① 花青素含量的測定
方法1:原花色素的測定方法(分光光度法)
本方法適用於各種植物組織、器官及其制劑(如葡萄子與松樹皮提取物)中原花色素含量的測定。
1. 方法提要
原花色素(也稱縮合單寧)是黃烷-3-醇的寡聚體與多聚體,屬多酚類化合物。與其他酚類化合物不同,黃烷醇(縮合單寧,單體,雙體等)在酸性介質中可與香草醛反應,生成在500nm處有最大吸收的有色物質,可通過比色測其含量。
2. 儀器
分光光度計。
3. 試劑
所用水為去離子水或同等純度蒸餾水。
(1)香草醛、甲醇、濃鹽酸均為分析純級。
(2)提純的原花色素或兒茶素。
(3)4%香草醛甲醇液。
(4)標准使用液:將提純的原花色素溶於蒸餾水,製成1mg/mL儲備液,將儲備液稀至濃度為1×10-2mg/mL至1mg/mL的標准使用液。標准使用液應於測定當天配製。
如無提純的原花色素,可用兒茶素代替,配製方法同上。
4. 測定步驟
(1)樣品中原花色素的制備:植物材料經4倍體積丙酮+水(7+3,體積比)或者經60%甲醇提取,40℃以下減壓蒸餾去除有機溶劑,水相再經乙醚洗滌後定容。
冰凍乾燥的固體原花色素制劑,直接溶於水中(先加少量甲醇助溶)製成原花色素液。
原花色素液於5℃下暗環境中保存備用。
(2)樣品測定:用錫箔將試管(14mm×20mm)包裹嚴,僅留管口用於加樣。向管內加入試樣0.5mL,再加3.0mL 4%香草醛甲醇液混合,然後加入1.5mL濃鹽酸,徹底混勻,室溫下顯色15min。也可在暗環境下進行以上操作。最後在500nm處比色。
可按以上操作步驟製得標准曲線(即0.1mg原花色素在500nm處的吸收值為0.55)。
5. 結果計算
計算原花色素量的公式,
原花色素(1×10-3mg)=A500nm÷0.55×100×V
式中 V——試樣稀釋體積(倍數)。
6. 注釋
(1)本方法的檢測范圍為(5~500)×10-3mg/0.5mL樣液。精密度與准確度大於1×10-3mg。
(2)反應試管應用清潔劑浸泡24h,徹底洗滌干凈。
(3)進行比色時,用水作空白。
(4)500nm處的OD值應控制在3以下。
(5)試樣中原花色素含量較高時,應從香草醛存在下所測A500nm值中減去無香草醛時所測值。
(6)顯色液應避光放置。
方法2:保健食品中原花青素含量的測定方法
1、原理
原花青素易溶於含羥基的溶劑如甲醇等,本方法是將樣品中的前花青素,用甲醇提取,加入鹽酸家溫水解後將其轉化為深紅色氰定(C15H10O6·HCL)後進行高壓液向色譜測定。
2、試劑:
2.1二氯甲烷 分析純
2.2甲醇 色譜純
2.3異丙醇 分析純
2.4甲酸 分析純
2.5鹽酸 分析純
3、檢驗方法
3.1樣品 稱取約500mg油溶性樣品於100ml錐形瓶中,加入5.0ml二氯甲烷,振搖使其溶解。加入45.0ml甲醇,振搖5min後過20μm濾膜。取5.0ml濾液於25ml容量瓶中,加入5.0ml3mol/L鹽酸,振搖並用異丙醇定容至刻度。立即過5μm濾膜,取出一部分置於試管中,塞緊瓶塞並在100±5℃烘箱中放置45min進行水解,取出後放置至室溫後進行液相色譜分析。
3.2標准 除稱取25.0mg標准品於100ml錐形瓶中外,其餘步驟均同樣品。
3.3定量方法 標准曲線外標法定性定量分析。
4、色譜分析條件
4.1流動相:水:甲醇:異丙醇:甲酸=73:13:6:8
4.2檢測波長:525nm
4.3色譜柱:島津Shim-Pak CLC ODS 15cm×6mm
4.4柱溫:35℃
4.5流速:1ml/min
② 花青素檢測
平時,我們會見到一些植物的葉子是紅色的,比如,紅莧菜、秋海棠、糖蘿卜等,它們也是能夠進行光合作用的。生物書上解釋說,這是由於這些植物的葉子里也含有很多的葉綠素,只不過其中還含有大量的花青素(呈紅色),掩蓋了綠色而已。但如何向學生證明葉子里也含有很多的葉綠素呢?
可以用這樣的一個小實驗來證明:取一片(或幾片)紅色葉子,放到一杯清水裡面,加熱清水至沸騰,再煮5min左右,用鑷子取出葉子,可發現葉片的紅色已基本褪盡,而呈現出一片綠色。原因是,花青素是一種很容易溶於水的物質,而葉綠素則比較穩定,不易溶解於水中。經熱水一燙,花青素便迅速地溶入了水中,故葉子上的紅色便褪去了,露出了葉綠素的綠色。
為了證實溶解在水中的是花青素,可加入稀HCl或稀NaOH來調節水的pH值,讓溶液分別呈酸、中、鹼性。可發現,當為酸性時,溶液呈紅色;當為中性時,溶液呈紫色;當為鹼性時,溶液呈藍色。這三種顏色正是花青素在酸、中、鹼性水溶液中的表現。所以,在這些葉子中,花青素的紅色確實是將葉綠素的綠色掩蓋住了。
不但這些紅葉子有這樣的特性,凡含有花青素的(一般是呈大紅、紫、藍色的,不是呈橙、黃色的)花、果,如木棉、紫荊、牽牛、荔枝、葡萄、李子等的花,都有類似的表現;甚至連一些秋天會變紅的樹葉,如黃櫨、楓、烏柏、黃連木等的葉子,經煮後也會褪盡紅色,而露出了橙、黃色。