檢測細胞分裂的染色方法

㈠ 有絲分裂的實驗步驟

試劑儀器

洋蔥鱗莖，鑷子，刀片，培養皿，載玻片，蓋玻片，滴管，紗布，吸水紙，酒精燈，顯微鏡；固定液，15%鹽酸，醋酸洋紅染液，95%乙醇。

方法步驟

1、洋蔥根尖的培養

（1）培養洋蔥生根時，避免用新採收的洋蔥，因它尚在休眠不易生根。如果必須用當年剛採收的新洋蔥培養生根，則應設法打破它的休眠。常用的方法是用低濃度的赤黴素溶液浸泡洋蔥底盤，這樣可以促使其生根。培養過程中，注意每天至少換水一次，以防爛根。

（2）對於頭年收下的洋蔥，可以採用如下方法促使它生根：

①選擇底盤大的洋蔥作生根材料。

②剝去外層老皮，用刀削去老根（從底盤中央向四周削），注意不要削掉四周的「根芽」。

③用燒杯裝滿清水，放上洋蔥，放置在光照處。水要保持清潔，注意每天換水l～2次。一般2～3d即可獲得實驗所需材料（根長5cm）。

（3）固定時間取材。洋蔥根尖細胞有絲分裂的時間是有規律的。通常在每天上午10時至下午2時分裂活躍，尤其以下午2時最活躍，可在這時取材。可以把培養好的洋蔥根用卡洛氏固定液固定起來備用。因為培養一次洋蔥根不容易。

2、解離。用刀片切下長約2～3mm的根尖，放入盛有15%鹽酸和體積分數為95%的酒精溶液的混合液（1︰1）的培養皿中，解離3～5min，使根尖組織的細胞相互分開，待根尖透明酥軟即停止解離。如果要使解離加快，可以把培養皿放在酒精燈上微微加熱（不可煮沸）3～5 min。待根酥軟後，用鑷子取出。

解離充分是實驗成功的必備條件；解離的目的是用葯液溶解細胞間質，使組織細胞相互分離開。

3、漂洗。把取出的根尖放入清水漂洗約10min，也可以在培養皿口上蒙上—層紗布，用自來水細小的水流漂洗3～5min。

漂洗的目的是洗去根中多餘的解離液。如果不把多餘的解離液洗去，一方面會影響染色效果，因為解離液中含有HCl溶液，而用來染色的染料呈鹼性；另一方面還會腐蝕顯微鏡的鏡頭。

4、染色。把漂洗好的根尖置於載玻片上，用鑷子頭截下長約3mm的根尖，其餘部分丟棄，在根尖上滴一滴醋酸洋紅染液染色3～5min，如果要使染色加快，可把載玻片在酒精燈的火焰上快速過幾下（不可煮沸）。

5、裝片。在染好色的材料上蓋上蓋玻片，上面再覆一片載玻片，用拇指輕輕壓一下，使根尖組織成為均勻薄層的細胞層。

6、鏡檢

（1）低倍鏡觀察

把製成的洋蔥根尖裝片先放在低倍鏡下觀察，慢慢移動裝片，找到分生區細胞，其特點是：細胞呈正方形，排列緊密，有的細胞正在分裂。

（2）高倍鏡觀察

找到分生區細胞後，把低倍鏡移走，換上高倍鏡，用細准焦螺旋和反光鏡把視野調整清晰，直到看清細胞物像為止。

（3）仔細觀察

仔細觀察的目的是區分細胞分裂中各個時期內染色體變化的特點。可先找出處於細胞分裂中期的細胞，然後再找出前期、後期、末期的細胞，處於間期的細胞數目最多，最容易找到。

（4）在一個視野里，往往不容易找全有絲分裂過程中各個時期的細胞。如果是這樣，可以慢慢地移動裝片，從鄰近的分生區細胞中尋找。

7、繪圖。在仔細觀察清楚有絲分裂各個時期的細胞的以後，繪出洋蔥根尖細胞有絲分裂的簡圖。

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注意事項

1、培養產生洋蔥根尖的材料是洋蔥鱗莖。鱗莖底部接觸水，不能離開水，也不能被水淹。其目的是同時滿足其對水和空氣的需要。同時要經常換水，因為水中由於微生物的活動和根細胞的活動，代謝產物增多；

此外，還由於根細胞的呼吸不斷產生CO2，使水中H2CO3增多，氧氣缺少；微生物，如細菌的大量繁殖也使水質受到污染，這些都不利於根尖生長，所以要經常換水。—般一天至少一次，還要提供適宜的溫度。

2、剪取洋蔥根尖材料時，應該在洋蔥一天之中分裂最活躍的時間，一般在上午11點左右。如果因氣溫影響或不在—上述時間做實驗的話，可以在細胞有絲分裂最盛時取材，放人盛有固定液的培養皿中固定，即浸泡半天到一天。

固定後用75%乙醇沖洗幾次，再放入盛有70%乙醇的小廣口瓶中保存。注意要等根尖長到l～5cm時才能切取，而切取的洋蔥根尖長度是2～3mm。根據實驗得知，根長到1～5cm時，根的長勢最佳，此時細胞分裂最旺盛，容易找到不同時期的分裂圖象。

此時可取生長健壯的根進行觀察，切取洋蔥根尖2～3mm，這個長度要從根的頂端（根冠）開始算起，這個長度已將分生區包括了進來。若取材過長，在低倍鏡下尋找分生區就會很困難。

3、根尖培養好以後，裝片製作是否成功，關鍵的步驟是解離。15%的鹽酸溶液能溶解細胞壁之間的中層物質（胞間質），使組織中的細胞相互分開。否則，在顯微鏡下觀察時，細胞將發生重疊現象，導致實驗失敗。解離不充分，細胞重疊；

解離過度，細胞會腐爛，所以解離要適度。為達到這一目的，配製的鹽酸濃度要適宜，切取的根尖應立即放入15%的鹽酸中，在室溫下解離10～15min。解離時間要視室內溫度而定，溫度低，時間稍長，溫度高，時間短。也可手拿鑷子，輕輕按正在解離的根尖，感覺酥軟即可。

4、漂洗的目的是洗去根中多餘的解離液。如果不把多餘的解離液洗去，一方面會影響染色效果，因為解離液中含HCl，而用染色的染料呈鹼性；另一方面還會腐蝕顯微鏡的鏡頭。

5、染色時，染色液的濃度和染色時間必須掌握好。特別是染色不能過深，否則鏡下一片紫色，無法觀察。也不能過淺，否則染色質和染色體的形態和數目不易辨清。

6、製片時，一方面要用鑷子把洋蔥根尖弄碎，另一方面要壓片，這樣可以使細胞分散開來。壓片時，在蓋玻片上再加一片載玻片的目的，一是避免壓碎和移動蓋玻片。二是使壓力大小適中，從而使組織細胞均勻分散。同時用力必須恰當，過重時會將組織壓爛，過輕則細胞未分散開，二者都將影響觀察。

7、結果與討論

在顯微鏡的一個視野中看到的細胞，多數處於細胞有絲分裂的間期，因為在一個細胞周期中，間期所佔的時間占整個細胞周期的90%一95%，時間與細胞數目成正比。另外，在一個視野中，往往不容易找全有絲分裂過程中各個時期的細胞，可以慢慢地移動裝片，從鄰近的分生區細胞中尋找。

㈡ 細菌細胞染色的方式有哪幾種各有什麼作用

簡單染色法：利用單一染料對細菌進行染色的一種方法.例如番紅.
1．塗片：用灼燒滅菌冷卻後的接種環挑取少量菌體與水滴充分混勻,塗成極薄的菌膜.
2．乾燥：可自然晾乾,或將塗片置於火焰高處微熱烘乾,但不能直接在火焰上烘烤.
3．固定：手執玻片一端,有菌膜的一面朝上,通過迅速通過火焰2-3次（用手指觸塗片反面,以不燙手為宜）.
4．染色：加適量(以蓋滿菌膜為度)結晶紫染色液(或石炭酸復紅液),染l～2min.
5．水洗：用自來沖洗至流下的水中無染色液的顏色時為止.
6．乾燥
7．鏡檢
復染色：利用用兩種以上染料對細菌進行染色.例如革蘭氏染色法.
革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟,需要鹼性染料（basic dye）初染液；媒染劑（mordant）；脫色劑（decolorising agent）和復染液（counterstain）.
鹼性染料初染液的象在細菌的單染色法基本原理中所述的那樣,而用於革蘭氏染色的初染液一般是結晶紫（crystal violet）.媒染劑的作用是增加染料和細胞之間的親和性或附著力,即以某種方式幫助染料固定在細胞上,使不易脫落,碘（iodine ）是常用的媒染劑.脫色劑是將被染色的細胞進行脫色,不同類型的細胞脫色反應不同,有的能被脫色,有的則不能,脫色劑常用95%的酒精（ethanol）.復染液也是一種鹼性染料,其顏色不同於初染液,復染的目的是使被脫色的細胞染上不同於初染液的顏色,而未被脫色的細胞仍然保持初染的顏色,而且將細胞區分成G+和G-兩大類群,常用的復染液為番紅.
1.載玻片固定.在無菌操作條件下,用接種環挑取少量細菌於干凈的載玻片上塗布均勻,在火焰上加熱以殺死菌種並使其粘附固定.
2.草酸銨結晶紫染1分鍾.
3.自來水沖洗,去掉浮色.
4.用碘-碘化鉀溶液媒染1分鍾,傾去多餘溶液.
5.用中性脫色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脫色30秒,革蘭氏陽性菌不被褪色而呈紫色,革蘭氏陰性菌被褪色而呈無色.
6.用番紅染液或者沙黃復染30秒,革蘭氏陽性菌仍呈紫色,革蘭氏陰性菌則呈現紅色.

㈢ 用什麼方法可檢測到細胞有絲分裂各階段細胞核中DNA和細胞質中蛋白質含量變化

（1）可以利用放射性標記法，檢測細胞有絲分裂各階段細胞核中DNA和細胞質中蛋白質含量變化。
DNA，可以用3H標記的胸腺嘧啶脫氧核苷酸來顯示其含量的變化；
蛋白質，可以用35S標記的甲硫氨酸或者半胱氨酸來顯示其含量的變化。

（2）可以用流式細胞分選儀來測定細胞有絲分裂各階段細胞核中DNA和細胞質中蛋白質含量變化。
這種方法，簡便、快速、高效。

細胞核中染色體的形成是在細胞分裂期的中期階段完成的。

細胞分裂過程中核糖體功能比較活躍的時期是分裂間期（主要是分裂間期的G1期，S期和G2期也會合成少量的蛋白質）。

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㈣ 求細胞周期檢測方法：PI法操作步驟

1. 細胞培養：取對數生長期的細胞，按1×106cells/ mL以1mL接種24孔板或2mL接種於6孔板內，進行所需的處理（比如加入葯物），特定時間後終止培養，進行下一步的實驗。

2. 細胞固定： 800rpm離心5min，收集細胞沉澱，棄上清，用預冷PBS洗滌兩次，加入預冷75%乙醇，於4℃固定4h以上。

3. 細胞染色：1500rpm離心5min，棄上清，以3mL的PBS洗滌一次，加入400uL溴化乙錠（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。

4. 流式分析： 以標准程序用流式細胞儀檢測，一般計數2~3萬個細胞，結果用細胞周期擬和軟體ModFit分析。