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常見的蛋白質檢測方法有哪些

發布時間:2023-04-20 16:56:32

① 蛋白質的檢測方法哪些

1、凱氏定氮法

凱氏弊余乎定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下,用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽,然後在鹼性條件下將銨鹽轉化為氨,隨水蒸氣蒸餾出來並為過量的硼酸液吸收,再以標准鹽酸滴定,就可計算出樣品中的氮量。

由於蛋白質含氮量比較恆定,可由其氮量計算蛋白質含量,故此法是經典的蛋白質定量方法。

優點:可用於所有食品的蛋白質分析中;操作相對比較簡單;實驗費用較低;結果准確,是一種測定蛋白質的經典方法;用改進方法(微量凱氏定氮法)可測定樣品中微量的蛋白質。

缺點:凱氏定氮法只是一個氧化還原反應,把低價氮氧化並轉為氨鹽來測定,而不能把高價氮還原為氮鹽的形式,所以不可以測出物質中所有價態的氮含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是一個用於鑒定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑是一個鹼性的含銅試液,呈藍色,由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配製。

當底物中含有肽鍵時(多肽),試液中的銅與多肽配位,配合物呈紫色。可通過比色法分析濃度,在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應蛋白質單位1-10mg。

優點:測定速度較快,干擾物質少,不同蛋白質產生的顏色深淺相近。

缺點:①靈敏度差; ② 三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會干擾該反應。

3、酚試劑法

取6支試管分別標號,前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液,最後一支試管加待測蛋白質溶液,不加標准蛋白溶液,在室溫下放置30分鍾,以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照,於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

優點:靈敏度高,對水溶性蛋白質含量的測定很有效。

缺點:①費時,要精確控制操作時間;②酚法試劑的配製比較繁瑣。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收,這是由於蛋白質中租悉有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在,可用於測定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號,前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液,1號試管不加標准蛋白溶液,最後一支試管加待測蛋白質溶液,而不加標准蛋白溶液,每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致,將液體混合均勻,在280nm波長處進行比色,記錄吸光度值。

優點:簡便、靈敏、快速,不消耗樣品,測定後能回收。 

缺點:①測定蛋白質含量的准確度較差,專一性差; ②干擾物質多,若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質,會出現較大的干擾。

5、考馬斯亮藍法

考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合後,其對可見光的最大吸收峰從 465nm 變為 595nm。

在考馬斯亮藍 G-250 過量且濃度恆定的情況下,當溶液中的蛋白質濃度不同時,就會有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式,而且這種轉變有一定的數量關系。

一般情況,當溶液中的蛋白質濃度增加時,顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加,因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來測定溶液中蛋白質的含量。

優點:靈敏度高,測定快速、簡便,干擾物質少,不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡合劑的影響,適合大量樣品的測定。

缺點:由於各毀謹種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用於不同蛋白質測定時有較大的偏差。

② 常用的血清蛋白質含量測定方法有哪些

四種血清總蛋白質的測定的方法:

1.基於蛋白分子中含有酪氨酸和色氨酸而使用的酚試劑比色法 由於各種蛋白質分子中上述兩種氨基酸的組成比例不同,特別是白蛋白含色氨酸為0.2%,而γ-球蛋白中含量達2%-3%,導致較大的差異。Lowry的改良法在酚試劑中加入Cu2+,集中原法和雙縮脲反應兩者的作用,使呈色靈敏度提高。其中75%的呈色依賴於Cu2+.反應產物最佳吸收峰在650-750nm,方法靈敏度為雙縮脲方法的100倍左右。有利於檢測較微量的蛋白質。但試劑反應仍易受多種化合物的干擾。

2.紫外測定法 採用280nm和215/225紫外吸收值,計算蛋白質含量280nm 是由於蛋白質分子中存在芳香族氨基酸所致。方法的特異性和准確性受蛋白分子中該種氨基酸的含量比例影響甚大。尿酸和肝紅素在280nm附近有干擾。紫外區200-225nm是肽健的強吸收峰。在此區域其吸收值為280nm的10-30倍,將血清稀釋1000-2000倍可以消除干擾物質的影響。

3.採用沉澱反應進行散射比濁法 用磺柳酸、三氯醋酸等配方,此方法甚為簡便,不需特殊儀器,技術關鍵在於:①選擇最佳試劑濃度及溫度;②混勻技術;③選用的標准;④待測標本中的蛋白濃度。

4.染料結合法 蛋白質可與某些染料特異結合,如氨基黑(amino black)與考馬亮藍(comassive brilliant blue )。這一性質除了可以用於電泳後的蛋白質區帶染色,亦可用於總蛋白質的定量。缺點是多種蛋白質與染料的結合力不一致。考馬亮藍在與蛋白質結合後的吸收峰從465nm移向595nm,這一性質可用分光光度法來定量檢測。

③ 請問蛋白質的檢驗方法有多少種(請盡量詳細,

蛋白質測定方法:
測定蛋白質的方法可分為兩大類:
一類是利用蛋白質的共性,即含氮量 、肽鍵和折射率測定蛋白質含量 ;
另一類是利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸性和鹼性基團 以及芳香基團等測定蛋白質含量.
(1) 凱氏定氮法:是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質系數而求出蛋白質的含量,由於樣品中含有少量非蛋白質含氮化合物,故此法的結果稱為粗蛋白質含量.(是食品上蛋白質含量測定最常用的方法)
(2) 雙縮脲法
(3) 染料結合法
(4) 酚試劑法:方法簡便快速,故多用於生產單位質量控制分析.
(5) 紫外分光光度法-近紅外光譜法

④ 測定蛋白質含量的方法有哪些

1、凱氏定氮法

凱氏定氮法是由丹麥化學家凱道爾於1833年建立的,現已發展為常量、微量、平微量凱氏定氮法以及自動定氮儀法等,是分析有機化合物含氮量的常用方法

凱氏定氮法的理論基礎是蛋白質中的含氮量通常占其總質量的16%左右(12%~一19%),因此,通過測定物質中的含氮量便可估算出物質中的總蛋白質含量(假設測定物質中的氮全來自蛋白質),即: 蛋白質含量=含氮量/16%。

2、紫外吸收光譜法

紫外吸收光譜法又稱紫外分光光度法,是根據物質對不同波長的紫外線吸收程度不同而對物質組成進行分析的方法。此法所用儀器為紫外吸收分光光度計或紫外-可見吸收分光光度計。

光源發出的紫外光經光柵或棱鏡分光後,分別通過樣品溶液及參比溶液,再投射到光電倍增管上,經光電轉換並放大後,由繪制的紫外吸收光譜可對物質進行定性分析。

(4)常見的蛋白質檢測方法有哪些擴展閱讀

蛋白質含量測定的意義:

膳食蛋白質符合人的需要時,可維持正常代謝,生成抗體,抵抗感染,有病也易恢復。相反,蛋白質供給不足時,會減輕體重,易患貧血,容易感染疾病;創傷、骨折不易癒合;嚴重缺乏時,血漿蛋白降低,可引起浮腫。

此外癌症與蛋白質攝入量不足也有一定關系。但是,蛋白質攝入過多也可造成腎臟負擔。食物蛋白質在體內代謝所生成的尿酸、氨、酮體等累積過多,可導致衰老;而氨還對機體有毒性,不僅會陡然增加肝臟負擔,還會增加胃腸負荷,引起肝腎受累以及消化不良等症。所以,蛋白質的攝入量要適當。

⑤ 測量蛋白質總量的方法有哪些

1.凝膠過濾法 凝膠過濾法分離蛋白質的原理是根據蛋白質分子量的大小。由於不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質分子量范圍,在此范圍內,分子量的對數和洗脫體積之間成線性關系。因此,用幾種已知分子量的蛋白質為標准,進行凝膠層析,以每種蛋白質的洗脫體積對它們的分子量的對數作圖,繪制出標准洗脫曲線。未知蛋白質在同樣的條件下進行凝膠層析,根據其所用的洗脫體積,從標准洗脫曲線上可求出此未知蛋白質對應的分子量。
2.SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法 蛋白質在普通聚丙烯醯胺凝膠中的電泳速度取決於蛋白質分子的大小、分子形狀和所帶電荷的多少。SDS(十二烷基磺酸鈉)是一種去污劑,可使蛋白質變性並解離成亞基。當蛋白質樣品中加入SDS後,SDS與蛋白質分子結合,使蛋白質分子帶上大量的強負電荷,並且使蛋白質分子的形狀都變成短棒狀,從而消除了蛋白質分子之間原有的帶電荷量和分子形狀的差異。這樣電泳的速度只取決於蛋白質分子量的大小,蛋白質分子在電泳中的相對遷移率和分子質量的對數成直線關系。以標准蛋白質分子質量的對數和其相對遷移率作圖,得到標准曲線,根據所測樣品的相對遷移率,從標准曲線上便可查出其分子質量。
3.沉降法(超速離心法) 沉降系數(S)是指單位離心場強度溶質的沉降速度。S也常用於近似地描述生物大分子的大小。蛋白質溶液經高速離心分離時,由於比重關系,蛋白質分子趨於下沉,沉降速度與蛋白質顆粒大小成正比,應用光學方法觀察離心過程中蛋白質顆粒的沉降行為,可判斷出蛋白質的沉降速度。根據沉降速度可求出沉降系數,將S帶入公式,即可計算出蛋白質的分子質量。質的沉降速度。S也常用於近似地描述生物大分子的大小。蛋白質溶液經高速離心分離時,由於比重關系,蛋白質分子趨於下沉,沉降速度與蛋白質顆粒大小成正比,應用光學方法觀察離心過程中蛋白質顆粒的沉降行為,可判斷出蛋白質的沉降速度。根據沉降速度可求出沉降系數,將S帶入公式,即可計算出蛋白質的分子質量。

⑥ 常用的蛋白質含量測定方法有哪些

①凱氏定氮法
原理:蛋白質平均含氮量為16%。當樣品與濃硫酸共熱,蛋白氮轉化為銨鹽,在強鹼性條件下將氨蒸出,用加有指示劑的硼酸吸收,最後用標准酸滴定硼酸,通過標准酸的用量即可求出蛋白質中的含氮量和蛋白質含量。
②雙縮脲法
原理:尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲,在鹼性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩定的紫紅色絡合物。蛋白質中的肽鍵實際上就是醯胺鍵,故多肽、蛋白質等都有雙縮脲(biuret)反應,產生藍色或紫色復合物。比色定蛋白質含量。
缺點:靈敏度低,樣品必須可溶,在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 (數mg),且會受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾,但 准確度 較高,不受蛋白質的種類影響。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸,所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當於雙縮脲試劑(鹼性銅試劑),試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。
在鹼性條件下,蛋白質中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+, Cu+能定量地與Folin-酚試劑反應生成藍色物質,600nm比色測定蛋白質含量。
靈敏度較高(約 0.1 mg),但較麻煩,也會受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。 步驟中各項試劑的混合,要特別注意均勻澈底,否則會有大誤差。
④紫外法
280nm光吸收法:利用Tyr在280nm在吸收進行測定。
280nm-260nm的吸收差法:若樣品液中有少量核酸共存按下式計算:
蛋白質濃度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 (280 260為角標)
⑤色素結合法(Bradford 法)
直接測定法:利用蛋白質與色素分子(Coomassie Brilliant Blue G-250)結合物的光吸收用分光光度法進行測定。
考馬斯亮蘭(CBG)染色法測定蛋白質含量。CBG 有點像指示劑,會在不同的酸鹼度下變色;在酸性下是茶色,在中性下為藍色。當 CBG接到蛋白質上去的時候,因為蛋白質會提供 CBG一個較為中性的環境,因此會變成藍色。當樣本中的蛋白質越多,吸到蛋白質上的CBG也多,藍色也會增強。因此,藍色的呈色強度,是與樣本中的蛋白質量成正比。
間接測定法:蛋白質與某些酸性或鹼性色素分子結合形成不溶性的鹽沉澱。用分光光度計測定未結合的色素,以每克樣品結合色素的量來表示蛋白質含量的多少。
⑥BCA法
BCA(Bicinchoninc acid procere,4,4』-二羧-2,2』-二喹啉)法與Lowry法相似,主要差別在鹼性溶液中,蛋白質使Cu2+轉變Cu+後,進一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結合產生深紫色,在波長562 nm有強的吸收。
它的優點在於鹼性溶液中BCA 比Folin試劑穩定,因此BCA與鹼性銅離子溶液結合的呈色反應只需一步驟即完成。靈敏度Lowry法相似。
本方法對於陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度,較不受干擾,但會受還原糖 及EDTA的干擾。
⑦膠體金測定法
膠體金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶膠,呈洋紅色,具有高電子密度,並能與多種生物大分子結合。
膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體遇蛋白質轉變為藍色,顏色的改變與蛋白質有定量關系,可用於蛋白質的定量測定。
⑧其他方法
有些蛋白質含有特殊的 非蛋白質基團,如 過氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團,可測 403 nm 波長的吸光來定量之。 含特殊金屬的酶 (如鎘),則可追蹤該金屬。

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