㈠ 檢測食品化驗菌落總數的實驗步驟更原理
其實菌落總數和大腸菌的測定方法、步驟都差不多，只是一個是用培養皿一個是用試管
㈡ 菌落總數的檢測
平皿計數法
菌落總數(standardplate-countbacteria):水樣在營養瓊脂上有氧條件下37℃培養48h後，所得1mL水樣所含菌落的總數。
儀器和裝置
高壓蒸汽滅菌器。
乾熱滅菌箱。
培養箱(36±1)℃。
電爐。
冰箱。
放大鏡或菌落計數器。
pH計或精密pH試劑。
滅菌試管。
平皿直徑9cm。
培養基與試劑
營養瓊脂成分蛋白腖10g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂10～20g、蒸餾水1000mL。
製法將上述成分混合後，加熱溶解，調整pH為7.4～7.6，分裝於玻璃容器中(如用含雜質較多的瓊脂時，應先過濾)，經103.43kPa(121℃)滅菌20min，貯存於冷暗處備用。
檢驗步驟
1)水樣處理。
a.飲用水。以無菌操作方法用滅菌吸管吸取1mL充分混勻的水樣，注入來菌平皿中，傾注約15mL已熔化並冷卻到45℃左右的營養瓊脂培養基，並立即旋搖平皿，使水樣與培養充分混勻。每次檢驗時應做一平行接種，同時另用一個平皿只傾注營養瓊脂培養基作為空白對照。
待冷卻凝固後，翻轉平皿，使底面向上，置於(36±1)℃培養箱內培養48h，進行菌落計數，即為1mL水樣中的菌落總數。
b.水源水。以無菌操作方法吸取1mL充分混勻的水樣，注入盛有9mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1∶10稀釋液。
吸取1mL1∶10的稀釋液注入盛有9mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1∶100稀釋液。按同法依次稀釋成1∶1000、1∶10000稀釋液等備用。如此遞增稀釋一次，必須更換一支1mL滅菌吸管。
用滅菌吸管取未稀釋的水樣和2～3個適宜稀釋度的水樣各1mL，分別注入滅菌平皿內。以下操作同生活飲用水的檢驗步驟。
2)菌落計數及報告方法。作平皿菌落計數時，可用眼睛直接觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落數後，應求出同稀釋度的平均菌落數，供下一步計算時應用。在求同稀釋度的平均數時，若其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜採用，而應以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的平均菌落數。若片狀菌落不到平皿的一半，而其餘一半中菌落數分布又很均勻，則可將此半皿計數後乘2以代表全皿菌落數。然後再求該稀釋度的平均菌落數。
不同稀釋度的選擇及報告方法:
首先選擇平均菌落數在30～300者進行計算，若只有一個稀釋度的平均菌落數符合此范圍時，則將該菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表82.2中實例1)。
若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30～300之間，則視二者之比值來決定。若其比值小於2應報告兩者的平均數(如表82.2中實例2)。若大於2則報告其中稀釋度較小的菌落總數(如表82.2中實例3)。若等於2亦報告其中稀釋度較小的菌落數(見表82.2中實例4)。
若所有稀釋度的平均菌落數均大於300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表82.2中實例5)。
若所有稀釋度的平均菌落數均小於30，則應以按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表82.2中實例6)。
若所有稀釋度的平均菌落數均不在30～300，則應以最接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(見表82.2中實例7)。
若所有稀釋度的平板上均無菌落生長，則以未檢出報告之。
如果所有平板上都菌落密布，不要用「多不可計」報告，而應在稀釋度最大的平板上，任意數其中2個平板1cm2中的菌落數，除2求出每平方厘米內平均菌落數，乘以皿度面積63.6cm2，再乘其稀釋倍數作報告。
菌落計數的報告:菌落數在100以內時按實有數報告，大於100時，採用兩位有效數字;在兩位有效數字後面的數值，以四捨五入方法計算。為了縮短數字後面的零數也可用10的指數來表示(見表82.2「報告方式」欄)。
表82.2 稀釋度選擇及菌落總數(CFU)報告方式
㈢ 菌落總數大腸桿菌和致病菌的檢測方法
大腸菌群測定的操作細則
大腸菌群系指一群能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來於人畜糞便,故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量,推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。
食品中大腸菌群數系以100mL(g)檢樣內大腸菌群最可能數(MPN)表示。
1
設備和材料
1.1
溫箱：36±1℃。
1.2
冰箱:0～4℃。
1.3
恆溫水浴
:44.5±0.5℃。
1.4
天平。
1.5
顯微鏡。
1.6
均質器或乳缽。
1.7
平皿:直徑為90mm。
1.8
試管。
1.9
吸管。
1.10
廣口瓶或三角燒瓶:容量為500mL。
1.11
玻璃珠:直徑約5mm。
1.12
載玻片。
1.13
酒精燈。
1.14
試管架。
2
培養基和試劑
2.1
乳糖膽鹽發酵管:按GB
4789.28中4.9規定。
2.2
伊紅美藍瓊脂平板:按GB
4789.28中4.25規定。
2.3
乳糖發酵管:按GB
4789.28中4.10規定。
2.4
EC
肉湯:按GB
4789.28中4.11規定。
2.5
磷酸鹽緩沖稀釋液:按GB
4789.28中3.22規定。
2.6
生理鹽水。
2.7
革蘭氏染色液:按GB
4789.28中2.2規定。
3
操作步驟
3.1
檢樣稀釋
3.1.1
以無菌操作將檢樣25mL(或g)放於有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內予置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內,經充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質器,以8
000-10
000
r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。
3.1.2
用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內,振搖試管混勻,做成1:100的稀釋液。
3.1.3
另取1mL滅菌吸管,按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用1支1mL滅菌吸管。
3.1.4
根據食品衛生標准要求或對檢樣污染情況的估計,選擇三個稀釋度,每個稀釋度,接種3管。
3.2
乳糖發酵試驗
將待檢樣品接種於乳糖
膽鹽發酵管內,接種量在1mL以上者,用雙料乳糖膽鹽發酵管,1mL及1mL以下者,用單料乳糖膽鹽發酵管。每一稀釋度接種3管,置36±1℃
溫箱內,培養24±2h,如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣,則可報告為大腸菌群陰性,如有產氣者,則按下列程序進行。
3.3
分離培養
將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上,置36±1℃
溫箱內,培養18-24h,然後取出,觀察菌落形態,並做革蘭氏染色和證實試驗。
3.4
證實試驗
在上述平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1-2個進行革蘭氏染色,同時接種乳糖發酵管,置
36±1℃溫箱內培養24±2h,觀察產氣情況。凡乳糖管產氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌,即可報告為大腸菌群陽性。
3.5
報告
根據證實為大腸菌群陽性的管數,查MPN檢索表,報告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。
4
糞大腸菌群(faecal
coliform)
4.1
用接種環將所有產氣的乳糖膽鹽發酵管培養物(見3.2條)轉種於EC肉湯管內,置44.5±0.2℃水浴箱內(水浴箱內的水面應高於EC肉湯液面),培養24±2h,經培養後,如所有EC肉湯管均不產氣,則可報告為陰性;如有產氣者,則將所有產氣的EC肉湯管分別轉種於伊紅美藍瓊脂平板上,置
培養18-24h,凡平板上有典型菌落者,則證實為糞大腸菌群陽性。
4.2
結果報告
根據證實為糞大腸菌群的陽性管數,查MPN檢索表,報告每100mL(g)糞大腸菌群的MPN值。
㈣ 菌落總數大腸桿菌和致病菌的檢測方法
菌落總數用平皿法,單位是個/ml(每毫升或毫克裡面有多少的完整的菌落),方法是:在無菌操作的前提條件下,吸取1ml的原液加入到9cm的平皿里,在倒入3-5ml(37℃)的營養瓊脂,在37℃的溫箱里培養24小時,取出來計算它的菌落單位總數就行.
大腸桿菌用發酵法,單位是MPN/100ml(每100毫升或毫克的樣品裡面最大可能菌落形成單位)方法是15管法(適合食品)或9管法(適合非食品如游泳池水),用乳糖膽鹽發酵管
致病菌用培養法,只要符合相應的化學，生物試驗就可以判斷為某致病均陽性
㈤ 食品衛生微生物檢驗菌落總數測定
上食品夥伴網查吧，一般不同產品檢測有一定的差異但大體方法都是一樣的！
.1 食品檢樣
3.2 培養基
平板計數培養基，無菌生理鹽水
3.3 其它
無菌培養皿，無菌移液管，無菌不銹鋼勺。
4 流程
5 步驟
5.1 取樣、稀釋和培養
5.1.1 以無菌操作取檢樣25g（或ml），放於225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適量的玻璃珠）或滅菌乳缽內，經充分振要或研磨製成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液後，最好置滅菌均質器中以8000～10000r/min的速度處理1min，製成1:10的均勻稀釋液。
5.1.2 用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內，振搖試管混合均勻，製成1:100的稀釋液。
5.1.3 另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支10ml吸管。
5.1.4 根據標准要求或對污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，分別在製作10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液於滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。
5.1.5 稀釋液移入平皿後，將涼至46℃營養瓊脂培養基注入平皿約15ml，並轉動平皿，混合均勻。同時將營養瓊脂培養基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內作空白對照。
5.1.6 待瓊脂凝固後，翻轉平板，置36±1℃溫箱內培養48±2h，取出計算平板內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數。
5.2 菌落計數方法
作平皿菌落計數時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落總數後，求出同稀釋度的各平皿平均菌落數。到達規定培養時間，應立即計數。如果不能立即計數，應將平板放置於0－4℃，但不要超過24h。
5.3 菌落計數報告方法
5.3.1 平皿菌落數的選擇
選取菌落數在30～300之間的平皿作為菌落總數測定標准。每一個稀釋度應採用兩個平皿平均數，其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜採用，而應以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的菌落數，若片狀菌落不到平皿的一半，而其餘一半中菌落分布又很均勻，則可以計算半個平皿後乘以2以代表全皿菌落數。
表1 稀釋度選擇及菌落數報告方式
2、不同稀釋度的選擇及報告方法
1）首先選擇平均菌落數在30~300之間者進行計算，若只有一個稀釋度的平均菌落數符合此范圍時，則將該菌落數乘以稀釋倍數報告之（見實例1）
2）若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30~300之間，則視二者之比值來決定，若其比值小於2應報告兩者的平均數（如實例2）。若大於2則報告其中稀釋度較小的菌落總數（如實例3）。若等於2亦報告其中稀釋度較小的菌落數（見實例4）。
3）若所有稀釋度的平均菌落數均大於300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見實例5）。
4）若所有稀釋度的平均菌落數均小於30，則應以按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見實例6）。
5）若所有稀釋度的平均菌落數均不在30~300之間，則應以最接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之，（見實例7）。
6）若所有稀釋度的均無菌落生長，則以<1乘以稀釋倍數報告之。
7）菌落計數的報告：菌落數在100以內時按實有數報告，大於100時，採用二位有效數字，在二位有效數字後面的數值，以四捨五入方法計算，為了縮短數字後面的零數也可用10的指數來表示。
稀釋度選擇及菌落總數報告方式
實例不同稀釋度的平均菌落數 兩個稀釋度 菌落總數 報告方式
10-1 10-2 10-3 菌落數之比 （CFU/mL） （CFU/mL）
1 1365 164 20 — 16400 16000或1.6×104
2 2760 295 46 1.6 37750 38000或3.8×104
3 2890 271 60 2.2 27100 27000或2.7×104
4 150 30 8 2 1500 1500或1.5×104
5 多不可計 1650 513 — 513000 510000或5.1×104
6 27 11 5 — 270 270或2.7×104
7 多不可計 305 12 — 30500 31000或3.1×104
8 0 0 0 — < 1×10 < 1×10