免疫學檢測方法

❶ 腫瘤免疫的檢測

腫瘤的免疫學檢測的主要目的是對腫瘤進行免疫學診斷和評估宿 主的免疫功能狀態。 （一）檢測腫瘤抗原
這是目前最常用的腫瘤免疫學診斷法，如AFP的檢測對原發性肝細胞性肝癌有診斷價值，CFA的檢測有助於診斷直腸癌、胰腺癌等。但對於人類腫瘤特異性抗原的檢測進展不大。
（二）檢測腫瘤抗體
例如在黑色素瘤患者血清中可查到抗自身黑色素瘤抗體，在鼻咽癌和Burkitt淋巴瘤患者的血清中檢測出EB病毒的抗體，且抗體水平的變化與病情的發展和恢復有關。
（三）腫瘤的放射免疫顯像診斷
將放射性核素如131Ⅰ與抗腫瘤單抗結合後，從靜脈注入體內或腔內注射均可將放射性核素導向腫瘤的所在部位，用γ照相機可以顯示清晰的腫瘤影像，已用於臨床診斷，是一種有較好前景的腫瘤診斷新技術。 腫瘤的免疫治療是以激發和增強機體的免疫功能，以達到控制和殺滅腫瘤細胞的目的。免疫療法只能清除少量的，播散的腫瘤細胞，對於晚期的實體腫瘤療效有限。故常將其作為一種輔助療法與手術、化療、放療等常規療法聯合應用。先用常規療法清掃大量的腫瘤細胞後，再用免疫療法清除殘存的腫瘤細胞，可提高腫瘤治療的效果。已經建立了多種免疫方法，並在動物實驗中取得了良好療效，但當臨床應用時受到的影響因素很多，其臨床治療的效果尚需進一步提高。
腫瘤免疫治療的方法有以下幾種： 腫瘤的主動免疫治療是指給機體輸入具有抗原性的瘤苗，刺激機體免疫系統產生抗腫瘤免疫以治療腫瘤的方法。該法應用的前提是腫瘤抗原能刺激機體產生免疫反應。此種方法對地手術後清除微小的轉移瘤灶和隱匿瘤、預防腫瘤轉移和復發有較好的應用效果。
治療用瘤苗有以下幾類：
（一）活瘤苗
由自體或同種腫瘤細胞製成，使用時有一定的危險性，較少用。
（二）減毒或滅活的瘤苗
自體或同種腫瘤細胞經過射線照射，絲裂黴素C，高低溫等處理可消除其致瘤性，保留其免疫原性與佐劑合用，對腫瘤的治療有一定的療效。
（三）異構的瘤苗
自體或同種腫瘤細胞經過碘乙酸鹽，神經氨酸酶等修飾處理增強了其免疫原性，可作疫苗應用。
（四）基因修飾的瘤苗
將某些細胞因子的基因或MHCⅠ類抗原分子的基因，粘附分子如B7基因等轉移入腫瘤細胞後，可降低其致瘤性，增強其免疫原性，這種基因工程化的腫瘤苗在實驗動物研究中，取得了肯定的效果，人體應用的前景尚待評價。
（五）抗獨特型抗體
抗獨特型抗體是抗原的內影像，可以代替腫瘤抗原進行主動免疫。已用於治療B淋巴細胞瘤。 腫瘤的被動免疫治療是指給機體輸注外源的免疫效應物質，由這些外源性效應物質在機體內發揮治療腫瘤作用。主要有以下兩大類：
（一）抗腫瘤導向治療
利用高度特異性的單克隆抗體為載體，將細胞毒性的殺傷分子帶到腫瘤病灶處，可特異地殺傷腫瘤細胞。根據所用的殺傷分子的性質不同，腫瘤的導向治療可分為：①放射免疫治療（radioimmunotherapy），將高能放射性核素與單克隆抗體連接，可將放射性核素帶至瘤灶殺死腫瘤細胞；②抗體導向化學療法（antibody-mediated chemotherapy），抗腫瘤葯物與單抗通過化學交聯組成的史疫偶聯物，可以將葯物導向腫瘤部位，殺傷腫瘤細胞，常用的有氨甲蝶呤（MTX）、阿黴素等；③免疫毒素療法（immunotoxintherapy），將毒素與單克隆抗體相連，制備的免疫毒素對腫瘤細胞有特異性的強殺傷活性。常用的毒素有兩類：一類是植物毒素，包括篦麻籽毒素（RT）、相思子毒素（abrin）、苦瓜毒素（MD）等。另一類是細胞毒素，包括白喉毒素（DT）、綠膿桿菌外毒素（PE）。經過臨床應用，單克隆抗體導向療法取得了一定的治療效果，但其存在的某些問題限制其臨床應用和療效提高。如所用的單克隆抗體多為鼠源單克隆抗體，應用人體後會產生抗鼠源單克隆抗體的抗體，使其不能反復應用影響了其療效。用基因工程的方法，使鼠源抗體人源化可減少這個問題。認為用導向葯物治療實體瘤的效果有限。在腔內腫瘤如膀癌的治療方面，可能有較好的效果。導向葯物在清除轉的小腫瘤灶可能具有較好的治療效果。
（二）過繼免疫療法
過繼免疫療法（adoptive immunotherapy）是取對腫瘤有免疫力的供者淋巴細胞轉輸給腫瘤者，或取患者自身的免疫細胞在體外活化、增殖後，再轉輸入患者體內，使其在患者體內發揮腫瘤作用。過繼免疫療法的效應細胞具有異質性，如CTL、NK細胞、巨噬細胞、淋巴因子激活的殺傷細胞(lymphokine-activatedkillercells,LAK)和腫瘤浸潤性淋巴細胞(tumor-infiltrating lympbocytesTIL)等都在殺傷腫瘤細胞中起作用。LAK細胞是外周血淋巴細胞在體外經過IL-2培養後誘導產生的一類新型殺傷細胞，其殺傷腫瘤細胞不需抗原致敏且無MHC限制性，有人認為LAK細胞主要成分是NK細胞。TIL是從實體腫瘤組織中分離得到的，經體外IL-2培養後可獲得比LAK細胞更強的殺傷活性。CTL是TIL細胞的主要成分。已將LAK細胞，TIL與IL-2合用對臨床治療晚期腫瘤患者，對於某些類型腫瘤患者如黑色素瘤、腎細胞癌確有一定治療效果。

❷ 免疫學檢驗最常用的方法拜託各位了 3Q

以下是幾種常用的免疫學技術： 1．免疫熒光技術 免疫熒光技術是利用熒光素標記的抗體（或抗原）檢測組織、 細胞或血清 中的相應抗原（或抗體）的方法。由於熒光抗體具有安全、 靈敏的特點，因此已 廣泛應用在免疫熒光檢測和流式細胞計數領域。 根據熒光素標記的方式不同，可 分為直標熒光抗體和間標熒光抗體。 間標熒光抗體中一抗並不直接連接熒光素， 而是先將一抗結合到蛋白，然後帶有熒光素的二抗再結合至一抗。 通過二抗的結 合，能將信號進行放大，因此能在一定程度上提高檢測的靈敏度， 但是隨之帶來 的高背景也降低了檢測的特異性。近年來， 隨著熒光素和熒光檢測技術的不斷進 步，熒光檢測的靈敏度已經接近同位素檢測的水平， 直接標記的熒光抗體逐漸取 代間接標記抗體。這些標記了熒光素的抗體直接結合至抗原， 大大提高了檢測的 特異性，使檢測的結果更加准確可靠。熒光檢測技術的發展， 使得免疫熒光技術 在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、 螺旋體感染的疾病，檢查IgM 抗體，做為近期接觸抗原的標志。 利用單克隆熒光直接標記抗體鑒定淋巴細胞的 亞類。通過流式細胞儀，針對細胞表面不同抗原， 可以同時使用多種不同的熒光 抗體，對同一細胞進行多標記染色。 2．放射免疫檢測 放射免疫檢測技術是目前靈敏度最高的檢測技術， 利用放射性同素標記抗 原（或抗體），與相應抗體（或抗原）結合後， 通過測定抗原抗體結合物的放射 性檢測結果。放射性同位素具有pg 級的靈敏度，且利用反復曝光的方法可對痕 量物質進行定量檢測。 但放射性同位素對人體的損傷也限制了該方法的使用。 3．酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 酶聯免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。 該方法是將二抗標記上 酶，抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結合起來， 根據酶作用底物後的 顯色顏色變化來判斷試驗結果，其敏感度可達ng 水平。常見用於標記的酶有辣 根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶（AP）等。 由於酶聯免疫法無需特殊的儀器， 檢測簡單，因此被廣泛應用於疾病檢測。常用的方法有間接法、 夾心法以及BAS －ELISA。間接法是先將待測的蛋白抱被在孔板內， 然後依次加入一抗、標記了 酶的二抗和底物顯色，通過儀器（例如酶標儀）定量檢測抗原。 這種方法操作簡 單但由於高背景而特異性較差。目前已逐漸被夾心法取代。 夾心法利用二種一抗 對目標抗原進行捕獲和固定， 在確保靈敏度的同時大大提高了反應的特異性。近 年來，抗原的定量檢測技術也不斷推陳出新。近年來， 在夾心法ELISA 的基礎上， 開發了多抗原檢測試劑盒， 能同時檢測微量液相樣本中多個抗原含量。這項技術 的應用大大縮短了診斷的時間，提高診斷的可靠性和及時性。 4．免疫金膠體技術 膠體金技術經過30 多年的發展到現在已日趨成熟，該方法是將二抗標記上 膠體金顆粒，利用抗原抗體間的特異性反應， 最終將膠體金標記的二抗吸附於滲 濾膜上，此方法簡單，快速，廣泛應用於臨床篩查。

❸ 免疫檢測的基礎知識

免疫檢測的基礎知識匯總2017

ELISA是一種免疫測定。免疫測定(immunoassay，IA)是應用免疫學技術測定標本的方法。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反應檢測體液中的抗體或抗原性物質。下面是我為大家帶來的免疫檢測的基礎知識，歡迎閱讀。

1抗原

抗原是能在機體中引起特異性免疫應答的物質。抗原進入機體後，可刺激機體產生抗體和引起細胞免疫。在免疫測定中，抗原是指能與抗體結合的物質。能在機體中引起抗體產生的抗原多為分子量大於5000的蛋白質，例如乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、甲胎蛋白(AFP)等。小分子化合物在與大分子蛋白質結合後能引起機體產生特異性抗體的，稱為半抗原(hapten)。例如某些激素、葯物等。抗原的反應性取決於抗原決定簇(antigenic determinant)，或稱為表位(epitope)。一個抗原分子可帶有不同的決定簇，例如中可帶有等決定簇。

2抗體

2.1抗體的結構

抗體是能與抗原特異性結合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關的Ig主要為IgG和IgM。Ig由兩個輕鏈(L)和兩個重鏈(H)的單體組成。Ig的輕鏈是相同的，有κ(kappa)和λ(Lambda)兩種型別。五類Ig的重鏈結構不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ(gamma)鏈和μ(mu)鏈。IgG的結構見圖。

① 木瓜酶裂解部位

② 胃蛋白酶裂解部位

重鏈和輕鏈的N端的氨基酸排列順序

因各種抗體而異，稱為可變區，分別用

VH和VL表示。兩者構成抗體的抗原結合

部位，只與相應的抗原決定簇匹配，發生

特異性結合(見圖)，是抗體專一性結合

抗原的結構基礎。

IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個區段，其中兩個相同的區段稱抗原結合片段(Fab)。每個Fab都保存結合抗原的能力，但只有一個抗原結合位點，是單價的，與抗原結合後不出現凝集或沉澱。另一區段稱Fc段，無抗體活性，但具有IgG特有的抗原性。

IgG可被胃蛋白酶分解為兩個片段，一個Fab雙體，稱F(ab')2，能和兩個相同的抗原結合;另一片段類似Fc，隨後被分解成小分子多肽，無生物活性。

IgM是由五個單體組成的五聚體，含10個重鏈和10個輕鏈，具有10個抗原結合價，由於空間位置的影響，只表現為五個抗原結合價。IgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000。

機體被微生物感染後，先產生IgM抗體，然後產生IgG抗體。經過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊癒後可持續數年之久。

IgM抗體一般為保護性抗體具有免疫性。

因此IgM抗體的測定，對某些傳染病如甲

型肝炎有較高的臨床診斷價值。

右圖為為甲型肝炎病人血清中IgG抗體和

IgM抗體出現的時間和水平。

2.2 抗體的產生

機體受抗原刺激後，B淋巴細胞產生相應的抗體。含有抗體的血清稱為抗血清(antiserum)。每一系B細胞只產生針對某一抗原決定簇的抗體。如將多種抗原或含有多個抗原決定簇的抗原注入機體，則將由多系的B細胞產生相應的多種抗體，這些抗體均存在於免疫血清中。免疫測定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或馬製得。產生抗體的B細胞可在體外與繁殖力強的腫瘤細胞融合成雜交瘤細胞。將單個雜交瘤細胞分離，在體內或體外培養而分泌的抗體單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb或Mab)。單克隆抗體僅針對一種抗原決定簇，具有很高的特異性。單克隆抗體通常用抗原免疫小鼠制備。將免疫的脾細胞(含產生抗體的B細胞)與小鼠腫瘤細胞融合，分離雜交瘤細胞，接種於小鼠腹腔，產生的腹水中含有濃度很高的單克隆抗體。

3抗原抗體反應

3.1可逆性

抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態平衡，其反應式為：Ag+Ab→Ag·Ab抗體的親和力(affinity)是抗原抗體間的固有結合力，可以用平衡常數K表示：K=[Ag·Ab]/[Ag][Ab]Ag·Ab的解離程度與K值有關。高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離後的抗原或抗體均能保持原有的結構和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的IgG抗體僅占總IgG中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱為親和層析純抗體，應用於免疫測定中可得到更好的效果。

3.2最適比例

在恆定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復合物(沉澱)的量見圖1-4。曲線的高峰部分是抗原抗體比例最合適的范圍，稱為等價帶(zone of equivalence)。在等價帶前後分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。如果抗原或抗體極度過剩，則無沉澱物形成，在免疫測定中稱為帶現象(zone phenomenon)。抗體過量稱為前帶(prezone)，抗原地過量稱為後帶(postzone)。在用免疫學方法測定抗原時，應使反應系統中有足夠的抗體量，否則測得的'量會小於實際含量，甚至出現假陰性。

3.3特異性

抗原抗體的結合實質上只發生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由於兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗體(HBcAg)，隨來源於同一病毒，但僅與其相應的抗體結合，而不與另外兩種抗體反應。抗原抗體反應的這種特異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質化合物(例如血清)中測定某一特定的物質，而不需先分離待檢物。

但是這種特異性也不是絕對的。假使兩種化合物有著部分相同的結構，在抗原抗體反應中可出現交叉反應。例如：絨毛膜促性腺激素(hCG)和黃體生成激素(LH)均由α和β兩個亞單位組成，其結構的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的。用hCG免疫動物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG兩種抗體，抗α-hCG抗體將與LH中的α酶位發生交叉反應。在臨床檢驗中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG，只能用於hCG濃度較高的試驗，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發生交叉反應。因此在作為早孕診斷(敏感度應達到0mIu/mlhCG)的實際中必須應用只對hCG特異的抗β-hCG，以避免與其它激素的交叉反應的發生。

3.4敏感性

在測定血清中某一物質的含量時，化學比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應測定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿。標記的免疫測定的敏感度可提高數千倍，達ng/ml水平。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg，其敏感度可達0.1ng/ml。

4免疫測定在臨床檢驗中的應用

由於各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應的抗原，因此免疫測定的應用范圍極廣，在臨床檢驗中可用於測定：

1) 體液中的各種蛋白質，包括含量極少的蛋白質如甲胎蛋白等。

2) 激素，包括小分子量的甾體激素等。

3) 抗生素和葯物。

4) 病原體抗原，HBsAg、HBeAg等。

5) 另外，也可利用純化的抗原檢測標本中的抗體，例如抗-HBs等。

5. 標記的免疫測定

如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體反應後直接測定形成的沉澱或濁度，敏感度可達5~10μg/ml，但在臨床檢驗中，某些待測物在標本中的含量遠低於這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質加以標記，通過測定標記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標記物分別為放射性核素和酶，最後用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉澱物提高數百至數千倍。在標記免疫測定中，一般加入過量的標記試劑以保證與待測物徹底反應。以標記抗體(Ab※)檢測抗原(Ag)為例，反應式如下：Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※

在反應產物中有與Ag結合的Ab※和游離和Ab※，如不將兩者分離而測定標記物，測得的結果將為兩者之和。因此，游離標記物與結合標記物的分離是標記免疫測定中的重要步驟。可採用多種手段，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然後再與標記的抗原或抗體直接反應，結合的標記物被固定在載體上，而游離的標記物留於溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab※除去，結合標記物的測定可在固相上進行。

6. 酶免疫測定

酶免疫測定(enzyme immunoassay)可分為均相(homogenous)和非均相(heterogenous)兩種類型。在均相EIA中可不需進行游離的和結合的標記物的分離而直接測定標記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應後形成的酶標記抗原抗體復合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標記物。均相EIA在臨床檢驗中較少應用。非均相EIA需先進行游離的和結合的標記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay)，簡稱ELISA，在國內有譯作酶聯免疫吸附試驗的，雖然含義不完全確切，但已慣用。

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❹ 免疫檢測包括哪些

臨床免疫學檢測大致分為血清免疫球蛋白檢測，血清補體檢測，細胞免疫檢測，腫瘤標志物檢測，自身抗體檢測，感染免疫檢測和其他免疫檢測。
免疫功能檢查包括免疫球蛋白,補體,自身抗體測定,T,B淋巴細胞亞群分析,細胞因子生成水平檢測,過敏原皮膚試驗。甲功即甲狀腺功能檢查:甲功五項的測定：甲狀腺素(T4),三碘甲狀原氨酸(T3),促甲狀腺激素(TSH),游離T3,游離T4.測定。

❺ 如何設計一種檢測動物或植物中某病毒的免疫學方法(只有已知的該病毒標准抗原)

這個得具體問題具體分析。看你想達到什麼檢測目的了，另外還得看是什麼病毒，存在於動植物什麼部位。最簡單的就是沉積實驗：用標准抗原免疫鼠或兔等使其產生抗體，再用其血清作個沉積實驗就可以了。這個實驗不敏感，需要抗原抗體量較大，如果是特殊病毒或是感染初期，則檢測不到。如果你有條件的話可以做ELISA，這個實驗敏感性強。
一,基本原理
它採用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接,然後通過酶與底物產生顏色反應,用於定量測定.測定的對象可以是抗體也可以是抗原.
在這種測定方法中有3種必要的試劑:
①固相的抗原或抗體(免疫吸附劑)
②酶標記的抗原或抗體(標記物)
③酶作用的底物(顯色劑)
測量時,抗原(抗體)先結合在固相載體上,但仍保留其免疫活性,然後加一種抗體(抗原)與酶結合成的偶聯物(標記物),此偶聯物仍保留其原免疫活性與酶活性,當偶聯物與固相載體上的抗原(抗體)反應結合後,
再加上酶的相應底物,即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色.
其所生成的顏色深淺與欲測的抗原(抗體)含量成正比.

這種有色產物可用肉眼,光學顯微鏡,電子顯微鏡觀察,也可以用分光光度計(酶標儀)加以測定.

其方法簡單,方便訊速,特異性強.
二,酶及其底物
酶結合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯劑作用下聯結的產物.是ELISA成敗的關鍵試劑,它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應,還具有酶促反應,顯示出生物放大作用,但不同的酶選用不同的底物 ,將得到不同的顏色反應.
360,450
420
熒光
黃色
甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)
硝基酚半乳糖苷(ONPG)
β-D-半乳糖苷酶
405
420
黃色
深藍色
ABTS+HRP+葡萄糖
葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭
葡萄糖氧化酶
400
500
黃色
紅色
4-硝基酚磷酸鹽(PNP)
萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽
鹼性磷酸酯酶
492
460
449
425
642
橘紅色
黃色
棕色
蘭色
藍綠色
鄰苯二胺
四甲替聯苯胺
氨基水楊酸
鄰聯苯甲胺
2,2'-連胺基-2(3-乙基-並噻唑啉磺酸-6)銨鹽
辣根過氧化物酶
測定波長
顯色反應
底 物
酶
ELISA的種類和變化
(一)雙抗體夾心法
(二)間接法
(三)競爭法
(四)雙位點一步法
(五)捕獲法測IgM抗體
(六)應用親和素和生物素的ELISA
(一)雙抗體夾心法
此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原
獲得待分析物的未標定抗體
將特異性抗體與固相
載體連接形成固相抗體
洗滌除去未結合的
抗體及雜質
加入封閉蛋白溶液以封閉載體
表面殘留的蛋白結合位點
洗滌並除去未結合的封閉蛋白
加受檢標本(抗原)形成
固相抗體-抗原復合物
洗滌除去其他
未結合的物質
加酶標抗體生成
抗體—待測抗原—酶標記抗體
的復合物
徹底洗滌
未結合的
酶標抗體
加底物進行
酶催化反應
根據顏色反應的
程度進行該抗原
的定性或定量測定
間接法是檢測抗體最常用的方法,其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體,故稱為間接法.
(二)間接法
包被固相載體:
用已知抗原包被
固相載體
加待檢標本:
使相應抗體與固相抗原結合
洗滌,除去無關的物質
加酶標抗抗體:
與固相載體上抗原抗體
復合物結合;洗滌,除去
未結合的酶標抗抗體
加底物
顯色
根據顏色反應的程度進行
該抗原的定性或定量測定
(三)競爭法
此法可用於抗原和半抗原的定量測定,也可用於測定抗體 .
用已知特異性
抗體包被
固相載體
測定管加待測抗原和
一定量的酶標抗原使二者與
固相抗體競爭結合
對照管只加一定量酶標抗原
與固相抗體直接結合
分別洗滌
除去未結合
的成分
加底物顯色
分別測定兩管的吸光度值,
根據對照管與測定管吸光度值之比,
計算標本中待測抗原含量
對照管由於只加酶標抗原,與固相抗體充分結合,故分解底物顯色深;測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標抗原與固相抗體競爭結合的結果而異.如待測抗原量多,競爭性地抑制酶標抗原與固相抗體結合,使固相上結合的酶標抗原量減少.因此,加入底物後顯色反應較弱.
特點一:靈敏性
該測定法的靈敏度來自作為報告集團的酶.眾所周知, 酶是一種有機催化劑,很少量的酶即可誘導大量的催化反應 ,產生可供觀察的顯色反應現象.因此該體系常被稱為酶放大體系.ELISA實現了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位,或在微克,甚至納克水平上對其進行定量.
例如,在測定血清中某一物質的含量時,化學比色法的敏感度為mg/ml水平,酶反應測定法的敏感度約為5~10μg/ml .
特點二:特異性
其特異性來自抗體或抗原的選擇性.抗原抗體的結合實質上只發生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間.由於兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系,所以抗原抗體反應具有高度的特異性.

例如乙肝病毒中的表面抗原(HBsAg),e抗原(HBeAg)和核心抗體(HBcAg),雖來源於同一病毒,但僅與其相應的抗體結合,而不與另外兩種抗體反應.抗原抗體反應的這種特異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質化合物(例如血清)中測定某一特定的物質,而不需先分離待檢物.
ELISA應用實例
飼料中鹽酸克倫特羅的測定
飼料中毒素的測定(主要包括黃麴黴毒素, 簡麴黴毒素 )
飼料中有害微生物的快速篩檢 (如沙門氏菌 )
甲胺磷殘留分析
甲基對硫磷殘留分析
呋喃丹殘留分析
ELISA在飼料安全檢測中的應用
ELISA用於農葯殘留的檢測
河豚毒素
植物毒素如罌粟鹼,嗎啡,藻類毒素
苯並芘
主要有除草劑與殺蟲劑兩大類
例如殺暝松( FN ),
甲氟磷酸異已酶( SOMAN ),
草不綠( Alachor ),
西維因( Carbaryl ),
多菌靈及克菌丹( Captan )等.
農葯的檢測:
ELISA檢測 "非典型肺炎"冠狀病毒
ELISA在結締組織病早期診斷中的應用檢測抗異質性胞核核糖蛋白A2(hnRNPA2)/類風濕性關節炎(PtA)33抗體
ELISA在疾病診斷中的作用
ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體
ELISA試劑盒商業資訊
ELISA試劑盒
酶聯免疫井
DNM-9602G酶標分析儀
DNM-9602 標配酶標分析儀
DNM-9602A酶標分析儀
幾種酶標分析儀
(一) 原理
ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、牽9體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由於抗原、抗體的反應在一種固相載體——聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育後，可通過洗滌除去多餘的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用於檢測抗體的間接法(圖a)、用於檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用於檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

(二) 操作步驟
方法一 用於檢測未知抗原的雙抗體夾心法:
1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鍾。(簡稱洗滌，下同)。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然後洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。
3. 加酶標抗體：於各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定後的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
4. 加底物液顯色：於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鍾。
5. 終止反應：於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結果判定：可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以「+」、「-」號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，於450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零後測各孔O·D值，若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
方法二 用於檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)於反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鍾，洗滌,最後一遍用DDW洗滌。其餘步驟同「雙抗體夾心法」的4、5、6。

(三) 試劑器材
1. 試劑
(1) 包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):
NaCO31.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸餾水至1000ml
(2) 洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸餾水至1000ml
(3) 稀釋液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗滌緩沖液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清與洗滌液配成5～10％使用。
(4) 終止液(2M H2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。
(5) 底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml 0.1M 檸檬酸(19.2克／L) 24.3ml 加蒸餾水50ml。
(6) TMB(四甲基聯苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml無水乙醇) 0.5ml底物緩沖液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl
(7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物緩沖液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl
(8) 抗原、抗體和酶標記抗體。
(9) 正常人血清和陽性對照血清。
2. 器材:
(1) 聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標板)40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。
(2) 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。
(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。

(四) 注意事項
1. 正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的准確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可採用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2. 在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:
(1) 固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙醯胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。
（2) 包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多採用4℃18～24小時。蛋白質包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進行包被後，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對於多數蛋白質來說通常為1～10μg／ml。
(3) 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。然後再固定其它條件或採取「方陣法」(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統里准確地滴定其工作濃度。
(4) 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間後，應加入強酸或強鹼以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鍾為宜。底物使用液必須新鮮配製，尤其是H2O2在臨用前加入。

❻ 免疫學檢驗常用技術有哪些

以下是幾種常用的免疫學技術：
1．免疫熒光技術
免疫熒光技術是利用熒光素標記的抗體（或抗原）檢測組織、細胞或血清 中的相應抗原（或抗體）的方法。由於熒光抗體具有安全、靈敏的特點，因此已 廣泛應用在免疫熒光檢測和流式細胞計數領域。根據熒光素標記的方式不同，可 分為直標熒光抗體和間標熒光抗體。間標熒光抗體中一抗並不直接連接熒光素， 而是先將一抗結合到蛋白，然後帶有熒光素的二抗再結合至一抗。通過二抗的結 合，能將信號進行放大，因此能在一定程度上提高檢測的靈敏度，但是隨之帶來 的高背景也降低了檢測的特異性。近年來，隨著熒光素和熒光檢測技術的不斷進 步，熒光檢測的靈敏度已經接近同位素檢測的水平，直接標記的熒光抗體逐漸取 代間接標記抗體。這些標記了熒光素的抗體直接結合至抗原，大大提高了檢測的 特異性，使檢測的結果更加准確可靠。熒光檢測技術的發展，使得免疫熒光技術 在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查IgM 抗體，做為近期接觸抗原的標志。利用單克隆熒光直接標記抗體鑒定淋巴細胞的 亞類。通過流式細胞儀，針對細胞表面不同抗原，可以同時使用多種不同的熒光 抗體，對同一細胞進行多標記染色。
2．放射免疫檢測
放射免疫檢測技術是目前靈敏度最高的檢測技術，利用放射性同素標記抗 原（或抗體），與相應抗體（或抗原）結合後，通過測定抗原抗體結合物的放射 性檢測結果。放射性同位素具有pg 級的靈敏度，且利用反復曝光的方法可對痕 量物質進行定量檢測。但放射性同位素對人體的損傷也限制了該方法的使用。

3．酶聯免疫吸附試驗（ELISA）
酶聯免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。該方法是將二抗標記上 酶，抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結合起來，根據酶作用底物後的 顯色顏色變化來判斷試驗結果，其敏感度可達ng 水平。常見用於標記的酶有辣 根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶（AP）等。由於酶聯免疫法無需特殊的儀器， 檢測簡單，因此被廣泛應用於疾病檢測。常用的方法有間接法、夾心法以及BAS －ELISA。間接法是先將待測的蛋白抱被在孔板內，然後依次加入一抗、標記了 酶的二抗和底物顯色，通過儀器（例如酶標儀）定量檢測抗原。這種方法操作簡 單但由於高背景而特異性較差。目前已逐漸被夾心法取代。夾心法利用二種一抗 對目標抗原進行捕獲和固定，在確保靈敏度的同時大大提高了反應的特異性。近 年來，抗原的定量檢測技術也不斷推陳出新。近年來，在夾心法ELISA 的基礎上， 開發了多抗原檢測試劑盒，能同時檢測微量液相樣本中多個抗原含量。這項技術 的應用大大縮短了診斷的時間，提高診斷的可靠性和及時性。
4．免疫金膠體技術
膠體金技術經過30 多年的發展到現在已日趨成熟，該方法是將二抗標記上 膠體金顆粒，利用抗原抗體間的特異性反應，最終將膠體金標記的二抗吸附於滲 濾膜上，此方法簡單，快速，廣泛應用於臨床篩查。

❼ 免疫檢測方法

免疫檢測方法大全2017

免疫學檢測技術的用途非常廣泛，它們可用於有關免疫疾病的診斷、療效評價及發病機制的研究。如對傳染病、免疫增殖性疾病、免疫缺損病、超敏反應、自身免疫病、移植排斥反應腫瘤的免疫學檢測，對診斷、治療均有很大幫助。此外在醫學生物學研究中對抗原性物質或細胞的定性、定量檢查不僅推動了對各種免疫學現象的研究，而且擴大免疫學與醫學生物許多領域的聯系。本章僅介紹常用免疫學檢測方法的原理，簡要過程和實用意義。下面是我為大家帶來的關於免疫學檢測法的知識，歡迎閱讀。

第一節抗原或抗體的檢測

一、檢測的原理

藉助抗原和抗體在體外特異結合後出現的各種現象，對樣品中的抗原或抗體進行定性、定量、定位的檢測。

1.抗原與抗體的親和力(affinity)抗原抗體的結合就像酶與底物的結合，激素與其受體的結合一樣不是化學的反應，而是非共價鍵的可逆的結合。抗原決定簇和抗體分子可變區互補構型，造成兩分子間有較強的親和力。空間構型互補程度不同，抗原和抗體分子之間結合力強弱也不同。互補程度高，則親和力強。此外，反應溫度、酸鹼度和離子濃度對抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響，抗體與抗原決定簇之間的結合力大小可用親合力來表示。高親合力的抗體與抗原的結合力強，即使抗原濃度很低時也有較多的抗體結合抗原形成免疫復合物。

2.抗原或抗體外檢測原理根據抗原抗體結合形成免疫復合物的性狀與活性特點，對標本中的抗原或抗體進行定性、定位或定量的檢測。定性和定位檢測比較簡單，即用已知的抗體和待檢樣品混合，經過一段時間，若有免疫復合物形成的現象發生，就說明待檢樣品中有相應的抗原存在。若無預期的現象發生，則說明樣品中無相應的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測樣品中是否有相應抗體。

對抗原或抗體進行定量檢測時，以反應中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫復物的濃度呈函數關系。

(1)根據免疫復合物產生的多少來推算樣品中抗原(或抗體)的含量：在一定的反應條件下，加入的已知抗體(或抗原)的濃度一定，反應產生的免疫復合物多少與待檢樣品中含有相應抗原(或抗體)量成正比。也就是抗體濃度一定時，免疫復合物越多則樣品中的抗原量也越多。可用實驗性標准曲線推算出樣品中抗原(或抗體)的含量。如免疫單向擴散試驗、免疫比濁試驗和酶聯免疫檢測等都屬於這類方法。

(2)抗原或抗體效價滴定的原理：當抗原抗體復合物形成多少不能反應抗原抗體反應強弱時，就不能以檢測反應強度來對抗原或抗體進行定量。在實際工作中，把濃度低的反應成分(抗原或抗體)的濃度固定，把濃度高的另一種反應成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3隻家兔，比較3隻家兔產生抗體的多少，即滴定3隻兔血清抗體效價，可用雙向瓊脂擴散法來滴定，例如將抗體濃度固定，將抗原作不同的稀釋度，分別將抗原或抗體滴入瓊脂的相應小孔中，觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現明顯沉澱淺的抗原稀釋度(如甲兔的抗體效價為1/2000，而丙免的是1/8000則可比較出後者比前者產生抗體的效價要高)。也就是表示效價的稀釋度越高，樣品中所含待檢成分越多。因人血清(抗原)和抗體(免疫兔血清)相比，濃度高，故應稀釋抗原。

二、抗原或抗體檢測的實用意義

1.抗體檢測的意義檢測抗體可用於評價人和動物免疫功能的指標。抗體用於臨床治療或實驗研究時也需做純度分析和定量測定。臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、抗過敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體，對有關疾病的診斷有重要意義。

2.抗原檢測的意義可做為抗原進行檢測的物質可分為以下四類：

(1)各種微生物及其大分子產物：用於傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以及對菌苗、疫苗的研究。

(2)生物體內各種大分子物質：包括各種血清蛋白(如各類免疫球蛋白、補體的各種成分)、可溶性血型物質、多肽類激素、細胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進行檢測。在對這些成分的生物學作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。

(3)人和動物細胞的表面分子：包括細胞表面各種分化抗原(如CD抗原)、同種異型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相關抗原和腫瘤相關性情抗原等。檢測這些抗原對各種細胞的分類、分化過程及功能研究、對各種與免疫有關的疾病的診斷及發病機制的研究，均有重要意義。

(4)各種半抗原物質：某些葯物、激素和炎症介質等屬於小分子的半抗原，可以分別將它們偶聯到大分子的載體上，組成人工結合的完全抗原。用其免疫動物，制備出各種半抗原的抗體，應用於各種半抗原物質的檢測，例如對某些病人在服用葯物後進行血中葯物濃度的監測。對運動員進行服用違禁葯品的檢測，都是應用半抗原檢測的方法。

三、抗原或抗體檢測的方法

由於各種檢測方法中所用的抗原性狀不同，出現結果的現象也不同。最廣泛應用方法有下述幾種：

(一)沉澱反應

可溶性抗原與抗體結合，在兩者比例合適時，可形成較大的不溶性免疫復合物。在反應體系中出現不透明的沉澱物，這種抗原抗體反應稱為沉澱反應(precipitation neaction)。

1.環狀沉澱試驗先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小於0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊於上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復合物沉澱環，故名為環狀沉澱試驗(ring precipitationtest),此法簡便易行，需用材料較多是其缺點。

2.單向免疫擴散試驗單向免疫擴散試驗(single immunodiffusion)是在凝膠中進行的沉澱反應。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注於玻片上，製成含有抗體的瓊脂板，在適當位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復合物。當復合物體積增加到一定程度時停止擴散，出現以小孔為中心的圓形沉澱圈，沉澱圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關。本方法簡便，易於觀察結果，可測定抗原的靈敏度(最低濃度)約為10～20μg/ml，常用於定量測定人或動物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點是需1～2天才能看結果

3.免疫比濁法 當抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見的小免疫復合物，它可使通過液體的光束發生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復合物也增多，光散射現象也相應加強。免疫比濁法(immunonephelomytry)就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經過一段時間，用光散射濁度計(nephelometry)測量反應液體的濁度，來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便，可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。

4，雙向免疫擴散試驗 雙免疫擴散試驗(double immunodiffusion)是在瓊脂板上按一定距離打數個小孔，在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現2～3條沉澱線，本法常用於抗原或抗體的定性或定量檢測，或用於兩種抗原材料的抗原相關性分析。

5.對流免疫電泳對流電泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴散。將瓊脂板放入電泳槽內，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，於負極側的孔內加入抗原，於正極側的孔內加入抗體，通電後，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉澱線。只需1小時左右即可觀察結果。

6.免疫電泳 免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個步驟，即先進行電泳，再進行瓊脂擴散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然後在適當的位置上沿電泳方向挖一直線形槽，於槽內加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散，可形成多答卷沉澱線。常用此法進行血清的蛋白種類分析。對於免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義

7.免疫印跡法免疫印跡法(immunoblotting)又稱為Western印跡法，用於AIDS的血清抗體檢測。第一步，為電泳分離HIV抗原，在電場中根據分子量大小不同病毒抗原各成分散開。第二步，將電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維膜上(電印跡)，然後將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕於病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾種抗原相對應的抗體的話，則在該抗原印跡部位形成免疫復合物沉澱。在洗去未沉澱的抗原和抗體後，在膜上加標記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復合物發生反應，最後加入顯色底物(如果抗人Ig是用酶標記的)或做放射自顯影(抗人Ig用125Ⅰ標記)以顯示結果

第一步：經電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離;

第二步：將已分離的抗原經電印跡轉移到硝酸纖維膜上;

第三步：將待檢病人血清加入覆蓋於硝酸纖維膜上;

第四步：加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上;

第五步：加入顯色底物(或放射自顯影)顯現第二抗體

(二)凝集反應

細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆粒抗原，當與相應抗體結合，抗原與抗體結合形成凝集團塊，即稱為凝集反應(agglutination)。

1.直接凝集 直接凝集(direct agglutination)是將細菌或紅細胞與相應抗體結合產生的細菌凝集或紅細胞凝集現象。可用於傳染病診斷如肥達氏反應(Widal reaction)診斷傷寒病。或利用血細胞凝集現象檢查血型。

2.間接凝集 間接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳膠顆粒或紅細胞表面，與相應抗體混合出現的凝集現象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測類風濕關節炎病人血清中的類風濕因子，用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用於檢測甲狀腺球蛋的抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標本中的抗原，如細菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒，一旦與含有相應抗原的腦脊液混合，便可發生凝集，可進行快速診斷。故凝集反應即可測定抗原，也可測抗體，方法簡便、敏感。

3.抗球蛋白試驗 抗球蛋白試驗(antiglobulin test,coombs test)的原理為間接凝集試驗。例如應用於診斷自身免疫溶血性貧血症時，Rh+紅細胞與抗Rh血清間的反應。因抗Rh抗體是IgG只有兩個結合價，分子較小(不如IgM結合價多，分子大)很難直接引起Rh+紅細胞凝集。如果加入抗IgG的抗體，就可幫助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細胞。也就是經抗Ig的作用提高凝集反應的'靈敏度。

(三)補體參與抗原抗體反應

這一類反應主要包括溶血反應(hemolytic assay)、補體介導的細胞毒試驗(complement mediated cytotoxicuty test)及補體結合試驗(complement fixation test)。

1.溶血反應 抗體與紅細胞表面抗原相遇，形成紅細胞-抗體復合物即可使加入反應中的補體活化，導致紅細胞溶解，此方法可用於紅細胞的各種抗原或相應抗體的檢測，此法比凝集反應敏感。溶血反應也是用於抗體分泌細胞即空斑形成細胞(PFC)檢測的原理。

2.補體介導的細胞毒試驗各種有核細胞與針對其表面抗原的抗體相遇，所形成的免疫復合物能活化反應中的補體，引起細胞膜穿孔，在一定時間內，細胞仍能維持一定的形態不破碎，加入水溶性染如伊紅Y(eosin Y)或台盼藍(trypan blue)後，染料即可進入被活化補體穿孔的細胞，不帶相應抗原細胞膜保持完整的活細胞不著色。此方法可用於帶各種抗原的細胞的檢測，如進行細胞MHC抗原的鑒定，和進行淋巴細胞中T細胞總數或其亞類的計數。在一些免疫學實驗中也可用這種方法，根據需要特異地消除帶某種抗原的細胞。

3.補體結合試驗當抗原(可溶性或顆粒性)與相應抗體結合，由於濃度低不出現可見反應時，應用補體結合試驗可檢出此抗原抗體反應，它比凝集反應或沉澱反應靈敏度高。本法包括兩個抗原抗體系統。一為檢測系統由待檢樣品與已知抗原(或抗體)組成;另一為指示系統，由綿羊紅細胞(SRBC)和抗SRBC組成。另加入作為補體的新鮮豚鼠血清。試驗時試管中先加入檢測系統和補體，混合經37℃30分鍾使抗原、抗體、補體形成復合物，再加入指示系統，如出現溶血現象，說明檢測系統中沒有相對應的抗原抗體，補體是游離的指示系統的SRBC和抗體結合而出現溶血，即為反應陰性。如不出現溶血，表明檢測系統中有抗原抗體復合物並結合補體，則指示系統無多餘的補體作用而沒有溶血現象，即為陽性。

在敏感的抗原、抗體檢測方法(如酶標方法)出現之前補體結合試驗曾廣泛用於檢測各種細菌、病毒或螺旋體(如梅毒)的抗原或抗體，由於本試驗影響因素多，結果不穩定現已被新檢測方法所代替。

四、用標記抗體或抗原進行的抗原、抗體反應

用熒光素、同位素或酶標記抗體或抗原，用於抗原或抗體檢測是目前廣泛應用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標記物與抗原或抗體化學連接之後不改變後者的免疫特性。本方法可用於定性、定量或定位檢測。

1.免疫熒光技術免疫熒光技術(immunofluorescence techni)是用化學方法使熒光素標記的抗體(或抗原)與組織或細胞中的相應抗原(或抗體)結合，進行定性定位檢查抗原或抗體的方法。

(1)直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細胞懸液，細胞塗片或組織切片上進行染色，經抗原抗體反應後，洗去未結合的熒光抗體，將待檢標本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應抗原存在，此法可用於病毒感染細胞、帶某種特異抗原的細胞(如T細胞和B細胞)或病原菌的檢查，也可用於組織中沉著的免疫復合物的檢查。本法的缺點是檢查多種抗原，就需分別制備相應的多種標記抗體。

(2)間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復雜操作。將組織或細胞上的抗原直接與相應抗體(不標記熒光)結合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結合的熒游標記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒游標記的第二抗體，觀察結果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用於檢查抗原的第一抗體是人或動物的只需制備一種抗人或動物的免疫球蛋白熒光抗體

免疫熒光技術在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查抗原或抗體，如查出IgM抗體，可做為近期接觸抗原的標志，所以使用熒游標記抗IgM可診斷近期感染。除微生物學方面的應用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細胞的亞類。使用流式細胞儀(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自動檢測細胞的大小、熒光強度。針對細胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素(FITC)發黃綠熒光，用羅丹明(TMRITC)發紅色熒光。由於熒光顏色不同標記兩種不同的抗體，對同一細胞進行雙標記染色。對淋巴細胞亞類鑒定起著巨大推動作用。應用間接熒光法也用於自身免疫病的抗核抗體檢查。

2.放射免疫分析法 放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)應用競爭性結合的原理，應作放射性同素標記抗原(或抗體)與相應抗體(或抗原)結合，通過測定抗原抗體結合物的放射活性判斷結果，本方法可進行超微量分析，敏感性高，可用於測定抗原、抗體、抗原抗體復合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。

放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：

(1)液相法：將待檢標本(例如含胰島素抗原)與定時的同位素標記的胰島素(抗原)和定時的抗胰島素抗體混合，經一定作用時間後，分離收集抗原抗體復合物及游離的抗原，測定這兩部分的放射活性，計算結合率。在反應系統中，待檢標本的胰島素抗原與同位素標記的胰島素競爭奪戰性與胰島素抗體結合。非標記的抗原越多，標記抗原與抗體形成的復合物越少。非標記抗原含量與標記抗原抗體復合物的量呈一定的函數關系。預先用標準的非標記抗原作成標准曲線後，即可查出待檢標本中胰島素的含量

(2)固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然後加待檢標本，最後加標記抗體。測定固相載體的放射活性，常用的固相載體有溴化氰(CNBr)海豹化的紙片或聚苯乙烯小管

放射免疫分析法應用范圍廣泛，包括多種激素(胰島素、生長激素、甲狀腺素等)維生素、葯物、IgE等。

3.酶聯免疫分析法 酶聯免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是當前應用最廣泛的免疫檢測方法。本法將抗原抗體反應的特異性與酶對底物高效催化作用結合起來，根據酶作用底物後顯色，以顏色變化判斷試驗結果，可經酶標測定儀作定量分析，敏感度可達ng水平。常用於標記的酶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酶(alkaline phosphatase)等。它們與抗體結合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩定性，製成酶標抗體可保存較長時間。目前常用的方法有酶標免疫組化法和酶聯免疫吸附法。前者測定細胞表面抗原或組織內的抗原;後者主要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。

(1)酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是與上述固相RIA相似的原理，將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行政區。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。

(2)夾心法(sandwich assay):將已知的特異抗體包裝在固相載體(塑料板凹孔或紙片上)，加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。

間接法(indirecr ELISA)常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本(可能含有相應抗體)，再加入酶標抗Ig的抗全(即第二抗體)，經加底物顯色後，根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。

(3)BAS-ELISA：近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素(avidin)分子可以結合4個生物素分子(biotin)。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合，而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA)，它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統，同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。

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❽ 免疫學的檢測方法有哪些

免疫學檢測方法可分為體液免疫和細胞免疫。