hplc有關物質檢測方法

Ⅰ 什麼法是葯物有關物質檢查的最常採用的方法

HPLC法是葯物有關物質檢查的最常採用的方法。仿圓乎HPLC法由於分腔耐離效備悉果好、專屬性強、靈敏度高，在有關物質檢查中最為常用。

Ⅱ hplc檢查葯物中有關物質的方法通常有哪幾種類型

歸一化法，校正歸一化法，外標法（已知雜質）

Ⅲ HPLC、UV、GC、TLC是什麼檢測方法

TLC:薄層色譜法.系將適宜的固定相塗布於玻璃板、塑料或鋁基片上，成一均勻薄層。待點樣、展開後，根據比移值（Rf）與適宜的對照物按同法所得的色譜圖的比移值（Rf）作對比，用以進行葯品的鑒別、雜質檢查或含量測定的方法。薄層色譜法是快速分離和定性分析少量物質的一種很重要的實驗技術，也用於跟蹤反應進程。
PC:紙色譜法.是一種可以測試物質的純度與分離混合物的方法，因為它可以快速的完成分析，而且對材料的限制很少，所以是一種極方便而且有用的分析方法。紙色譜法用的分離原則跟薄層色譜法一樣，物質分布在一個固定相與流動相。固定相通常是濾紙，流動相會帶著物質在上面流動，這個裝置將會根據混合物中不同物質對固定相的附著力和對流動相的溶解度而分離出來。分析顏料時，如果顏料中含有不只一種物質，不同顏色的物質會就根據溶劑和不同溶質的極性分開，這是因為不同的分子結構極有可能有不同的極性。這些不同的極性造就對溶劑的不同溶解度，使各種溶質會在溶劑擴散的不同位置沉澱在固定相上以斑點呈現，就可以根據固定相上的斑位置及大小作分析。
HPLC:高效液相色譜法.是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，採用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。
GC:氣相色譜.可分為氣固色譜和氣液色譜。氣固色譜指流動相是氣體，固定相是固體物質的色譜分離方法。例如活性炭、硅膠等作固定相；氣液色譜指流動相是氣體，固定相是液體的色譜分離方法。例如在惰性材料硅藻土塗上一層角鯊烷，可以分離、測定純乙烯中的微量甲烷、乙炔、丙烯、丙烷等雜質。

Ⅳ 請問HPLC是做什麼的原理操作方法

HPLC是高效液相色譜，英文全稱是High Performance Liquid Chromatography。該方法在化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中被用來做重要的分離分析技術。

用途：高效液相色譜更適宜於分離、分析高沸點、熱穩定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質，因而廣泛應用於核酸、肽類、內酯、稠環芳烴、高聚物、葯物、人體代謝產物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲劑、除莠劑的分析等物質的分析。

原理：高效液相色譜以液體為流動相，採用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析和分離。

操作方法：如下圖所示，溶劑貯器中的流動相被泵吸入，經梯度控制器按一定的梯度進行混合然後輸出，經測其壓力和流量，導入進樣閥（器）經保護柱、分離柱後到檢測器檢測，由數據處理設備處理數據或記錄儀記錄色譜圖，餾分收集器收集餾分，廢液瓶收集廢液。

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液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，於60年代後期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。

HPLC根據固定相和流動相的成分分為正相色譜和反向色譜。

正相色譜法

採用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

反相色譜法

一般用非極性固定相（如C18、C8)；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用於分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。

參考資料：網路-高效液相色譜

Ⅳ 高效液相色譜法中定性和定量依據是什麼在HPLC中的定量方法有哪些

定性依據的是保留時間。
定量依據的是與對照品的比對。
HPLC中常用的定量方法（主要以峰面積為基礎），有：外標一點法，外標兩點法，外標標准曲線，內標一點法，內標兩點法，內標標准曲線；歸一化法在一定的條件下也可以用作定量。

Ⅵ 如何用高效液相色譜（HPLC）進行蛋白質的純度檢測及含量測定或者測分子量

尋找鈣蛋白質的標樣配置不同濃度京HPLC分析後作一條工作曲線，然後取待測樣品測試，根據工作曲線可以求出樣品中該蛋白質的真實含量，從而計算出純度/含量；至於分子量，需要用凝膠滲透色譜（GPC）進行測定。

Ⅶ 如何建立HPLC法測定有關物質的方法.ppt

摘要 本文就如何建立TLC法測定有關物質的方法進行論述，系統地闡述了薄層色譜法各條件確定的原理，並列舉了質量標准制訂中存在的某些問題。
關鍵詞 薄層色譜法（TLC法） 有關物質 方法建立
有關物質是研究品中除主成分以外的雜質，它可能是原料合成過程中帶入的原料、中間體、試劑、降解物、副產物、聚合體、異構體以及不同晶型、旋光異構的物質，也可能是制劑過程中產生的降解物，或是在貯藏、運輸、使用過程中產生的降解物等[1]。這些雜質的存在直接反映品的有效性和安全性，故要對其進行研究，特別是在品申報的質量研究資料中需建立其檢測方法，並根據生產、穩定性考核等實際情況考慮是否在質量標准中制訂該檢查項，規定其限度。目前，有關物質的常用測定方法有高效液相色譜法(HPLC法)和薄層色譜法(TLC法)。
TLC的特點是快速、簡便，尤其是對無紫外吸收的雜質測定，更具有其應用價值。如能將TLC法與HPLC法有機地結合、或彼此間進行比對研究，便可得到更多、更為准確的有關雜質信息，做到兩方法間的相輔相成，相益得彰！本文將著重討論如何建立薄層色譜法測定有關物質的方法。
1．測定方法類型
常用的方法有雜質對照品法（適用於已知雜質）和自身（稀釋）對照法（適用於一般雜質檢查，雜質成分少且尚不能取得雜質對照品）。目前國內由於難以獲得雜質對照品、故一般均採用自身對照法。
2．展開劑的確定（即專屬性試驗）
專屬性的研究是提供被分析物在雜質和輔料存在時能被區分的證明，該點是色譜條件建立的關鍵。通常採用在被分析物的對照品或精製品中加入一定量的雜質或輔料，證明色譜條件可將各雜質與被分析物分離[1]。這里的關鍵是：將多少量的雜質加入到多少量的主成分中。正確的作法是將1%(w/w)濃度量的各雜質加入到100%濃度的主成分中，配製這樣的溶液來
驗證系統適用性。之所以如此配製，目的是模仿樣品中有可能存在的狀態，即有少量（1%左右）雜質存在時是否能與主成分達到完全分離，只有這樣才能比較客觀、科學地反映樣品中實際存在情況的（見圖1）；而不應把該溶液配製成：主成分與中間體相同濃度的。因為一者實際檢測時樣品中不可能存在此種情況；二者該濃度不易確定，目前國內申報資料中一般的作法均是配製成較低的一致濃度，這樣各斑點當然易於完全分離了（見圖2），但在實際測定時，由於主斑點急劇增大，很易將相鄰雜質包含於主成分斑點中。同樣，質量標准中的系統適用性試驗用溶液的配製方法亦如此。

（1，3，4為雜質，2為主成分）
圖1 圖2 （雜質濃度均為供試品溶液濃度的1%）
3．檢出條件的確定
其基本出發點是：主成分與相關雜質均應在該條件下顯色，且在相同濃度下，斑點大小應基本一致。薄層板的類型根據被測物質的性質來選用，測定有紫外吸收的物質通常選用GF254或GF365板；測定無紫外吸收、需噴顯色劑的，常選用硅膠G板或H板，選用該類薄層板時，顯色方法根據被測物質的結構式選取，但當有多個顯色方法時，應分別進行試驗，選取靈敏度最高的顯色方法。如醋酸氫化可的松有關物質的測定，中國典2000年版採用鹼性四氮唑藍試液顯色，美國典26版採用硫酸-乙醇(10:90)溶液顯色，兩者均為激素類物的顯色方法。醋酸氫化可的松屬於激素類中的腎上腺皮質激素，四氮唑法是腎上腺皮質激素的重要顯色方法；而硫酸-乙醇顯色法則主要是針對激素類中的的顯色反應，對於屬於腎上腺皮質激素類的醋酸氫化可的松則反應活性不強，結果兩法的靈敏度相差10倍以上。因此，檢出條件的確定，一定要在查閱文獻的基礎上，並根據試驗結果進行綜合考慮。
4．供試品溶液濃度的確定（靈敏度試驗——最低檢出限的測定）
供試品溶液濃度的設定在有關物質檢測中是至關重要的，濃度越高、越能反映樣品中雜質存在的情況，但若設定得過高，則會產生主斑點嚴重拖尾、「斷腰」等超載現象的發生，產生錯誤結論；若設定太低，又將達不到檢測雜質的目的，觀測不到雜質量的變化。其設定是根據最低點樣量和最大點樣量來綜合考慮的。
最低檢出限雖然是個絕對值，但真正的意義卻是其相對值，即相對於供試品溶液的濃度多少而言，所以測定結果不僅要羅列出其絕對值又應列出其相對值，這樣最低檢出限才有意義！最大點樣量則是通過不斷加大供試品溶液濃度，直至主斑點嚴重拖尾、「斷腰」等情況出現時來得到的。然後根據最低檢出限，採用「上推法」來確定：如一般設定雜質斑點小於1.0%對照斑點，對照溶液的濃度至少應為最低檢出濃度（即最低檢出限）的20~50倍，則供試品溶液濃度是最低檢出濃度的2000~5000倍；反過來，最低檢出濃度應至少達到供試品溶液濃度的0.02%~0.05%。應注意的是：由於最低檢出量和最大點樣量因試驗環境、薄層板質量以及即時試驗時其他各因素的不同而改變（即耐受性因數），故供試品溶液的濃度在保證小於最大進樣量的情況下，可在此基礎上設定得再高一些，以保證該濃度可適用於各種條件下。舉例說明見表1（規定雜質限度為1.0%）。

表1 最低檢出量、最大點樣量、供試品溶液和對照溶液濃度之間的比例關系

最大點樣量
供試品溶液
對照溶液
最低檢出量 濃 度 8mg/ml 3mg/ml 30μg/ml 1μg/ml 點樣量 10μl 10μl 10μl 10μl 絕對量 30μg 0.3μg 10ng 相對於樣品測定濃度的 100% 1.0% 0.02% 倍 數 關 系 5000倍 30倍 「基準點」
供試品溶液濃度也可設定得再高些，但不可超過最大點樣量。
5．加樣回收試驗（即准確性試驗）
准確性試驗可採用在預經有關物質測定後的樣品中，加入已知量雜質的方法來評價。准確稱取各雜質，將含有1%(w/w)濃度的各雜質加入到樣品溶液中，以驗證所採用的薄層測定條件是否可分離檢測出相應的各雜質以及樣品中已存在的雜質是否累加，斑點是否加深。該原理同前面所述的專屬性研究是一致的。
6．強力破壞試驗
該項研究是為了揭示原料內在穩定性的特性，它是開發研究的一部分。這些試驗是在比加速試驗更劇烈的條件下進行的，其能夠包含品在銷售過程中所遇到的劇烈條件。可取一批樣品通過強光、高溫、高濕、氧化破壞、以及酸鹼破壞來證明該展開條件能分離檢測出雜質。
7．展開距離
測定時一定要採用25cm、長薄層板，展開距離應盡可能長一些，以使雜質與主成分盡量分離。如用短板，易造成臨近主斑點的雜質斑點「躲進」主斑點中。但同時又應注意，距離拉大，斑點分散，會損失最低檢出限，降低靈敏度，故應綜合考慮。
8．其它的因素
展開溫度應盡量控制在20~25℃之間，尤其在冬季，應注意環境的溫度，如太低，將嚴重影響展開效果。另層析缸的蓋兒，應塗抹凡士林油，以保證整個試驗過程中，層析缸的密封，避免展開劑揮發；並應在展開前，預先傾入展開劑，以使層析缸內的空氣飽和，達到最佳的展開效果。薄層板由於有自製、市售，質量不一也應注意。
二．討論
1． 質量標准中的系統適用性試驗，最好能將最難分離的雜質訂入系統適用性試驗用溶液的配製，將此雜質的濃度配製為主成分濃度的1%，或0.5%，或0.2%（依據雜質限度而定）進行試驗，驗證分離度後，再進行樣品的測定，以確保試驗的准確進行。
2． 質量標准中，應配製系列濃度的對照溶液（即梯度對照），以對雜質有「半定量」的概念，這可更好地評價雜質存在的情況；並應規定雜質的個數及最大雜質斑點的限度，使質量標准更完善、科學。經查閱，中國典薄層色譜法測定有關物質的有70個品種，僅有2個品種採用了梯度對照，絕大部分品種僅是制定了對照溶液，均未規定雜質個數，和最大雜質斑點限度，如有若干個雜質斑點也無法判定；而英國典和美國典則幾乎每個品種均採用梯度對照，並規定雜質個數和最大雜質斑點限度，這一點值得學習和推廣。
3． 錯誤的一種誤區，認為HPLC法完全替代了TLC法，這是不正確的，一定要做到相互補充、相互論證、相互參考才是最客觀、最科學的！
本文是在參閱了日本《分析方法驗證》一書和大量日本國內新申報資料中質量研究部
分的內容所寫而成。

Ⅷ 高效液相色譜法（HPLC）測茶葉中有效成分的含量

高效液相色譜儀操作步驟：

1)． 過濾流動相，根據需要選擇不同的濾膜。

2)． 對抽濾後的流動相進行超聲脫氣10-20分鍾。

3)． 打開HPLC工作站（包括計算機軟體和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統。

4)． 進入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。

5)． 有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進樣閥，需要在manual菜單下，先點擊purge，再點擊start，沖洗時速度不要超過10 ml/min。

6)． 調節流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點擊injure，選用合適的流速，點擊on，走基線，觀察基線的情況。

7)． 設計走樣方法。點擊file，選取select users and methods，可以選取現有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點擊new method。選取需要的配件，包括進樣閥，泵，檢測器等，根據需要而不同。選完後，點擊protocol。一個完整的走樣方法需要包括：a.進樣前的穩流，一般2-5分鍾；b.基線歸零；c.進樣閥的loading-inject轉換；d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。

8)． 進樣和進樣後操作。選定走樣方法，點擊start。進樣，所有的樣品均需過濾。方法走完後，點擊postrun，可記錄數據和做標記等。全部樣品走完後，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩餘物。

9)． 關機時，先關計算機，再關液相色譜。

10)． 填寫登記本，由負責人簽字。

Ⅸ 如何建立HPLC法測定有關物質的方法

先找標准品，按照一定的液相條件進樣測定，確定出峰時間以及檢測波長
配置一系列標准溶遲臘差液局輪，以相同的液相條件碼皮測定，記錄峰面積和濃度，做出標准曲線
同樣液相條件測定相關物質，找到相同時間的峰，以峰面積計算濃度

Ⅹ HPLC法中定量分析方法大致有哪幾種

氣相色譜定量檢測一般就兩種，一個是外標法，一個是標法，對於沒有標准物質的，就只能靠容面積歸一法粗略定量。

通過對人類和環境有影響的各種物質的含量、排放量的檢測，跟蹤環境質量的變化，確定環境質量水平，為環境管理、污染治理等工作提供基礎和保證。簡單地說，了解環境水平，進行環境監測，是開展一切環境工作的前提。

(10)hplc有關物質檢測方法擴展閱讀：

HPLC根據固定相和流動相的成分分為正相色譜和反向色譜。

正相色譜法

採用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。