有意義的關鍵性CpG位點上，有其他方法無法比擬的優點。測序法以CpG島兩側不含CpG點的一段序列為引物配對區，所以能夠同時擴增出甲基化和非甲基化靶序列。它的不足是耗費時間和耗資過多，至少要測序10個以上的克隆才能獲得可靠數據，需要大量的克隆及質粒提取測序，過程較為繁瑣、昂貴。
第二種甲基化DNA免疫共沉澱MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）測序，是基於抗體富集原理進行測序的全基因組甲基化檢測技術，採用甲基化DNA免疫共沉澱技術，通過5'-甲基胞嘧啶抗體特異性富集基因組上發生甲基化的DNA片段，然後通過高通量測序可以在全基因組水平上進行高精度的CpG密集的高甲基化區域研究。MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）測序是基於抗體富集原理進行測序的全基因組甲基化檢測技術，採用甲基化DNA免疫共沉澱技術，通過5'-甲基胞嘧啶抗體特異性富集基因組上發生甲基化的DNA片段，然後通過高通量測序可以在全基因組水平上進行高精度的CpG密集的高甲基化區域研究。
第三種是三代測序技術，採用pacbio測序儀的SMRT技術，採用的是對DNA聚合酶的工作狀態進行實時監測的方法。DNA聚合酶催化熒游標記的核苷酸摻入到互補的核酸鏈中。核苷酸的摻入被檢測成熒光脈沖，依據其顏色鑒定出核苷酸。當聚合酶切斷連接在核苷酸末端的熒光基團時，脈沖終止。熒光脈沖的到達時間和持續時間產生了關於聚合酶動力學的信息，從而允許直接檢測DNA模板鏈中的修飾核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。
㈣ 易基因｜一文讀懂：十大DNA甲基化研究核心問題
DNA甲基化是最早被發現、也是研究最深入的表觀遺傳調控機制之一，近年來關於DNA甲基化的研究成果屢屢見刊。我翻閱各類文獻，為大家總結了十大DNA甲基化研究核心問題，包括什麼是DNA甲基化，DNA甲基化的主要形式、DNA甲基化與去甲基化、植物中的DNA甲基化、DNA甲基化的主要功能、DNA甲基化作為生物標志物的潛力、DNA甲基化的主要研究方向、DNA甲基化檢測方法、樣本不同如何選擇DNA甲基化檢測技術、DNA甲基化數據挖掘等，讓您一文讀懂DNA甲基化。
1、什麼是DNA甲基化
DNA甲基化（DNA methylation）為DNA化學修飾的一種形式，是指DNA分子在DNA甲基轉移酶的作用下將甲基選擇性地添加到特定鹼基上的過程。DNA甲基化能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現，是最重要的表觀遺傳調控方式之一。
2、DNA甲基化的主要形式
5-甲基胞嘧啶（5-mC）：最重要的一種DNA甲基化修飾，廣泛存在於植物、動物等真核生物基因組中, 稱譽為「第五鹼基」。
5-羥甲基胞嘧啶世衫臘（5-hmC）：哺乳動物的「第六鹼基」。
N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）：在細菌、藻類及動植物基因組中存在。
7-甲基鳥嘌呤（7-mG）
3、DNA甲基化與去甲基化（5mC）：
DNA甲基化反應分為2種類型：一種是2條鏈均未甲基化的DNA被甲基化，稱為從頭甲基化（denovo methylation）；另一種是雙鏈DNA的其中一條鏈已存在甲基化，另一條未甲基化的鏈被甲基化，這種類型稱為保留甲基化（maintenance methylation）。
甲基化的DNA可以發生去甲基化。DNA的去甲基化由基因內部的片段及與其結合的因子所調控，包括：
主動去甲基化(Active demethyaltion)：哺乳動物TET酶主動去甲基化，5mC經過TET作用轉化成5hmC。
被動物甲基化(Passive demethylation)：DNA通過不斷復制丟失/稀釋甲基化。
4、植物中的DNA甲基化
對於植物而言，面對生長環境塌頌的改變，表觀遺傳的變異會改變植物DNA的構象，從而改變染色質和蛋白質的結構，達到調節基因組的作用。研究發現，當植物面臨生物脅迫和非生物脅迫時，植物基因組中DNA甲基化會發生改變，並且這些改變會遺傳給後代。所以DNA甲基化的改變能夠豐富植物物種的多樣性，加強植物的環境適應性。
不同於哺乳動物基因組只有CG甲基化，植物基因組甲基化有CG，CHG，CHH（H代表任何非G的鹼基）甲基化。而維持這三種不同的DNA甲基化的分子機制非常復雜。
5、DNA甲基化的主要功能
DNA甲基化能引起染色體結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式改變，從而控制基因的表達。
保持基因組遺傳物質的穩定性（TE的高甲基化）
調控基因的表達（順式作用元件的動態甲基化，如Promoter/Enhancer等）
DNA甲基化參與基因轉錄調控、細胞分化、胚胎發育、X染色體失活、基因印記和腫瘤的發生等過程。
6、DNA甲基化作為生物標志物的潛力
相比基因組，DNA甲基化能夠反應環境的影響
DNA甲基化不像基因組那麼一成不變，也不像轉錄組和蛋白組那麼搜滑不穩定。
DNA甲基化處於動態變化中，能夠像年輪一樣記錄環境因素的影響。
DNA甲基化標志物是最有應用前景的表觀遺傳標志物 。
7、DNA甲基化的主要研究方向
8、DNA甲基化檢測方法
目前研究中常用的DNA甲基化測序方法包括全基因組（WGBS、oxWGBS等）、簡化基因組（dRRBS、RRBS、XRBS等）、靶向基因組（液相捕獲）、靶向基因（TBS）和850K晶元等，適用於多種不同應用場景。
WGBS和RRBS用於基因組范圍內研究探索，並篩選目標基因（候選DNA甲基化標記物）
TBS用於後續目標基因的甲基化驗證
9、樣本不同，如何選擇DNA甲基化檢測技術
易基因結合十餘年DNA甲基化研究經驗，全面總結了不同樣本類型對於不同DNA甲基化檢測工具選擇的不同，技術推薦標准可以分為三點：
最有力方案（金標准）：WGBS/微量WGBS/scWGBS
最具性價比方案：RRBS/dRRBS/XRBS（動物）
大規模臨床轉化/目標區域甲基化驗證：TBS
10、DNA甲基化數據挖掘
DNA甲基化一般遵循三個步驟進行數據挖掘。首先，進行整體全基因組甲基化變化的分析，包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關性分析等。其次，進行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結合分析、時序甲基化數據的分析策略、DMG的功能分析等。最後，將甲基化組學&轉錄組學關聯分析，包括Meta genes整體關聯、DMG-DEG對應關聯、網路關聯等。
㈤ 相比較於別的甲基化檢測技術，易畢恩的羥甲基化檢測技術的優勢或者說先進性體現在哪呢
DNA甲基化檢測採用的重亞硫酸鹽檢測技術，對DNA有較大的破壞，可能會導致部分甲基化信息的丟失，且所需起始DNA量多，全基因組測序成本很高。此外，單位點DNA甲基化檢測目前檢測結果偏差，靈敏性和特異性都在70%左右。
而易畢恩的全基因組5hmC（DNA羥甲基化標志物5-羥甲基胞嘧啶）高通量檢測技術是在全基因組范圍內的捕獲及測序，信息全面而完整。5hmC檢測技術通過化學捕獲法，完成一次檢測所需血液量少，低至1ng的DNA輸入量即可滿足。同時，化學捕獲法通過化學結合作用捕獲5hmC，檢測手段更加靈敏，能夠捕獲到全面的、基因組范圍的5hmC信息。易畢恩收集、檢測上萬人樣本，建立了全球獨家的、具備中國人特徵的系統資料庫，有針對性地對中國健康人群和不同的癌症人群進行系統全基因組信息分析，通過大數據對比找出癌症人群中特異的5hmC信號，並通過機器學習的方法建立模型，獨立樣本加以驗證，數據全面精準，特異性、靈敏度可達雙90%。