絕對定量的檢測方法有哪些

① 高效液相色譜有幾種定量方法其中那種是比較精確的定量方法並簡述

峰面積法、峰高法、歸一法、外標法。峰面積法是比較精確的定量方法

② 常用的基因突變檢測方法有哪些

1、焦磷酸測序法

測序法的基本原理是雙脫氧終止法，是進行基因突變檢測的可靠方法，也是使用最多的方法。

但其過程繁瑣、耗時長，靈敏度不高，對環境和操作者有危害，故在臨床應用中存在一定的限制。

焦磷酸測序法適於對已知的短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美，而速度卻大大的提高。

焦磷酸測序技術產品具備同時對大量樣品進行測序分析的能力。

為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態性研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平台。

2、微數字聚合酶鏈反應

該方法為將樣品作大倍數稀釋和細分，直至每個細分試樣中所含有的待測分子數不超過1個，再將每個細分試樣同時在相同條件下聚合酶鏈反應後，通過基因晶元逐個計數。

該方法為絕對定量的方法。

3、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析技術

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。

該法一般用於檢測已知的突變位點。

因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。

這也是「微量證據」的威力之所在。

由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。

到如今2013年，PCR已發展到第三代技術。

1976年，台灣科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。

PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右）。

DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。

基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

4、高效液相色譜法

該方法是基於發生錯配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特徵的差異而進行檢測的，可檢測出含有單個鹼基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段。

與測序法相比，該法簡單、快速，不僅可用於已知突變的檢測，還可用於未知突變的掃描。

但只能檢查有無突變，不能檢測出突變類型，結果判斷容易出錯。

5、單鏈構象異構多態分析技術

依據單鏈DNA在某一種非變性環境中具有其特定的第二構象，構象不同導致電泳的遷移率不同，從而將正常鏈與突變鏈分離出來。

與測序法相比，靈敏性更高。

③ DNA絕對定量要怎麼進行

拷貝數計算根據下面就可以，很簡單的。拷貝數＝（質量÷分子量）×6.0e+23。

每個明大雹鹼基的平均分子量是324.5，質粒的分子量是324.5*3560*2=2310440，10μg質粒的摩爾數是10/2310440/1000000=4.328e-12，一摩爾等於6.023e+23，則10μg質粒有4.328e-12*6.023e+23=2.607e+12拷貝。

一對鹼基的分子量為660Da，重量為1e-15μg，則10μg質粒拷貝數=10/（1e-15*3560）=2.7e+12分子。

例如pGEM-T載體長3003bp，插入的目的片斷長162bp，每個鹼基的平均分子量激帆是330，（每對鹼基/bp是660，）質粒原液約250μg/mL，阿弗加德羅常數（每mol的微粒數）是6.02e+23/mol。那麼每2μl的絕對模板數量是：=14.4e+10所以，10-4~10-7質粒的模板分子數是14.4e+6~3。簡單的說：每ul質粒拷貝數=（質量/分子量）x（6.0e+23）=[質粒濃度（ng/ul）x1ul]x10-9/[（質粒分子量+插入片仿空段分子量）x660]x（6.0e+23個/mol）。

④ 什麼是相對定量和絕對定量啊

絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數目,即通常所說的拷貝數.相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例,而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數.舉例來說,如果研究項目中包括處理過的和未經處理的對照樣本,通常可以將未經處理的樣本指定為基準,規定橋喚敬其目的基因濃度為 100%,將經處理的樣本的定量結果除以對照樣品的定量結果,就可以計算各個處理樣本的基因含量相對於未處理樣品的百分比.
絕對定量實驗必須使用已知拷貝數的絕對標准品,必須做標准曲線.相對定量可以做標准曲線,也可以不做標准曲線.
相對定量實驗有兩種方法：標准曲線法和CT值比較法.如果使用標准曲線法,可以使用絕對標准品,也可以使用相對標准品,而且相對標准品在實驗操作上更為簡便易行.相對標准品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數目的標准品,典型的做法是將一個已知pg數的樣品做一系列梯度稀釋.
CT值比較法是利用CT值與起始DNA濃度的對數成反比的數學關系,來計算不同樣本之敏慎間的相對百分比,其計算公式是
絕對定量鏈消的數據易於理解,但是絕對標准品的制備和測定其DNA含量比較困難.有許多商業性的標准品試劑盒供選購,可以解決這種困難.相對定量的標准品容易在實驗室里自己制備,但是數據處理比較麻煩,對實驗數據的解釋有一定難度.

⑤ 高效液相色譜有幾種定量方法，其中哪種是比較精確的定量方法

峰面積法、峰高法、歸一法、外標法。峰面積法是比較精確的定量方法

⑥ qPCR檢測，你需要知道這些

生物學劃分為兩個時代：PCR前時代和PCR後時代，這是《紐約時報》對穆利斯先生發明PCR技術的評價。1983年，Kary B. Mullis提出了PCR技術的構想， 1985年，他們在Science發表了遲蠢握相關的論文。論文由Mullis的同事Randall K. Saiki領銜發表，1988年Saiki等分離純化了Taq DNA聚合酶，並將其應用於PCR反應，使PCR變得更加簡單、易行和穩定，隨後PCR技術迎來了蓬勃發展的時期。PCR根據其分析精度，大致經歷了以下三個階段：（I）終點PCR：定性分析（II）定量PCR：相對定量（III）數字PCR：絕對定量

早期PCR主要用於定性分析，根據反應終點產物的有或無檢測靶標序列存在與否，這種PCR可以稱為終點PCR，在基因鑒定、病原核酸檢測等領域具有廣泛應用。

1990年，Simmonds等就通過對終點產物的梯度稀釋對HCV、HIV等病原體進行了粗略的拷貝數鑒定，這可能是最早的定量PCR研究。不過需要澄清一下，這里所說的定量PCR還不是指熒光定量PCR，那時還沒有將熒光物質用於PCR產物的監控。直到1992年，羅氏公司的R Higuchi等在Nature發表論文，介紹了將溴化乙錠（EB）用於PCR產物動態監控的方法，這可能是最早的熒光定量PCR技術了。1996年，ABi公司公布了基於Taqman探針的qPCR技術。1997年，Wittwer等比較了（i）基於雙鏈特異性染料SYBR Green I（ii）基於5』-核酸酶和雙標探針（iii）基於Cy5的分子信標的qPCR的特點。這些研究為後來qPCR的廣泛應用奠定了基礎。

一般，人們習慣把qPCR分為相對定量和絕對定量，不過本質上來說，qPCR只能用於相對定量，絕對定量的實現往往需要藉助「外力」。 PCR擴增是一種指數擴增，理想狀態下，產物濃度與起始濃度存在如下關系：N T = N 0 ×2 n （N 0 代表起始濃度，N T 代表終點濃度，n代表循環數），對公式兩邊取以對數可得：log N T = logN 0 + n×log2（log代表以自然常數e為底的對數），如果我們把PCR終點的判斷信號固定成一個統一的值（即qPCR中的熒光閾值），那麼循環數與起始濃度的對數就成了線性關系，這就是qPCR相對定量的基本原理。不過有兩個因素：（1）人的肉眼無法准確的判斷PCR終點信號，於是出現了特殊的設備—熒光PCR儀；（2）不同的靶標基因的擴增效率不同，因此無法直接比較，因此催生了 ∆∆ Ct法。

真正的絕對定量PCR稱為數字PCR（dPCR，1999年Kinzler等首次提出數字PCR的概念），它是在終點PCR和極限稀釋的基礎上通過泊松分布計算得出拷貝數的絕對定量方法。在Simmonds等的研究中，他們通過將DNA分子稀釋到單拷貝，然後根據PCR的終點信號和泊松分布規律，計算了靶標基因的分子數目，不過他們沒有進一步發展該技術，很長一段時間內該技術都是以分子計數的特點應用的。dPCR一方面因受到qPCR的長期壓制，另一方面受到檢測儀器的限制，直到2006年以後才逐漸顯示出技術復甦的景象。

1993年，Zachar等在《核酸研究》上介紹了利用PCR對靶標基因進行相對定量的數學原理；2001年，Livak KJ等介紹了2 - ∆∆ Ct 法的推導過程，局限性及應用。

當然這些原理很簡單，即使不看論文也很容易理解。因為PCR的指數擴增，當我們把終點的判斷標准固定時，起始模板量高的樣本最先到達，起始模板量低碼慶的樣本消耗更多的循環數，並且每相差一個循環，代表起始濃度相差2倍，即N1/N2 = 2 -(Ct1-Ct2) 。檢測不同樣本時， ∆ Ct可能受樣本量差異的影響，因此引入了內參基因的校正。內參基因，也叫管家基因或者看家基因，一般認為他們在生物體不同時空組織中保持恆定表達，那麼兩個樣本內參基因的 ∆ Ct就代表了樣本量的差異，靶標基因的 ∆ Ct – 內參基因的 ∆ Ct即為靶標基因的真實表達量差異，這就是2 - ∆∆ Ct 法。

但檔皮是有幾個問題需要注意：（1）PCR並非全程都是指數增長期，比較必須在對數擴增期進行（2）一般默認對數增長期擴增效率是100%，這並不嚴謹，尤其是一些擴增困難的模板，效率可能與100%差異很大，縱向分析某基因的表達量（如基因A在不同生產階段/不同組織的表達量）時，仍使用2 - ∆∆ Ct 可能並不太准確（3）不同靶標基因的擴增效率是不同的，因此橫向比較不同靶標基因時，可能造成較大的誤差。

鑒於此，我們在設計引物時，應該盡可能使靶標的長度、GC%、Tm保持接近，從而保證相近的擴增效率。 PrimerBank 和 qPrimerDB 分別是國外和國內比較優秀的qPCR引物檢索網站，收錄了大量物種的qPCR引物數據，具有一定參考價值。此外，Pfaffl等(2001)，Rao(2013)等對2 - ∆∆ Ct 法進行了一些校正，採用的方法主要就是通過對同一模板梯度稀釋進行擴增效率校正，具有一定參考意義。

qPCR絕對定量有兩種方法：（1）先獲得一個拷貝數已知的參照基因，再獲得靶標基因與該參照的比值，然後根據已知值獲得檢測樣本的確切數目，從這個角度看絕對定量就是藉助了「拷貝數已知」這一外力的相對定量。1990年，Gilliland等就描述了這一原理。（2）Simmonds等報道的方法，將DNA模板做極限稀釋，一直到PCR體系中僅含有一個模板分子，此時只需要乘以稀釋倍數就可以得到樣本中靶標基因的拷貝數。這一方法是dPCR的技術原型，在實際操作中很有困難，首先需要很多稀釋梯度，其次普通的10-20uL體系中僅含有一個模板分子經常很難擴增成功。

絕對定量最廣泛的應用是分子計數，如RNA分子數的精確測定，DNA基因組上的基因拷貝數鑒定等。Southern雜交法是外源基因拷貝數鑒定使用最廣泛的方法，但隨著qPCR技術的不斷發展，基於qPCR絕對定量的拷貝數鑒定的報道逐漸增多，並且大量研究表明qPCR方法與Southern雜交得到的結果基本一致甚至更加精確。Song等(2002)利用qRT-PCR估計了轉基因玉米愈傷組織和植物中的轉基因拷貝數，該研究還使用Southern雜交重新測量了玉米愈傷組織和植物中的「精確」轉基因拷貝數，結果qRT-PCR的測量結果與「精確」結果有較高相關性，因此，他們認為 qRT-PCR可以作為一種評估轉基因玉米拷貝數的有效手段。

拷貝數鑒定的關鍵是獲得一個拷貝數已知的標准品，質粒容易提取和純化，因此常用於構建絕對定量的標准品。把攜帶靶標基因的重組質粒提純到極高的純度，精確測定其核酸濃度，根據公式：N = 6.02 × 10 23 (/mol) × M DNA (g) / (DNA length(bp) × 650(g/mol/bp)) 即可計算出標准品拷貝數，式中N代表分子數目，M DNA 代表質粒重量。以此標准品繪制logN與Ct的標准曲線，然後根據靶標基因的Ct值即可反推出靶標基因的精確個數。同時我們要從基因組上選擇一個基因拷貝時已知的參照基因，按同樣方式繪制標准曲線、進行分子計數，然後測定統一樣本中把靶標基因與參照基因的分子數，帶入上述公式即可得到靶標基因的實際拷貝數。一般，應該選擇基因組上拷貝數較低，物種內保守性極高的基因作為參照基因。

拷貝數鑒定具有多種形式，雙標准曲線並不是必需的，如果能夠確認靶標基因與參照基因的擴增效率都接近100%，也可使用2 - ∆∆ Ct 法測量靶標基因的拷貝數，林維石等(2013)就通過該方法得到了與Southern雜交一致的拷貝數鑒定結果。

基因分型的方法有很多，Landegren等(1998)在報道中綜述了多種用於基因分型的技術方法，其中發展到現在應用最為廣泛的就是qPCR法和測序法。測序法最為准確，並且能夠發現新基因型，是基因分型或SNP檢測的金標准，但它比較慢，且操作比較繁瑣。qPCR檢測操作簡單且速度極快，目前有十分廣泛的應用。

qPCR法基因分型的基本原理是：3』-末端不匹配的引物無法正常擴增靶標基因。1989年，Wu等和Newton等先後報道了ASPCR法和法用於檢測等位基因，這種方法容易理解，假設已知SNP位點為A/T，如果3』-A引物PCR產物產生終點信號可判斷為A基因型，3』-T引物產生終點信號為T基因型，兩種引物均產生信號即為雜合型。1995年，Livak等報道了利用不同熒游標記的探針檢測SNP的方法，這種方法中，分別針對兩種基因型設計兩條不同熒游標記的探針，並設置純和基因型的對照，隨著PCR擴增如果熒光信號靠近A參照代表A基因型，靠近B參照代表B基因型，如果位於A和B之間則為雜合型（如下圖）。

2003年，Papp等報道了一種基於高解析度溶解曲線的SNP分型方法，這種方法也是基於3』-末端不匹配的引物，A基因型設計正常長度的引物，B基因型則在引物5』端添加10-15bp的高GC序列，經過PCR擴增後，不同基因型產物的Tm就會發生變化，依賴於qPCR儀的高解析度溶解曲線，可以快速區分基因型。

1995年以後，qPCR相關的研究論文數量呈指數式增長，成為分子生物學最熱門的領域之一。近年來，隨著分子診斷行業的崛起，qPCR在醫療領域發揮著越來越重要的作用。qPCR在快速發展的同時，也產生了一些問題，如判斷標准不一致，檢測精確度沒有統一標准，RNA檢測假陽性較嚴重等。2009年，多個科研院所及醫療單位合作發布了qPCR的 MIQE指南 ，該指南規范了qPCR的常用術語，如Ct應稱為Cq，RT-PCR應寫作RT-qPCR等，並對分析的敏感性、特異性、精度等進行了規范性要求，此外指南還對樣本處理、核酸提取、逆轉錄、qPCR甚至數據分析都作了詳盡的規范。該指南由9部分組成，共85個參數，以確保以qPCR實驗的實用性、准確性、正確性和可重復性。雖然該指南已經有些年份，但遵守這些規范能夠讓你的研究更易重復，也有助於審稿人和編輯快速評估你的稿件。

註：指南的內容和附表可以在這里獲取： http://rdml.org/miqe.html

參考文獻
[1] Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985;230(4732):1350‐1354. doi:10.1126/science.2999980
[2] Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988;239(4839):487‐491. doi:10.1126/science.2448875
[3] Simmonds P, Balfe P, Peutherer JF, et al. Human immunodeficiency virus-infected indivials contain provirus in small numbers of peripheral mononuclear cells and at low numbers. J Virol. 1990;64(2):864‐872.
[4] Simmonds P, Zhang LQ, Watson HG, et al. Hepatitis C quantification and sequencing in blood procts, haemophiliacs, and drug users. Lancet. 1990;336(8729):1469‐1472. doi:10.1016/0140-6736(90)93179-s
[5] Higuchi, R et al. 「Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.」 Bio/technology (Nature Publishing Company) vol. 10,4 (1992): 413-7. doi:10.1038/nbt0492-413
[6] Wittwer CT, Ririe KM, Andrew RV, et al. The LightCycler: a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control. Biotechniques. 1997;22(1):176‐181. doi:10.2144/97221pf02
[7] Zachar V, Thomas RA, Goustin AS. Absolute quantification of target DNA: a simple competitive PCR for efficient analysis of multiple samples. Nucleic Acids Res. 1993;21(8):2017‐2018. doi:10.1093/nar/21.8.2017
[8] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402‐408. doi:10.1006/meth.2001.1262
[9] Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
[10] Rao X, Huang X, Zhou Z, Lin X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 2013;3(3):71‐85.
[11] Gilliland G, Perrin S, Blanchard K, Bunn HF. Analysis of cytokine mRNA and DNA: detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990;87(7):2725‐2729. doi:10.1073/pnas.87.7.2725
[12] Song P, Cai C, Skokut M, et al. Quantitative real-time PCR as a screening tool for estimating transgene number in WHISKERS™-derived transgenic maize[J]. Plant Cell Reports, 2002, 20(10): 948-954. doi: 10.1007/s00299-001-0432-x
[13] 林維石等：利用實時熒光定量比較Ct法檢測轉基因小鼠外源基因拷貝數[J]. 生物技術通訊, 2013, 4(24): 497-500. doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2013.04.012
[14] Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Wallace RB. Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989;86(8):2757‐2760. doi:10.1073/pnas.86.8.2757
[15] Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, et al. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 1989;17(7):2503‐2516. doi:10.1093/nar/17.7.2503
[16] Huang MM, Arnheim N, Goodman MF. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 1992;20(17):4567‐4573. doi:10.1093/nar/20.17.4567
[17] Livak KJ, Marmaro J, Todd JA. Towards fully automated genome-wide polymorphism screening. Nat Genet. 1995;9(4):341‐342. doi:10.1038/ng0495-341
[18] Landegren U, Nilsson M, Kwok P Y. Reading bits of genetic information: methods for single-nucleotide polymorphism analysis[J]. Genome research, 1998, 8(8): 769-776. doi:10.1101/gr.8.8.769
[19] Papp AC, Pinsonneault JK, Cooke G, Sadée W. Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques. 2003;34(5):1068‐1072. doi:10.2144/03345dd03

⑦ 相對定量和絕對定量有什麼區別

一、目的不同

1、相對定量：是測定目的基因在兩個或多個樣本中的猛歷改含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數。

2、絕對定量PCR：是一種在DNA擴增反應中，以熒光染劑偵測每次聚合酶鏈鎖反應（PCR）循環後產物總量的方法技術

二、原枝判理不同

1、相對定量：利用CT值與起始DNA濃度的對爛蠢數成反比的數學關系，來計算不同樣本之間的相對百分比。

2、絕對定量PCR：是利用熒光信號的變化，實時檢測PCR擴增反應中每次循環擴增產物量的變化，通過循環閾值和標准曲線的分析對標本中起始模板拷貝數進行定量分析。

三、標准曲線不同

1、相對定量：可以做標准曲線，也可以不做標准曲線。

2、絕對定量PCR：實驗必須使用已知拷貝數的絕對標准品，必須做標准曲線。

⑧ 定量研究方法主要包括什麼方法

1、調查法

調查法是一種古老的研究方法，是指為了達到設想的目的，制定某一計劃全面或比較全面地收集研究對象的某一方面情況的各種材料，並作出分析、綜合，得到某一結論的研究方法。

2、相關法

相關法是指經由使用相關系數而探求變數間關系的研究方法。相關研究的主要目的，是在確定變數之間關系的程度與方向。變數關系的程度，有完全相關、高相關、中等相關、低相關或零相關等；而變數關系的方向有正相關和負相關等。

3、實驗法

實驗法是指操縱一個或一個以上的變數，並且控制研究環境，藉此衡量自變數與因變數間的因果關系的研究方法。實驗法有兩種，一種是自然實驗法，另一種是實驗室實驗法。

(8)絕對定量的檢測方法有哪些擴展閱讀：

定量研究方法的測定尺度及特徵：

1、名義尺度

所使用的數值，用於表現它是否屬於同一個人或物。

2、順序尺度

所使用的數值的大小，是與研究對象的特定順序相對應的。

3、間距尺度

所使用的數值，不僅表示測定對象所具有的量的多少，還表示它們大小的程度即間隔的大小。

4、比例尺度

其意義是絕對的，即它有著含義為「無」量的原點0。長度、重量、時間等都是比例尺度測定的范圍。比例尺度測定值的差和比都是可以比較的。

參考資料來源：網路-定量研究

⑨ 定量檢測是用得什麼檢測方法

不能一概而論的，要看具體是什麼物質。
如果是金屬離子，通常可以用絡合滴定法、比濁法、沉澱法和原子吸收光譜法等。
如果是低沸點有機物，則是氣相色譜法，可以是歸一法、內標法或者外標法定量。
如果是分子稍大的有機物，可以用液相色譜法，同樣是歸一法、內標法或者外標法定量。