結核菌t細胞檢測用什麼方法學做

❶ 簡述T細胞功能測定的常用方法

免疫學檢測方法可分為體液免疫和細胞免疫測定。1．體液免疫測定主要利用抗原與相應抗體在體外發生特異性結合，並在一些輔助因子參與下出現反應，從而用已知抗原或抗體來測知未知抗體或抗原。此外，尚包括檢測體液中的各種可溶性免疫分子，如補體、免疫球蛋白、循環復合物、溶菌酶等。2．細胞免疫測定法是根據各種免疫細胞（T細胞、B細胞、K細胞、NK細胞及巨噬細胞等）表面所具有的獨特標志和產生的細胞因子等，測定各種免疫細胞及其亞群的數量和功能，以幫助了解機體的細胞免疫水平。體液免疫檢測法1.凝集反應。顆粒性抗原（細菌或紅細胞等）與相應抗體特異性結合，在電解質參與下形成肉眼可見的凝集物，稱之為凝集反應。1）直接凝集反應。顆粒性抗原與相應抗體直接結合所產生的凝集現象，前者多為細胞表面的結構成分，如細菌或紅細胞的表面結構抗原。⑴玻片法：多用於抗原的定性檢測。⑵試管法：多用於抗體的定量檢測。2）間接凝集反應。將可溶性抗原吸附於載體顆粒（如乳膠顆粒、紅細胞等）的表面，稱之為致敏顆粒。當致敏顆粒與相應抗體結合，即可出現凝集現象。這個反應常用於測定細菌性抗體、病毒性抗體、鉤端螺旋體和梅毒螺旋體抗體及某些自身抗體（如抗核抗體、抗腎抗體、抗甲狀腺抗體等）。根據凝集反應的原理，還有間接凝集抑制試驗、反向間接凝集試驗、協同凝集試驗等。2．沉澱反應。可溶性抗原（外毒素、血清、細菌培養的濾液、組織浸出液等）與相應抗體特異性結合，在電解質參與下，形成沉澱物，稱為沉澱反應。沉澱反應的抗原多為多糖、類脂、蛋白質等。1）單向擴散試驗。這是一種抗原定量試驗，是可溶性抗原在含抗體的瓊脂介質中擴散的沉澱反應。此法常用於檢測血清免疫球蛋白和補體各成分的含量。2）雙向擴散試驗。這是可溶性抗原與抗體在瓊脂介質中相互擴散的沉澱反應。本法常用於定性試驗，如檢測血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。單克隆抗體技術3）對流免疫電泳。對流電泳是一敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴散。此法常用於檢測血清中的乙型肝炎表面抗原與甲胎蛋白等。3．中和試驗。特異性抗體可抑制相應抗原物質的活性，抗體使相應抗原的毒性或傳染性消失的反應為中和試驗。例如抗毒素中和外毒素的毒性，病毒的中和抗體可使病毒失去感染性等。診斷風濕熱的抗鏈球菌溶血毒素「O」試驗也為一種中和試驗。乙型溶血性鏈球菌能產生一種溶解人、兔紅細胞的溶血毒素「O」，該毒素的溶血毒性可被抗溶血毒素「O」抗體所中和而不出現溶血。試驗時將病人血清與溶血毒素「O」混合，作用一段時間後加入人紅細胞，紅細胞不被溶解為陽性反應，表示病人血清中存在抗溶血毒素「O」抗體。血清抗體效價達400單位以上時提示患者曾感染乙型溶血性鏈球菌，有助於風濕熱的診斷。4.免疫熒光法（熒光抗體法）。是應用熒光素染料（如異硫氰酸熒光黃等）來標記抗體，但不影響其活性，此種抗體稱熒光抗體。用已知種類的熒光抗體浸染待檢的含有抗原的細胞或組織切片，如有相應抗原存在，則抗原即與此種抗體發生特異性結合，形成復合物而粘著在細胞上，不易洗脫，在熒光顯微鏡下成為發出熒光的可見物，可達到診斷或定位的目的。包括直接法和間接法。5．酶聯免疫吸附試驗。本法的原理是利用酶（常用辣根過氧化物酶）標記的抗原或抗體，以測定被檢標本中有無相應的抗原或抗體。有間接法、雙抗體法、競爭法三種。6．溶血空斑試驗。7．免疫印跡技術。免疫印跡或免疫轉印技術(immunoblotting或Westernblot）是在Southern(1975)抗體抗原反應創建的DNA印跡術(Southernblotting）基礎上發展起來的新型免疫生化技術。細胞免疫檢測法近代免疫學廣泛採用了細胞生物學、免疫血清學、免疫標記、免疫組化等多方面技術，不斷發展和完善了一系列細胞免疫檢測技術，用於檢測各類免疫細胞的表面標志（包括抗原及受體）、細胞的活化、增殖、吞噬、殺傷功能、各種細胞因子的活性或含量等方面。這些技術為深入研究和認識機體免疫系統的生理、病理改變，闡明某些疾病的發病機制和臨床診治提供了有用的手段。隨著細胞免疫學的迅猛發展，時有新的細胞免疫檢測技術出現。二十一世紀初期，新發展的項目集中在對有關細胞因子以及細胞受體方面的檢測。1．淋巴細胞轉化試驗。人類淋巴細胞在體外與特異性抗原（如結核菌素）或非特異性有絲分裂原（如植物血凝素，PHA）等一起孵育，T細胞即被激活而向淋巴母細胞轉化。T細胞轉化過程可伴隨有DNA、RNA、蛋白質的合成增加，最後導致細胞分裂。在光學顯微鏡下可計數轉化後的淋巴母細胞數，也可用氚標記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR）摻入正在分裂的淋巴細胞，用液閃測定儀來確定摻入量以確定淋巴細胞轉化率。2000年開始出現一種不用同位素，又可用儀器測量的淋巴細胞增殖反應的檢查法，稱為MTT檢測法。MTT是一種甲氮唑鹽，它是細胞線粒體脫氫酶的底物，細胞內的酶可將MTT分解產生藍黑色成分。該產物的多少與活細胞數成正比，結果可用酶標儀(595nm）測量光密度，作為MTT法的指標。2．E-花環法。人類T細胞表面有羊細胞受體(CD2）能與羊紅細胞結合形成玫瑰花樣結構。即將分離液分離出的外周的單個核細胞懸液與羊紅細胞在體外混合，經37℃培養5～10分鍾後放4℃過夜，取細胞懸液計數，外周血淋巴細胞中約70%～80%淋巴細胞結成花環即為T細胞，此法可用來分離T細胞。3．T細胞亞群檢測。4．細胞毒試驗。Tc細胞、NK細胞、LAK細胞、TIL細胞等對其靶細胞有直接的細胞毒（殺傷）作用。抗體制備常用的檢測方法是51Cr（鉻）釋放法，將51Cr-Na2CrO4鹽水溶液與靶細胞（不同的細胞需不同的靶細胞，如NK細胞的靶細胞為K562），於37℃培養1小時左右，51Cr即進入靶細胞，與胞漿結合，洗去游離的51Cr後，即可得到51Cr標記的靶細胞，將待測細胞毒的細胞與51Cr標記的靶細胞混合（比例約為50:1或100:1），靶細胞殺傷越多，釋放到上清液中的游離51Cr就越多，且不能再被其他細胞吸收，用γ射線測量儀檢測上清液中的cpm值，可計算出待檢細胞殺傷活性高低。細胞毒的檢測對腫瘤免疫有較大價值。5．巨噬細胞吞噬功能的測定。將中葯(10%斑蝥）乙醇浸出液浸漬的濾紙（1cm2大小）置於受試者前臂屈側皮膚上，4～5小時後取下濾紙。48小時內皮膚局部可水泡，內含巨噬細胞。取水泡液0.5ml加雞紅細胞懸液0.01ml，37℃經30分鍾後作塗片、染色與鏡檢，計算吞噬百分率及每個巨噬細胞吞噬雞紅細胞的平均數。本試驗有助於腫瘤病情及療效的觀察。6．移動抑制試驗。致敏淋巴細胞與其特異性抗原再次接觸時，可以產生移動抑制因子(MIF）。這種因子可以抑制巨噬細胞和中性粒細胞的移動，使之定位於局部而增強其免疫作用。本試驗用來觀察受檢者淋巴細胞在體外受特異性抗原刺激後，有無MIF產生，以測定機體對某種抗原的特異性細胞免疫反應的功能。7．時間分辨熒光測量技術。時間分辨熒光測量技術(time-resolvedfluorometry,TrF）是一項新型的超微量非放射性分析技術。該技術的敏感性和特異性與放射性核素測量技術相仿，但無放射測量的弊端，故問世雖短，進展卻極為迅速，有取代放射測量之勢。8．細胞因子檢測技術。細胞因子的檢測，2005年起在中醫臨床及實驗室中已廣泛應用。9．細胞受體的檢測。受體是細胞表面標志之一，通過對受體的檢測，可以了解細胞的功能，並為某些疾病的發病機制提供一定的理論依據。

❷ tspot試驗是什麼原理

抗原刺激外周血單核產生IFN-γ。

IGRA利用結核分枝桿菌而非牛分枝桿菌BCG株系表達的抗原刺激外周血單核產生IFN-γ。檢測結果在血樣採集後12至18小時得出，報告結果分為陽性、陰性和不確定。

因為具有高敏感性和高特異性，並且不受卡介苗和大多數非致病分枝桿菌的影響，IGRA在結核診斷中的意義正在被越來越多的臨床實驗所證實，尤其對於像中國這樣普遍接種卡介苗的結核高負擔國家，更具有重要意義。

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tspot試驗的要求規定：

1、莢膜能與吞噬細胞表面的補體受體3（CR3）結合，有助於結核分枝桿菌在宿主細胞上的粘附與入侵。

2、莢膜能防止宿主的有害物質進入結核分枝桿菌，故結核標本用4% NaOH消化時，一般細菌很快殺死，但結核分枝桿菌可耐受數十分鍾。結核分枝桿菌入侵後莢膜還可抑制吞噬體與溶酶體的融合。

3、硫酸腦苷脂可抑制吞噬細胞中吞噬體與溶酶體的結合，使結核分枝桿菌能在吞噬細胞中長期存活。

❸ 敘述結核桿菌的檢驗程序

結核桿菌與麻風桿菌是分枝桿菌屬中的主要病原菌。
結核桿菌菌體細長略帶彎曲，有分枝生長趨勢。菌體含脂量高，與其抗酸特性、抵抗力特性、致病性與免疫性等都有密切關系。該菌營養要求高，生長緩慢，形成「菜花狀」菌落。

一、結核桿菌檢驗程序
結核病人病灶中查到結核桿菌，是病原學診斷的重要依據，根據感染部位不同，可採集病人的痰、尿、糞便、腦脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序進行檢驗。

二、結核桿菌培養特性
1. 液體培養基（蘇通氏培養基、小川培養基、血清酸性培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理（即酸鹼處理，可液化標本，也可殺死雜菌，還可濃縮集菌）後接種液體培養基，35℃培養1-2周，由於表面生物，可在培養基表面表成污灰、乾燥、有皺褶的菌膜。
2. 固體培養基（改良羅氏培養基、丙酮酸鈉培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理後，接種固體培養基，37℃培養2-4周，在培養基表面可形成乳白或米黃色、不透明、粗糙顆粒狀或節狀堆聚的菌落，呈現「菜花狀」。
3. 結核桿菌快速培養檢測方法：無菌手續將前處理後的材料塗片，置液體培養基中，35℃恆溫箱CO2培養箱內培養，3-5日後，每隔日取出一玻片，染色鏡檢，可快速獲得結果。

三、齊~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法
【原理】
結核桿菌對苯胺染料不易著色，若加溫或延長染色時間使其著色後，再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色，再經美蘭復染，結核桿菌及其他分枝桿菌仍呈紅色，而非抗酸菌和細胞雜質等呈藍色。
【材料】
1. 結核病人痰液：採取清晨第一口粘痰，或濃縮集落菌法處理過的痰標本。
2. 抗酸染色液
3. 載物玻片、玻片夾、酒精燈、臘筆等。
【方法】
1. 無菌手續採取痰液塗片，自然乾燥，火焰固定。
2. 用臘筆將塗面局部隔開，滴加石炭酸復紅染液，酒精燈上加熱至出現蒸氣。切勿沸騰，亦不可使染液乾涸。如有乾涸的趨勢，應及時補加染液。持續染色5-8分鍾，待冷後流水漂去多餘的染液。
3. 用3%鹽酸酒精清脫色，脫至塗面無色為止，約1-3分鍾，自來水沖洗。
4. 滴加呂氏美蘭染液復雜30秒~1分鍾，水洗。自然乾燥或吸干後油鏡檢查。
【結果】
1. 結核桿菌呈現細長，略有彎曲的紅色菌體，有的可表現出分枝特徵，有的菌體表現有多數濃染顆粒。結核桿菌大多分散排列，亦可以見到有縱行條索狀排列。
2. 塗片染色能查到結核桿菌者，一般需要每毫升痰液內含菌量至少應有500個以上，甚至需達到5萬以上。故材料多進行濃縮集菌處理，以提高檢出陽性率，也造成在染色標本片觀察中，不一定每個視野都能看到結核桿菌。
3. 結核桿菌易發生變異，在陳舊培養基或臨床治療後標本材料中，結核桿菌往往菌體斷裂，或形成非抗酸性革蘭氏陽性的短桿狀、球狀顆粒，亦稱Much顆粒。
4. 標本已經高壓滅菌處理，不影響染色結果，也保證操作者的安全。

四、熒光染色法
此系用金胺熒光素染擴酸性細菌的方法，簡便易行，但不具特異性。金胺染色法有多種、現列於後表，可選擇使用，應用熒光顯微鏡檢查結果。

五、結核桿菌毒力試驗——動物試驗法

【材料】
1. 動物：體重200~250克豚鼠2隻
2. 結核桿菌培養物或結核病人檢驗材料（痰、尿、糞、腹水等材料經濃縮集菌）
3. 注射器及消毒用材料等。
【方法】
1. 選取結核菌素試驗為陰性的豚鼠兩只。
2. 吸取結核桿菌懸液或病人檢材，注入豚鼠腹股溝皮下0.1ml
3. 注射後每周定期檢查一次，觀察豚鼠腹股溝淋巴結是否腫大，局部變硬，化膿及體重減輕、體溫升高等症狀。
4. 給豚鼠作結核菌素試驗，是否出現陽性結果。
5. 6周後，將豚鼠進行解剖，觀察淋巴結是否腫大，有無乾酪性病變，肝、脾、肺等是否腫大，表面有無灰白色結節病灶，取可疑病灶進行塗片染色鏡檢和分離培養。若為陽性結果，可報告「動物接種後××天查到有結核菌感染」。如無症狀及病變者，可報告為陰性。

六、結核桿菌濃縮集菌法（以處理痰標本為例）
【材料】
結核病人24小時痰液，細口瓶，0.02%酚紅液、汽油，NaOH，無菌生理鹽水等。
【方法】
(一)漂浮法：
1. 取24小時痰液15毫升，裝入細口瓶內，加入2倍量0.5%NaOH搖勻，高壓滅菌或煮沸20—30分鍾殺菌。
2. 待冷後加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振盪20—30分鍾，用生理鹽水加至液面與瓶口齊，靜置半小時。
3. 取瓶口表面油狀物塗於載物玻片上，微微加熱，干後再加，如此重復5—6次，至厚度適宜，烘乾待冷，抗酸染色，油鏡頭檢查。

(二)沉澱法：
1. 取痰液1份或2倍量4%NaOH，高壓無菌或煮沸20—30分鍾後，加入0.02%酚紅指示劑0.1毫升，劇烈振盪混勻，亦可置37℃水浴消化30分鍾。
2. 矯正PH為7.0，3000轉/分離心30分鍾，棄去上清液。
3. 取沉澱物塗片染色鏡檢。若進行分離培養和動物接種，可免去高壓滅菌或煮沸的程序。

附錄：抗酸染液的配製
1. 石炭酸復紅液：稱取鹼性復紅4克，溶於95%酒精100毫升中成飽和液。再取飽和液10毫升與5%石炭酸溶液90毫升混勻即成。
2. 3%鹽酸酒精：取濃鹽酸3毫升，95%酒 97毫升混合。
3. 呂弗勒氏鹼性美蘭液：稱取美蘭2克，溶於95%酒精100毫升中，配成飽和液，取飽和液30毫升，再加入蒸餾水100毫升及10%氫氧化鉀水溶液0.1毫升即成。

❹ 結核菌素的試驗方法有哪些

結核菌素試驗方法有皮內注射法，皮上劃痕法，皮上貼膏法等。

皮內注射法是臨床上最常用的一種方法。

（1）皮內注射法：臨床上用此方法，如同做青黴素皮試一樣，將舊結核菌素稀釋液（1 ∶ 1000 或1 ∶ 2000）1ml，注射於左前臂掌側下1/3，於48 ～ 72 小時看結果，局部出現紅暈且有硬結，直徑超過5mm 以上者為陽性結果。如懷疑有嚴重活動性肺結核者，宜用1 ∶ 10000 稀釋液，以防局部的過度反應以及可能的病灶反應。注射後48 ～ 72 小時看結果，陰性者用高一級濃度再試，直到1 ∶ 100稀釋液為止。

（2）皮上劃痕法：與上述相同部位滴舊結核菌素原液1 滴，然後，以消毒的針劃破表皮，劃痕不超過5mm，若劃2 或3 條以上時，劃痕間應有1cm 的距離，以有淋巴液滲出為度，但勿使出血，48 ～ 72小時看結果，沿線出現紅腫達3mm 以上者為陽性。此種方法，因陽性率低，故不常用。

（3）敷貼試驗法：將定量的結核菌素或純蛋白衍生物（PPD），浸在1cm2 的布上，敷貼在前臂掌面1/3 處，上蓋塑料薄膜固定，48小時後除去敷布，再隔48 小時看結果，陽性者局部可有3 ～ 4 個丘疹或小水泡，主要用於嬰幼兒。

❺ tbspot結核菌素斑點試驗怎麼做

結核感染T細胞斑點試驗的操作方法是這樣的，一般採集10ml左右的新鮮外周血，對標本加入抗凝劑，然後離心機離心分離血清,加入培養基懸浮細胞再加入細胞培養液作為陰性對照，根據實際檢查情況出具檢查報告。

❻ 結核桿菌用什麼方法檢測

結核桿菌培養特性 1. 液體培養基（蘇通氏培養基、小川培養基、血清酸性培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理（即酸鹼處理，可液化標本，也可殺死雜菌，還可濃縮集菌）後接種液體培養基，35℃培養1-2周，由於表面生物，可在培養基表面表成污灰、乾燥、有皺褶的菌膜。 2. 固體培養基（改良羅氏培養基、丙酮酸鈉培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理後，接種固體培養基，37℃培養2-4周，在培養基表面可形成乳白或米黃色、不透明、粗糙顆粒狀或節狀堆聚的菌落，呈現「菜花狀」。 3. 結核桿菌快速培養檢測方法：無菌手續將前處理後的材料塗片，置液體培養基中，35℃恆溫箱CO2培養箱內培養，3-5日後，每隔日取出一玻片，染色鏡檢，可快速獲得結果。 詳細的檢測方法生物幫上面有的，蛋白質互作 http://www.bio1000.com/zt/protein/232119.html

❼ 結核病檢測新方法 — TB-IGRA

歷史上，結核桿菌曾在全世界廣泛流行，導致數億人死亡，被稱之為白色瘟疫。從結核桿菌的高感染率、高患病率、高耐葯率以及高死亡率這些特點來看，雖然政府對結核病防治有一定的資金投入，但是仍會給結核病患者家庭帶來一定的經濟壓力，因此，結核病還是因病致貧、因病返貧的主要疾病。為了提高民眾對結核病的認識，世界衛生組織確定每年3月24日為「世界防治結核病日」 。

TB-IGRA理論依據--T細胞免疫原理

工作原理：機體感染結核桿菌以後，存於血液中的特異性淋巴細胞會在再次接觸結核桿菌特異性抗原時，產生和分泌相應的細胞因子干擾素g。通過對該細胞因子的定量檢測，可以對疾病的感染狀況進行判斷。判斷機體被結核桿菌感染的風險。根據這個原理，選取存在於結核桿菌，但在卡介苗和大多數非結核桿菌中普遍缺失的RD1區編碼的ESAT-6和CFP-10作為結核桿菌特異性抗原，與新鮮採取的肝素鈉抗凝全血或者PBMC(外周血單個核細胞)充分混合孵育後，應用酶聯免疫法或者免疫斑點法檢測特異性g-干擾素的釋放。結果不受卡介苗干擾，提高了結果的特異性。

TB-IGRA應用現狀：
IGRA技術是國際最新的用於結核桿菌感染的體外免疫診斷方法;

在北美、歐洲和日本已被廣泛應用於結核桿菌感染的檢測，包括結核病輔助診斷; 高危人群篩查;公共衛生突發事件;體檢等(含不孕不育人群);

美國和日本已經將該技術寫入該國用於結核防治的指導原則中。

適應人群：

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