❶ 如何用流式檢測細胞凋亡
前言
細胞凋亡通常稱為細胞程序性死亡，是由基因控制的主動性細胞死亡過程。越來越多數據發現，細胞凋亡與多種疾病密切相關，如癌細胞具有連續增殖、抵抗細胞凋亡能力，利用流式細胞儀分析細胞凋亡可為腫瘤診斷，療效評價和預後預測提供了重要的參考指標。然而很多實驗的同學們，常會碰到上機檢測時細胞死亡太多卻檢測不出凋亡，多次重復結果不一致等現象，本文就一起看看如何把細胞凋亡的數據變的更加漂亮，准確！
首先，明確一下細胞凋亡和壞死的區別
細胞凋亡(apoptosis) 是一件主動性細胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控，是細胞為更好地適應環境而主動爭取的一種死亡過程。 具體表現為： 出芽形成凋亡小體、核小體間DNA的切割，凋亡小體被吞噬和消化等幾個連續過程等[1]（如下圖所示）。
圖1：細胞凋亡的發生過程[1]
細胞壞死（necrosis） 則是一件被動的過程，是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程，即病理條件下，自體損傷的一種現象。 具體表現為： 細胞脹大，胞膜破裂，細胞內容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，會引起局部嚴重的炎症反應（如下圖所示）。
圖2：細胞壞死的發生過程[1]
一、流式檢測細胞凋亡的原理
Annexin V和PI雙染法是流式檢測細胞凋亡的經典方法 ，它是基於凋亡的早期細胞膜上的磷脂醯絲氨酸（phosphotidylserine, PS）從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面這一原理來實現的（如下圖3）。
圖3：凋亡早期 PS從細胞膜的內側外翻
該方法簡便、快速、准確區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，具體原理如下：
因此，將Annexin V與PI聯合使用時，便可用來鑒別活細胞，凋亡細胞及死亡細胞。
二、實驗操作步驟
三、數據分析
Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒是用FITC標記的Annexin V作為探針，FITC最大激發波長為488 nm，最大發射波長525 nm，FITC的綠色熒光在FL1通道檢測；PI-DNA復合物的最大激發波長為535 nm，最大發射波長為615 nm，PI的紅色熒光在FL2或FL3通道檢測。通過軟體分析，繪制雙色散點圖，FITC為橫坐標，PI為縱坐標。
如下圖所示：細胞可以分為4個象限：
圖4：4個象限的細胞分布圖
舉例：如常用於研究葯物或者基因等對細胞凋亡的影響。 通過比較Control組和葯物組，發現化合物可以誘導前列腺癌細胞系PC-3M的細胞凋亡，處理組（20μM）的晚期凋亡細胞比例與Control組（0μM）相比，從1.79%上升到11.39%。進而還可根據每個象限的數據計算出活細胞、凋亡細胞和壞死細胞百分率。
圖5. 葯物濃度梯度依賴性的誘導PC-3M細胞凋亡[2]
四、常見問題解答
1. 如何避免出現假陽性結果？
2. 為什麼必須收集細胞上清？
因為凋亡的細胞可能會脫壁，懸浮於培養基，所以必須收集上清再離心取沉澱，合並胰酶消化下來的細胞，不然檢測出來的凋亡比例可能會減少。
3. 為什麼在染色後1h內就要上機檢測？
由於細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色後1小時之內進行分析；PI受時間的影響很大，因標記了PI後會加大細胞毒性，特別是檢測早期凋亡時，如果時間延長除了會導致在流式細胞儀上的細胞分群差距加大外，誤差會明顯加大，所以建議在一個小時內檢測。
4. 其他注意事項
參考文獻：
[1]Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 2007;35:495-516.
[2]Qin M, Peng S, Liu N, et al. LG308, a Novel Synthetic Compound with Antimicrotubule Activity in Prostate Cancer Cells, Exerts Effective Antitumor Activity.[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2015,355(3): 473-483.
❷ 流式檢測細胞周期都有哪些染色方法
從分類上來說，一般有兩類：第一類是只染DNA。這類方法比較簡單，用酒精固定細胞後，直接加含有RNA酶的熒光染料，比如PI等，然後就可以直接上機。
第二類另外加了一個步驟，在細胞培養液中加入核苷酸的模擬物，比如BrdU或者EdU。細胞新合成的DNA上就會有這些物質。在不同時間點收集細胞，用DNA染料染DNA的同時，還以用抗體或者化學發光法染核苷酸模擬物也發熒光。這個方法的有點就是不僅可以像第一類方法一樣，看到處於細胞周期各個期的百分率，另外還可以看到有多少DNA是新合成的。是一個動態的過程。
❸ 流式細胞術檢測細胞表面抗原的步驟
1. 定量細胞濃度
2. 分為2組，一組為實驗組，另一組為抗體對照組
3. 兩組都先加入非特異性的IgG，封閉可能的Fc受體
4. 按照抗體生產廠家的推薦濃度加入抗體，對照組加入同樣熒游標記的非特異性同型抗體。
5. 4°孵育半小時
6. 用含0.5% BSA的PBS洗2遍
7. 上機後先用抗體對照組設置陰性Gate。
8. 檢測樣本。
❹ 細胞內細胞因子的流式細胞怎樣檢測
胞內流式分析法是用抗細胞因子抗體與細胞表面或胞內特定亞群標志組合，即可檢測不同細胞亞群細胞因子的分泌，同時採用特殊的化學與抗體選擇，確保靜止與無細胞因子分泌細胞的最小熒光背景。具有其它方法難以比擬的優點： 快速：流式定量檢測細胞內細胞因子可在一天內完成，實驗流程需6-8小時，實際操作時間為1-2小時，快速簡便; 簡便：無需組織培養，可以全血分析，無需分離PBMCs; 靈敏度高：高度靈敏的熒游標記與檢測系統; 高效：可以在同一個細胞內同時檢測兩種或更多種細胞因子，也可根據細胞免疫表型區分分泌細胞因子的細胞的亞型，進行多參數相關分析; 安全：減少樣本處理與生物源性污染 接近生物體的分析條件：全血檢測保留細胞及生化微環境更准確反映了體內狀況。 生物幫上面有這方面的詳細內容，SDS提取法 http://www.bio1000.com/experiment/hesuan/241857.html