酪蛋白酶活性檢測方法

1. 蛋白酶的酶活力測定實驗報告後的問題.......求高人解答！！！！急！！！！！

一、在本實驗中的對照組是為了證明在酸性條件下，胰蛋白酶無法催化酪蛋白水解；空白對照是要排除蒸餾水能與Folin試劑產生藍色這種可能的存在。

二、稀釋的酶溶液不能長期使用。因為酶的活性並不能長期保持，放置時間過長會導致酶活性喪失而引起較大實驗誤差，甚至無法完成實驗。賀舉

三、

胰蛋白酶一定要剛提取的新鮮酶；

要在酶的最適溫中拍殲度40℃下反應；

要在酶的最適PH為7.5調節下反應；

催化反應的時間控制精確；

向1號試管加入三氯賣沖醋酸時要快；

加入各種葯品的量要精確，特別是酶；

2. 3.國際酶活力單位與習慣酶活力單位的區別是什麼

酶活力：酶催化某一化學反應的能力，用單位時間內產物的增量或底物的減少量表示。
酶活力單位：酶催化能力大小的量度
國際單位（IU）：在規定條件下每分鍾內催化1μmoL 底物轉化的酶量 為一個酶單位，1μmoL變化量 / 分鍾
Katal（Kat）：在最適條件下，每秒鍾內轉化1moL底物所需的酶量，1moL變化量/ 秒
習慣單位（U）：底物(或產物)變化量 / 單位時間。
酶的比活力：每毫克蛋白質所含的酶活力單位數，酶純度的量度
實驗方法
Folin-酚比色法測定酪氨酸含量：在鹼性條件下，酪氨酸可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍色（生成鉬藍和鎢藍化合物），藍色的深淺與酪氨酸的含量成正比。
凱氏定氮法測蛋白質含量：理論基礎是蛋白質中的含氮量通常占其總質量的16%左右(12%~19%),因此，通過測定物質中的稿鄭含氮量便可估算出物質中的總蛋白質含量(假設測定物質中的氮全來自蛋白質)，即: 蛋白質含量=含氮量/16%。
解析：
（1）1ml酶液中猛敬仿蛋白的含量及活力單位。
由「稱取25mg的蛋白酶粉配製成25mL酶液」可知酶液的濃度為1mg/mL；
由「另取2ml酶液，用凱氏定氮法測得蛋白氮為0.2mg」可知1ml酶液中蛋白氮的含量為0.2÷2=0.1mg;
根據凱氏定氮法測蛋白質含量的理論依據：蛋白質含量＝蛋白氮含量×6.25（即蛋白質平均含N量為16％），可枝纖計算出：
1ml酶液中蛋白含量 = 0.1mg×6.25 = 0.625 mg
由「取出0.1ml，以酪蛋白為底物用Folin-酚比色法測定酶活力，結果表明每小時產生1500μg酪氨酸」，根據酶活力單位的定義，可計算出：
1ml酶液中酶活力單位=1500ug÷60min÷0.1ml=250U
（2）酶比活力。
由（1）的計算結果可知，1ml酶液中蛋白質含量為0.625mg，酶活力單位為250U，則：
酶的比活力為250U÷0.625mg=400U/mg蛋白
（3）1g酶制劑的總蛋白含量及總活力。
由（1）知酶液濃度為1mL酶液(1mg/mL)中蛋白質的含量為0.625mg，則：
1g酶制劑總蛋白量=0.625mg×1000=625mg
總活力=400×625=2.5×105U

3. 測定鹼性蛋白酶活有哪些方法

鹼性蛋白酶酶活力檢測方法

酶活力是指酶催化某些化學反應的能力。酶活力的大小可以用在一定條件下它所催化的某一化學反應的速度來表示。測定酶活力實際就是測定被酶所催化的化學反應的速度。酶促反應的速度可以用單位時間內反應底物的減少量或產物的增加量來表示，為了靈敏起見，通常是測定單位時間內產物的生成量。由於酶促反應速度可隨時間的推移而逐漸降低其增加值，所以，為了正確測得酶活力，就必須測定酶促反應的初速度。

鹼性蛋白酶酶活測定原理 福林法原理

鹼性蛋白酶在鹼性條件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸為含有酚羥基的氨基酸，可與福林試劑（Folin)（磷鎢酸與磷鉬酸的混合物）發生福林酚反應。（福林酚反應：福林試劑在鹼性條件下極其不穩定，容易定量地被酚類化合物還原，生成鎢藍和鉬藍的混合物，而呈現出不同深淺的藍色。）利用比色法即可測定酪氨酸的生成量，用鹼性蛋白酶在單位時間內水解酪蛋白產生的酪氨酸的量來表示酶活力，以此計算其酶活力。

酶活力測定實驗步驟

酶液制備：精確稱取干酶粉1g（±0.001），加入10mL緩沖液（2.2.5），在小燒杯中溶解，並用玻璃棒攪拌，靜置片刻後，將上層液小心傾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量緩沖液，如此反復攪拌溶解4次，最後全部移入100mL容量瓶中。用緩沖液定容至刻度，充分搖勻，用四層紗布過濾。吸取濾液5mL，移入100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，所得液位稀釋2000倍的酶液。（稀釋倍數具體要看待測酶樣品的酶活）

酶活定義

鹼性蛋白酶活力單位的定義：1克鹼性蛋白酶粉在pH10，40℃的條件下，每分鍾水解酪蛋白能產生1微克酪氨酸，定為一個酶活力單位。

酶活力測定注意事項

1、酶反應的溫度、pH和時間對被水解的肽鍵數量有直接的影響，因此必須嚴格控制。

2、用三氯醋酸終止反應後，過濾反應混合物所得的濾液必須是澄清的。

3、因為Folin試劑對酸性環境比較敏感，容易發生變化，因此在測定時有順序的規定，需要先加入碳酸鈉溶液形成一個鹼性環境，之後再加入Folin試劑，使其能正常發揮作用

4. 為什麼在測酶活時,酪蛋白和酶的反應時間必須精確

保證在酶的穩定反應狀況之下獲取可比數據。
測酶活力尺畝常用其催化某一化學反應的能力來表示。在酶活力測定中酪蛋白和酶的反應時間要控制嚴格一致，使之槐困啟均處於線性范圍和穩定的初速度之中，以保持兩組數據之間鉛如穩定的相關性和可比性。
酶活力也稱為酶活性，測量酶活力的原因是測定酶催化一定化學反應的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學反應的速度來表示，酶催化反應速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。測定酶活力實際就是測定酶促反應的速度。

5. 測蛋白酶活性為什麼很多都用casein做底物

酪蛋白是哺乳動物包括母牛，羊和人奶中的主要蛋白質。牛奶的蛋白質，主要以酪蛋白(Casein)為主，人奶以白蛋白為主。酪蛋白是一種大型、堅硬、緻密、極困難消化分解的凝乳(curds)。
酪蛋白是乳中含量最高的蛋白質，目前主要作為食品原料或微生物培養基使用，利用蛋白質酶促水解技術製得的酪蛋白磷酸肽具有防止礦物質流失、預防齲齒，防治骨質疏鬆與佝僂病，促進動物體外受精，調節血壓，治療缺鐵性貧血、缺鎂性神經炎等多種生理功效，尤其是其促進常量元素(Ca、Mg)與微量元素(Fe、Zn、Cu、Cr、Ni、Co、Mn、Se)高效吸收的功能特性使其具有「礦物質載體」的美譽，它可以和金屬離子，特別是鈣離子結合形成可溶性復合物，一方面有效避免了鈣在小腸中性或微鹼性環境中形成沉澱，另一方面還可在沒有VD參與的條件下使鈣被腸壁細胞吸收，所以CPPs是最有效的促鈣吸收因子之一，它的發現為補鈣製品的研發提供了一種新方法。目前，CPPs已被公認為國內外研究最多、最深入，應用領域極為廣泛，且極具開發價值的一類分子結構與生物功能間有明確對應關系的活性多肽物質。
酪蛋白為非結晶、非吸潮性物質，常溫下在水中可溶解0.8-1.2%，微溶於25℃水和有機溶劑，溶於稀鹼和濃酸中，能吸收水分，當浸入水中則迅速膨脹，但分子不結合。
物化性質：
乾酪素是等電點為pH4.6的兩性蛋白質。在牛奶中以磷酸二鈣、磷酸三鈣或兩者的復合物形式存在，構造極坦旦為復雜，直到現在沒有完全確定的分子式，分子量大約為57000-375000。乾酪素在牛奶中約含3%，約占牛奶蛋白質的80%。純乾酪素為白色、無味、無臭的粒狀固體。相對密度約1.26。不溶於水和有機溶劑。乾酪素能吸收水分，浸於水中，則迅速膨脹，但料子並不結合。
制備方法：(1)新鮮牛奶脫脂，加酸(乳酸、乙酸、鹽酸或硫酸)，將pH調至4.6，使乾酪素微膠粒失去電荷而凝固沉澱。用這種方法得到的乾酪素稱為酸酪蛋白，加酸的種類不同得到的酸酪蛋白卻幾乎毫無區別。酸酪蛋白是白色至淡黃色粉末或顆粒，稍有奶臭和酸味。在水中只是溶脹，若加入氨、鹼及其鹽時，則可分散溶解於水中。可溶於強酸、二乙醇胺、嗎啉、尿素、甲醯胺、熱苯酚和土耳其紅油。(2)將牛奶與粗製凝乳酶作用，形成凝固沉澱物，稱為粗製凝乳酶酪蛋白，呈白色粒狀，幾乎無味無臭，加熱灼燒會產生特有的臭味。凝乳酶酪蛋白比酸酪蛋白的灰分含量高。
用途：酸酪蛋白主要用作塗料的基料，木、紙和布的粘合劑，食品用添加劑等。作為塗料的基料約占總消費的一半，具有優良的耐水性，在顏料中能很好地分散，提高塗料納信拆的均勻性。此外，因流動性好，易於塗裝施工，粗製凝乳酶蛋白主要用於製造塑料鈕扣。酪蛋白鈕扣與其他樹脂鈕扣相比，染色性、加工性、色澤鮮艷性均好，質量洞棗在鈕扣中居中上等。乾酪素與消石灰、氟化鈉、硫酸銅均勻混合，再配入煤油得到酪素膠，是航空工業和木材加工部門使用的一種膠合劑。乾酪素也用於醫葯和生化試劑。

6. 偶氮酪蛋白測蛋白酶活性標曲怎麼設

偶氮酪蛋白測蛋白酶活性標曲這樣設。具體方陵告法是：
1、將虧困粉末狀的底物（2g）放入l20ml燒杯中，加入4ml乙醇或工業甲基化酒精（IMS）。
2、用磁力攪拌器充分混合，打碎所尺空明有的塊狀底物。
3、然後加入96ml磷酸鈉緩沖液(100mM.pH7.0；BufferA)，再次充分攪拌直到底物全部溶解。
4、用玻璃棒驅散任何粘住燒杯邊緣的偶氮酪蛋白，溶解完全的溶液保存於可密封的容器中。
5、加入2滴甲苯以防止微生物的wu染，4C下保存，可以保存數周。

7. 蛋白質磷酸化的蛋白磷酸激酶的純化與活性分析

蛋白磷酸激酶是能催化磷酸基團從磷酸供體轉移到受體蛋白的酶，通常ATP的γ位磷酸(或其它三磷酸核苷)為供體。國際生物化學聯合會根據受體氨基酸的特異性，將蛋白激酶分為以下幾類：①以蛋白乙醇基作為受體的磷酸轉移酶稱為蛋白絲氨酸或蘇氨酸激酶;②以苯基為磷酸受體的磷酸轉移酶稱為蛋白酪氨酸激酶;③以His，Arg或Lys為受體的磷酸轉移酶稱蛋白His激酶;④以Cys殘基作為受體的磷酸轉移酶稱蛋白Cys激酶;⑤以乙醯基作為受體的磷酸轉移酶稱天冬或谷氨醯胺激酶。
前兩類酶最常見，許多蛋白絲/蘇氨酸或酪氨酸激酶已被純化。利用分子生物學技術，已克隆出100多個蛋白激酶的基因。有些已通過測定其核苷酸序列而推出其相應的氨基酸序列。在很多情況下，克隆的酶基因產物氨基酸受體特異性不能被直接測定，一般是通過序列分析與已知特異性的蛋白激酶比較而得出。所有已知的絲/蘇和酪氨酸蛋白激酶都有一個共同的催化結構域(約270個氨基酸)，通過催化結構域的序列同源性比較，可將蛋白酪氨酸激酶家族分成若干亞家族。蛋白絲/蘇氨酸激酶家族較酪氨酸激酶家族大。此外，還有許多有關His，Lys和Arg特異性磷酸化酶活性的報道，但這些酶未被純化，其分子結構也不清楚。(一)蛋白磷酸激酶的純化
蛋白激酶的純化分微量純化和大量純化兩種，前者通常應用在特殊條件下培養的細胞，後者一般應用於特殊的組織器官。微量純化的優點是克隆化的細胞株具有均一的細胞類型並處於同步的細胞周期，細胞內成分可被放射性同位素特異標記，在細胞培養時加特殊因素可研究細胞內某些感興趣的途徑。缺點是原料少，純化出的蛋白量有限。 ，通常選用惰性系統，如Pharmacia的FPLC系統。該系統的優點是具有很大的內在惰性，並具有保持大分子生物活性的特點。該系統在一個單元內含有單一的硬體，可在冷室和室溫操作。此外，可採用快速的梯度(40～45分鍾)形式和較廣適用范圍的高效凝膠和柱系統。這是因為在此條件下多數蛋白質不與樹脂結合，包括能使激酶失活的磷酸酶。然而，許多激酶盡管其表現等電點≤5.5，但在中性條件下仍可與MonoS結合，這可能是由於其磺酸基與ATP或底物分子結構有些類似。大體積抽提物可用泵直接進樣，並進行連續兩次的離子交換分離。FPLC預裝的凝膠排阻柱可在30分鍾內完成分離，較傳統凝膠快得多。但由於柱填料粒度小，上樣體積不超過200μl，樣品量不超過5～10mg，純化量較小有些性質難以鑒定，因而需多次純化。Pharmacia引入一種新的介質(Sephacryl HR)較傳統的超細膠流速快5倍，這些凝膠在很大程度上減小了凝膠過濾色譜的時間。在完成親和純化後，酶的純度可用SDS-PAGE檢測並定量測定其比活性。(二)蛋白磷酸激酶的活性分析蛋白激酶活性分析分為兩步：①末端標記的三磷酸核苷核供體(通常是ATP，有時用GTP)中的磷酸基團轉移到蛋白質或肽底物上;②將磷酸化的底物分離出並進行定量分析。前者通常在溶液中進行，酶和底物均在液相中。後者為了去除游離的標記核苷酸，通常需要用三氯醋酸沉澱、SDS-PAGE分離或使標記底物結合於纖維素膜上。有時可將酶或底物固定於固相載體上，如蛋白質混合物經SDS-PAGE後轉移到硝酸纖維素膜上，然後封閉，放入含有酶和標記ATP的溶液中。或者更進一步，設計一個蛋白激酶分析系統(酶活性的原位分析)，將蛋白激酶和它的底物均固定於硝酸纖維素膜上，這一方法可與標準的液相分析方法達到相等的靈敏度和線性范圍。其分析原理是含有蛋白激酶活性的樣品先固定於硝酸纖維素膜上(點滴或真空抽吸)，然後將濾膜浸入合適的蛋白底物溶液中，底物蛋白質與剩餘的膜結合位點結合，然後加入同位素標記的ATP，作用一定時間後洗去膜上未反應的ATP並終止反應，參入物經放射自顯影或液閃計數定量，與膜結合的酶和底物均具有一定的運動性，兩者反應的定量值代表磷酸化的程度。以酪蛋白激酶Ⅱ的活性測定方法為例：試劑：緩沖液A25mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，100mmol/LNaCl，pH8.0緩沖液B25mmol/L Tris，1mmol/LEDTA，200mmol/L NaCl，10%甘油(V/V)，1mmol/L DTT，pH8.0酪蛋白激酶Ⅱ底物水解或部分脫磷酸的酪蛋白10mg/ml溶解於緩沖液A中。酪蛋白激酶Ⅱ反應混合物25mmol/L Tris，pH8.5，100mmol/L NaCl，10mmol/LMgCl2，1mmol/L DTT，0.1μmol/L〔V-32P〕ATP(100Ci/mmol)操作步驟：
1.剪一適當大小的硝酸纖維素膜並劃成25px大小的方格;2.用緩沖液A浸濕膜並放於一用同樣緩沖液浸濕的濾紙上，使膜平坦;3.用緩沖液B(含1mg/ml牛血清白蛋白)將樣品稀釋到合適的濃度，膜上每個點所加的樣品其激酶活性在0.5～50pmol單位(1pmol單位代表每分鍾轉移1pmol 32P的酶量)，當酶比活性在1μmol/min·mg-1時則每個點應加純酶0.5～50ng; ，待液滴消失後將膜面對含有緩沖液A(包括1～10mg/ml的底物)的Parafilm封口膜(貼於玻璃平板上)，在濕潤環境中23℃作用30分鍾。大片膜可密封於塑料袋中;5.在100ml緩沖液A中洗膜並置於一新的Parafilm膜上(加有反應混合物溶液25μl/cm2)，23℃作用5～30分鍾;6.用緩沖液A 100ml洗膜4次，空氣乾燥後進行放射自顯影。或切成方塊進行液閃計數定量。
該方法在應用時最常見的問題是硝酸纖維素膜過載(指總蛋白或酶活力單位)。硝酸纖維素膜結合BSA的線性范圍可達50μg/cm2(相當於每斑點5μg)，而結合容量可達500μg/cm2，如果樣品本身造成蛋白質超載，則應降低稀釋液中的BSA濃度。同時應注意不要加過量的酶，因為超過50pM單位即超過了該方法的線性范圍，並可能影響硝酸纖維素膜鄰近斑點的檢測。該方法用於其它蛋白激酶檢測時應適當變換測定條件。因蛋白激酶活性的斑點印跡方法與標準的液相方法在靈敏度、檢測范圍、線性等方面相當，所以可以代替後者進行常規檢測。也在天然凝膠電泳和轉移電泳後分析蛋白激酶活性的分布，可用於分析酶在不同發育階段各組織表達的變化、cDNA克隆分析和突變體分析。

8. 什麼是酶活力測定的終點法此法有何優缺點

酶活力測定常用的方法有終點法和動力學方法兩類。
終點法
測定完成一定量反應所需的時間，如α-澱粉酶的活力測定。因為碘對澱粉呈現藍色反應，當澱粉溶液中加入澱粉酶後，碘的藍色反應消失而呈現紅棕色；碘對澱粉顏色反應消失的時間可表示澱粉酶活力的大小。碘對澱粉顏色反應消失花的時間越短，表示酶的活力越高。
動力學方法
測定一定時間內所起的化學反應量。
①比色法 如果酶反應的產物可與特定的化學試劑反應而生成穩定的有色溶液，且生成顏色的深淺與產物的濃度在一定的范圍內有線性關系可用此法。如蛋白酶的活力測定：蛋白酶可水解酪蛋白，產生的酪氨酸可與福林試劑反應生成穩定的藍色化合物，在一定的濃度范圍內，所生成藍色化合物顏色的深淺與酪氨酸的量之間有線性關系，可用於定量測定。
②量氣法 主要用於有氣體產生的酶促反應。如氨基酸脫羧酶、脲酶的活力測定。產生的二氧化碳量可用特製的儀器如瓦氏呼吸儀測定之。根據氣體變化和時間的關系，即可求得酶反應的速度。
③滴定法 如果產物之一是自由的酸性物質可用此法。如脂肪酶催化脂肪水解，脂肪酸的增加量代表脂肪酶的活力。
④分光光度法 利用底物和產物光吸收性質的不同，可直接測定反應混合物中底物的減少量或產物的增加量。幾乎所有的氧化還原酶都使用該法測定。如還原型輔酶Ⅰ(NADH2)和輔酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在該波長下無吸收，脫氫酶類可用該法測定。該法測定迅速簡便，自動掃描分光光度計的使用對酶活力的快速准確的測定提供的極大的方便。
⑤放射測量法 是酶活力測定中較常用的一種方法。一般用放射性同位素標記底物，在反應進行到一定程度時，分離帶放射性同位素標記的產物並進行測定，就可測知反應進行的速度。常用的同位素有3H，14C，32P，35S，131I等。如脲酶，將底物尿素用14C標記，產生的帶放射性的CO2氣體可用標准計數法進行測定。
⑥酶偶聯分析 某些酶本身沒有合適的測定方法，但可偶聯另一個酶反應進行測定。其基本方法為：應用某一高度專一性的工具酶使被測酶反應能繼續進行到某一可直接連續且簡便准確測定階段的方法。如：被測E1反應的產物B是某一脫氫酶(E2)的底物，向反應體系中加入足量的脫氫酶和NAD+或NADPH+，使反應由A經B繼續進行到C，然後測定NADH或NADPH的特徵吸收光譜的變化，即可間接地測定E1的活力大小。如己糖激酶的活力測定即應用這一方法。注意：使用該法要求指示酶必須很純，且具有高度的專一性，以免干擾反應而給測定帶來麻煩。

9. 怎樣檢測蛋白酶活性

在適宜條件下(溫度,pH),加入蛋清,若消失則有活性.

10. 如何測定微生物酶活性

看是什麼酶了，比如我們做過的蛋白酶就是：
樣品管處理：吸取0.5%酪蛋白溶液2 mL置於試管中，在40℃水浴中預熱5分鍾後加入同樣條件下預熱好的酶液1 mL，立即計時。反應10分鍾後，由水浴取出，並立即加入10%三氯乙酸溶液3 mL，室溫下放置15分鍾後，4℃、6000轉/分離心10分鍾。
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對照管處理：同時另作一對照管，即取酶液1 mL，先加入3 mL10%的三氯乙酸溶液，然後再加入0.5%的酪蛋白溶液2 mL，40℃水浴中保溫10分鍾，室溫放置15分鍾，4℃、6000轉/分離心10分鍾。
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顯色：取3支試管，編號。分別加入樣品處理及對照處理上清液和水各1 mL，然後各加入0.55mol/L的碳酸鈉溶液5 mL，混勻，立即加入Folin試劑1 mL，立即混勻，40℃水浴中顯色15分鍾。
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吸光度測定：以加水的那一管作為空白，測定樣品及對照在680nm下的吸光度A680。

希望有用