A. 常用的農葯殘留分析的步驟有哪些
常用的農葯殘留分析樣品前處理—提取方法 索氏提取法; 加速溶劑提取法; 微波加熱提取法; 超臨界流體提取法; 固相微提取法; 浸漬、漂洗法; 勻漿法; 消化法; 振盪法; 超聲波提取法; 吸附法.
常用的農葯殘留分析樣品前處理——提取方法
內容摘要：索氏提取法加上用分液漏斗的液-液分配技術，長期以來是分析家用來從樣品基體中分離靶標分析物的主要技術，將樣本放在索氏提取器套管中，在圓底燒瓶中加入提取劑，加熱連續提取數小時。現代提取工藝的其他幾種方法：加速溶劑提取法，微波加熱提取法，超臨界流體提取法(sFE)；固相微提取法(SPME)。
樣品前處理包括待測物的提取、凈化和濃縮。提取是指使用適當溶劑(常用丙酮或乙腈)，將待測物連同樣品基質從固態樣品中轉移到易於凈化和分析的液態；凈化是指將待測物與提取液中的干擾物質分離。在現代殘留農葯檢測中，提取、凈化可一步完成，提取、凈化的界限已十分模糊。
一、提取方法
1．索氏提取法
索氏提取法應用將近一百年，加上用分液漏斗的液-液分配技術，長期以來是分析家用來從樣品基體中分離靶標分析物的主要技術，將樣本放在索氏提取器套管中，在圓底燒瓶中加入提取劑，加熱連續提取數小時。此法為經典提取法，也叫完全提取法，是國際上的標准方法，提取效果好，但缺點是用時過長，干擾物質較多，使用過多的有機溶劑。為了減少有機溶劑的用量，縮短提取過程，提取技術朝著小型化、少溶劑的方向發展。近年來出現了一些值得推薦的新的提取技術，如加速溶劑提取法AsE)、微波加熱提取法(MAE)、超臨界流體提取法(SFE)等，這些方法克服了索氏提取法時間長、有機溶劑用量大的缺點。此外，固相微提取法(SPME)是一種無溶劑、快速而簡便的提取技術。
2．加速溶劑提取法
1995年，Richter等提出了一種全新的萃取方法一加速溶劑萃取法(AsE)。該方法是高溫(50～200℃)及加壓(10．3～13．7MPa)條件下的溶劑提取法。溫度高於100℃的溶劑穿透力強且溶解力大，加快分析物從基體解析進入溶劑；加壓使溶劑保持液態，用少量溶劑可快速提取固體樣品中的分析物。
樣品密封在高壓不銹鋼提取倉內，經過起始的加熱過程，樣品在靜態下與加壓的溶劑相互作用一段時間，然後用壓縮氮氣將提取液吹掃至收集瓶中，每個樣品的提取全過程約15min，圖6—1是AsE快速溶劑萃取儀示意圖。使用快速溶劑萃取儀AsE在數分鍾內即可完成常規萃取方法數小時所做的工作，與索氏萃取和微波萃取相比，AsE只需極短的時間，使用最低的溶劑量就可滿足各種萃取需求。
現在已有商品ASE自動化提取系統，如I)ionex 200，玻璃樣品提取瓶密封於不銹鋼圓筒內，24位樣品傳輸架，可以連續自動提取24個樣品。提取瓶容量有3種：11mL、22mL、33mL，收集瓶有40mL及60mL兩種，每個提取瓶可設置多次提取程序。由於加速溶劑提取法具有以上突出優點，被美國環保局(EPA)推薦為標准方法。
用此系統提取食品中含有的19種有機磷農葯，o．1mg／kg，樣品5g，提取溫度1。0℃，壓力10．3MPa，預熱5min，靜態提取5min，用溶劑快速沖洗樣品，氮氣吹掃收集全部提取液，加上系統清洗液，總計每個樣品用溶劑50mL，耗時20min，過程全部自動化，除甲胺磷和乙醯甲胺磷外，其他17種有機磷農葯回收率在80％～90％的范圍內，相對標准偏差小於10％。Adou等[M]利用ASE提取，用GC對蔬菜水果中19種農葯進行了分析。AsE提取溶劑的選擇與索氏提取法一樣，提取液同樣也需凈化才能檢測，其作用只是減少提取溶劑用量，縮短提取時間。
3．微波加熱提取法
自1986年美國科學家Ganzler等["』首次報道用微波能提取被污染土壤中的有機物以來，微波加熱提取法就受到了研究者的注意。微波能是一種非離子輻射，它使分子中的離子發生位移和偶極矩，其中有機物受微波輻射使其分子排列成行，又迅速恢復到無序狀態，這種反復進行的分子運動，使樣品迅速加熱。微波穿透力強，能深入基體內部，輻射能迅速傳遍整個樣品，而不使表面過熱。內部的分子運動使溶劑與分析物充分作用，加速了提取過程，圖6—2是微波萃取系統。微波快速溶劑萃取系統可以在15min內萃取12個樣品。如MSP一100型微波提取器，同時容納12個樣品，樣品提取倉內襯聚四氟乙烯，容量100mL，樣品和溶劑置於此密封加壓倉內，用微波加熱，一般用30～40mL溶劑提取5～20min，加壓時提取溫度可以高於溶劑的沸點，提取完成後，冷卻至室溫(約30min)，提取液需凈化後分析。
微波提取法的最佳回收率決定於樣品基體、靶標農葯、提取溫度和溶劑。與其他溶劑提取法比較，樣品基體的影響較大，而取樣量減少並不降低方法的精密度，並且在相同條件下可提取多個樣品，增加了樣品的流通量。因此針對不同的樣品和農葯，要預先進行微波參數的優化。Pylypiw等[牆]研究了微波加熱提取法對多種田間樣品的多殘留檢測，比較了不同溫度、不同提取時間下的提取結果，認為多殘留檢測最佳條件為：電能置於50％處，溫度100℃，提取時間10min，對於百菌清(chlorothalonil)則溫度在80℃較好。silgonerL¨j研究表明，用異辛烷、正己烷、丙酮、苯和丙酮(2：1)、甲醇、乙酸、甲醇、正己烷、異辛烷、乙腈等作溶劑，在土壤或沉積物有一定濕度的條件下，微波萃取方法僅用3min，就可獲得與soxhlet提取法用6h才能取得的相同的有機氯農葯殘留回收率。影響密閉容器微波萃取不同樣品中農葯殘留的條件除了溶劑外，還有萃取溫度、萃取時間和溶劑體積等條件，經過實驗選擇最佳萃取條件，萃取土壤中12種農殘的回收率結果與常規EPA法進行對照，結果表明微波萃取10min的回收率和精密度均好於EPA規定的索氏法。
4．超臨界流體提取法(sFE)
前述的加速溶劑提取法和微波加熱提取法採用的仍然是有機溶劑作為提取溶劑，只是加上輔助能源來改善提取。而超臨界流體提取法則完全用另一種性質的提取溶劑，即超臨界狀態下的流體作為提取劑，其中又以超臨界二氧化碳應用最普遍。二氧化碳的臨界溫度31℃，臨界壓力7．4MPa，此條件比較容易達到。超臨界流體黏度小、擴散快，溶質在超I臨界流體中擴散速度比液體中快得多，提取過程的質量轉移快，因而提取速度快、時間短。改變溫度、壓力或添加少量的有機溶劑，可以改變超臨界流體提取劑的溶解力，這一點優於有機溶劑提取法。解除壓力後，二氧化碳成為氣態，容易與提取物分離，用少量有機溶劑收集分析物，然後靈活地選擇檢測方法。二氧化碳惰性、無毒、價格比較便宜是其優勢，但只適合於提取非極性及中等極性的分析物(農葯)。目前還在尋求其他提取劑，如氯仿是很有吸引力的，它對極性分析物(農葯)的溶解力強，可以從含脂肪的樣品基體中選擇提取靶標農葯，圖6—3是超臨界流體萃取系統與基本工藝流程。
超臨界流體可依據具體情況選用COz、水、合成甲醇等介質，製冷劑可選用防凍液或乙二醇等。超臨界流體萃取系統包括萃取反應器、介質冷凍／加熱循環水浴、介質冷凝液化器、分離器、BPR壓力控制、高壓計量泵、超高溫加熱器以及附屬空氣驅動泵、溶劑泵等。
近來還發現在超臨界二氧化碳中添加30％的氮，在80℃及55．2MPa下提取，有機氯及有機磷農葯的回收率提高，而脂肪的提取量在可以耐受的水平。
sFE對固體樣品是一種好的提取方法，但是需要較貴的超臨界流體提取儀才能完成，自動化連續式超臨界流體提取儀可以連續提取44個樣品，平行式提取儀一般可同時提取6個樣品，與索氏法相比，其精密度較好。由於樣品基體和農葯種類不同，條件選擇不一致，對以上3種方法及索氏法而言，各有各的優點，可根據具體分析物的情況定提取方案。
5．固相微提取法(SPME)
水或水溶液中農葯的提取，過去一直採用大分液漏斗的液一液分配提取法，費時費力。用固相提取法，大量水樣(1L)流過吸附柱，農葯吸附在柱上，然後用少量有機溶劑淋洗農葯，比液一液分配法已經簡化很多。微型固相提取法是固相提取法中的新成員，1989年由加拿大的Belardi和Pawliszyn[21]首先開發，在細石英纖維(170／zm)上塗布一層固定相(吸附劑)，將纖維插入水溶液樣品內，水中分析物被分配到固定相上，取出纖維插入氣相色譜儀進行分析。微型固相提取法的原理是吸附和熱解吸，取樣、提取濃縮、進樣是一個步驟，全過程無需溶劑，是分析方法上的重大突破。進樣不用溶劑，改善了色譜分離效率，纖維可重復使用多次，十分經濟。圖6—4是自動固相微萃取儀的示意圖，固相微萃取特別適用於在進行色譜和質譜分析時，對樣品進行微萃取處理。
常用的固定相為聚二甲基硅氧烷(potydimethylsiloxane)，塗布厚度1 0 m，用於提取非極性有機物；聚丙烯酸酯(polyac：ylate)塗布厚度85>m，用於提取極性有機物，有現成的商品供應。sPME—Gc—Ms的檢測限可以達到飛克級，分析物轉移的隨機誤差來源少，因而精密度很好，一般RSD小於5％。
Beltran[22]等用SPME—GC—NPD檢測環境水中12種有機磷農葯(ng／mL)殘留，纖維插入3mL水樣中(含15％氯化鈉)室溫下攪拌浸提60mi『n，然後將纖維插入GC進樣口，聚二甲基硅氧烷270℃，聚丙烯酸酯250℃下解吸並分析，該方法的檢測限0．01～O．2ng／mL，RSD小於5％。Jacks()n用SPME—GC—PDECD快速測量水中有機氯農葯，浸取2min(非平衡提取)，全部分析時間只需10min。
如用頂空取樣法，SPME可用於土壤和泥漿樣品，加熱樣品，分析物揮發進入頂空，纖維從頂空取樣。目前SPME主要還是用於水或比較純凈的水溶液樣品，SPME簡便、經濟、快速並容易自動化，是一種完全不用溶劑的提取技術，它使樣品前處理不再成為方法的瓶頸。
常用的提取方法還有以下幾種。
(1)浸漬、漂洗法 將樣品浸漬在提取液中，或用提取液漂洗樣品。此法對附著在樣品表面的農葯有很好的提取效果12引。
(2)勻漿法 將樣品放在勻漿杯(搗碎杯)中，加入提取劑，快速勻漿(搗碎)幾分鍾。此法簡便，快速，效果好，普遍採用。
(3)消化法 樣品中加入消化劑，加熱使樣品消化，再用溶劑將待測農葯提取出。此法多用於不易勻漿，不易搗碎的動物組織樣品。
(4)振盪法 在盛有樣品的容器中加入提取劑，振盪數小時。此法簡便並且提取效果好，較普遍採用。
(5)超聲波提取法 樣品經粉碎或勻漿搗碎後，加入提取劑，在超聲波儀中提取一定時問，此法現已普遍採用。
(6)吸附法 去活吸附劑(硅膠、弗羅里硅土等)混合裝柱，再用適當的溶劑將農葯淋洗下來，適用於動物組織樣品的提取。
B. 蔬菜水果中有機磷農葯的殘留如何檢測
攜帶型農葯殘留速測儀及卡片的檢測原理和使用方法攜帶型農葯殘留速測儀是根據國家標准方法GB/T5009.199 — 2003 )速測卡法(紙片法)而專門設計的儀器.主要用於果,蔬,茶,糧食,水及土壤中有機磷和氨基甲酸酯類農葯的快速檢測,特別適用於農產品質量檢測站的快速檢測,果蔬生產基地和專業戶採摘前田間地頭檢測,農貿批發銷售市場現場檢測,酒樓,食堂,家庭果蔬茶加工前安全檢測. 檢測原理: 儀器的檢測原理是利用速測卡中的膽鹼酯酶(卡②)可催化靛酚乙酸酯(卡①)水解為乙酸和靛酚,由於有機磷和氨基甲酸酯類農葯對膽鹼酯酶的活性有強烈的抑製作用,因此,根據顯色的不同,即可判斷樣品中含有機磷或氨基甲酸酯類農葯的殘留情況.①② 使用方法:(1)開機 按住面板上的"開 / 關"鍵約2秒鍾,儀器開機(開機後再次按次鍵可關機):按[模式]鍵切換至"溫度",當溫達到40℃時,儀器發出一聲提示音,預熱完成,可以開始測試.(2)裝片 將速測卡撕去上蓋膜對折後再展開,插入壓紙條下的各通道加熱板上(注意卡①一端在上方,卡②一端在下方),檢查速測卡放置位置是否正確,速測卡中間的虛線應與壓條對齊,不要歪斜.(3)取樣 選擇有代表性的蔬菜或瓜果皮 ,擦去表面泥土,剪成一平方厘米左右碎片,取5克放入帶蓋瓶中,加入10毫升純凈水或緩沖溶液震盪50次(有條件擁護可配備超聲波清洗器攪拌),靜置2分鍾以上,每批最好做9個檢樣,同時做一個純凈水或緩沖液的空白對照,每剪完一個樣品,尖刀要洗凈後方可處.理另一個樣品,以免交駐污染.用移液搶取80微升樣品液加到白色葯片上. 如果檢測是在采樣現場或條件簡陋的情況下進行,可直接在待檢蔬菜葉尖部位滴2-3滴洗脫液,用另一片菜葉尖部在滴液處輕輕摩擦,使蔬菜表面的殘留農葯充分溶入洗液中.然後滴一滴在(卡②)上.(4)測試 按〈啟動〉鍵,反應開始倒計時10分鍾("反應"指示符亮)當聽到儀器發出急促的蜂鳴提示音時關閉上蓋,顯色開始倒計時3分鍾("顯色"指示符亮):待儀器出緩和的蜂鳴提示音時,打開儀器上蓋,進行結果判定.結果判定與空白對照卡比較,若(卡②)不變色或略有淡黃色均為陽性結果,不變黃為強陽性結果,說明農葯殘留量較高,顯黃色色為弱陽性結果,說明農葯殘留量機對較低.(卡②)變為橘黃色或與空白對照卡相同,為陰性結果.附加說明本方法是生物化學反應,應盡可能避免一些物理和化學因素對酶活性的影響.反應最適酸鹼度為PH7.5左右,檢樣偏酸或偏鹼時應改用磷酸緩沖液浸提處理. 反應中,葯片表面應保持濕潤,最好將每一批樣品處理好後統一加樣,以免是過長蒸發干. 蔥,蒜,蘿卜,芹菜,茭白,蘑菇及番茄汁液中含有對酶活性有影響的植物次生物質,容易產生假陽性.處理這類樣品時,不宣剪切過碎,浸提時間不宜過長,以免液汁過多釋放影響檢測檢測結果.必要時可採用整株(體)蔬菜浸提的方法進行測定.農葯速測卡在常溫條件下有效期為壹年,貯存時要求放在陰涼,乾燥和避光處,有條件者放於4℃冰箱中最佳.農葯速測卡開封後最好在三天內用完,如一次用不完可存放在乾燥器中.農葯速測卡果蔬農葯殘留快速檢測卡是用對農葯高度敏感的膽鹼酯酶和顯色劑做成的酶試紙,可以快速檢測蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯這兩大類用量較大,毒性較高的殺蟲劑的殘留情況,選用的酶對甲胺磷敏感,抗干擾性強,操作簡便,不需要配製試劑,不需要專業的技術培訓,可以不需要任何儀器設備單獨使用,也可配套農葯殘留快速檢測儀使用,提高檢測效率.產品容易貯存,攜帶方便,是現場檢測的最佳方法.