流感嗜血桿菌微生物檢測方法

1. 流感嗜血桿菌肺炎的診斷

凡易感或具危險因素者患社區獲得性肺炎，以及氣管插管機械通氣患者發生早發性呼吸機相關肺炎者都應警惕流感嗜血桿菌肺炎。痰液塗片革蘭染色鏡檢見到短桿狀或春茄察細小的多形性革蘭陰性桿菌有提示診斷意義，並有利於與肺炎鏈球菌肺炎的鑒別。痰培養有流感嗜血桿菌生長在兒童患者中可能具一定意義，在成人患者中其意義需結合臨床考慮。直接自下呼吸道采樣進行細納粗菌培養，陽性結果雖不能確診，但臨床意義較大。胸腔積液或血液培養的陽性結果對流感嗜血桿菌肺炎並發菌血症或敗血症、胸膜炎等具診斷價值。上述培養結果行莢膜腫扒茄脹試驗或免疫熒光試驗可確診，行細菌分型更具參考價值。

2. 如何針對一名細菌感染患者進行病原生物學的診斷

摘要：病原微生物種類繁多，變異迅速，快速鑒定病原微生物的檢驗技術也在不斷發展前進著。目前，應用比較廣泛的病原微生物檢測方法主要有直接塗片鏡檢、分離培養、生化反應、血清學反應、核酸分子雜交、基因晶元、多聚酶鏈反應等，該文對這些檢測技術進展做一綜述。 對人和動物具有致病性的微生物稱為病原微生物，又稱病原體，有病毒、細菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、真菌、放線菌、朊粒等。這些病原微生物可引起感染、過敏、腫瘤、痴獃等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年來出現的SARS、高致病性禽流感、西尼羅病毒感染等疾病的傳染性極強，往往造成世界性大流行，因此對病原體的檢測必須做到快速、准確。常規病原學檢測方法操作繁瑣，檢測周期長，而且對操作人員技術水平要求比較高。隨著醫學微生物學研究技術的不斷發展，病原學診斷已不再局限於病原體水平，深入到分子水平、基因水平的檢測手段不斷出現並被應用於臨床和實驗室 J。核酸分子雜交技術、PCR技術、基因晶元技術等檢測方法，自動化程度高，快速省時、無污染、結果精確，可以准確靈敏地鑒定病原微生物。1 傳統的病原微生物的檢測方法傳統的病原微生物學實驗室檢查以染色、培養、生化鑒定等為主，將標本直接塗片染色鏡檢和接種在培養基上進行分離培養是對細菌或真菌感染性疾病進行病原學診斷的常用方法。1．1 直接塗片鏡檢病原微生物體形體積微小，大多無色半透明狀，將其染色後可藉助顯微鏡觀察其大小、形態、排列等。直接塗片染色鏡檢簡便快速，對那些具有特殊形態的病原微生物感染仍然適用，例如淋球菌感染、結核分枝桿菌、螺旋體感染等的早期初步診斷。直接塗片鏡檢不需要特殊的儀器和設備，在基層實驗室里仍然是十分重要的病原微生物檢測手段。1．2 分離培養與生化反應 分離培養主要用於臨床標本(如血液、痰、糞便等)或培養物中有多種細菌時對某一種細菌的分離。細菌的生長繁殖需要一定時間，檢測周期較長，不能同時處理批量樣本。為解決這一問題，各種自動化培養和鑒定系統不斷產生，傳統鑒定方法也在逐步改進，大大加快了檢驗速度。例如Microscan WalLCAway全自動微生物分析儀，可同時做細菌鑒定和葯敏試驗，檢驗500多個菌種。苛養菌如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌等對營養要求比較高，常規培養陽性率低。雍剛 等將不要同比例的葡萄糖、玉米澱粉、生長因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌劑加入到巧克力培養基中製成了新型淋病奈瑟菌培養基，大大提高了淋病奈瑟菌的分離培養率。蘇盛通等在營養瓊脂中加人了中葯紅棗、赤小豆培養甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、肺炎鏈球菌等細菌，生長指數明顯高於血平板。1．3 組織細胞培養 活組織細胞培養適於專營活組織細胞內生存的病原體，包括病毒、立克次體、衣原體等。不同病原體敏感的組織細胞是不一樣的，將活細胞從病原體敏感的動物組織中取出在體外進行原代培養或用病原體敏感細胞系進行傳代培養，再將病原體接種於相應的組織細胞中後，病原體可在其中繁殖增長，引起特異性的細胞病變效應。也可以將病原體直接接種於敏感動物體內，引起相應組織器官出現特異的病理學改變。往往可以根據這些特異的病變對病原體進行鑒定。2 血清學與免疫學檢測血清學檢測是通過已知的抗體或抗原來檢測病原體的抗原或抗體從而對病原體進行快速鑒定的技術，簡化了鑒定步驟，常用的方法包括血清凝集技術、乳膠凝集實驗、熒光抗體檢測技術、協同凝集試驗、酶聯免疫測試技術等。酶聯免疫技術的應用大大提高了血清學檢測的敏感性和特異性，不僅可檢測樣本中病原體抗原，也可檢測機體的抗體成分。幽門螺奸菌在我國人群感染率高達50％ ～80％ ，應用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測唾液中抗HP抗體來診斷HP感染，其結果滿意。乙型肝炎病毒(HBV)在我國人群中感染率極高，ELISA應用於乙型肝炎病人早期血清學診斷的效果最為明顯。臨床上致病菌往往和非致病菌混合在一起，如何從這些細菌中分離出目標菌是關鍵。免疫磁珠分離技術(IMBS)是近年來發展起來的在微生物檢測領域中一種新技術。其基本原理是將特定病原體的單抗或多抗或二抗偶聯到磁珠微球上，通過抗原抗體反應形成磁珠一目標病原體復合物或磁珠一一抗一目標病原體復合物，在外部磁場磁力的作用下，將目標病原體分離出來。目前已經開發出了針對各種病原體的免疫磁珠，如大腸埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、軍團菌等，廣泛應用到各級科研和實驗室 。經IMBS分離出的白色念珠菌可直接在顯微鏡下檢測，檢測時間縮短至4 h。IM—Bs還可以和其它檢測技術聯合來檢測病原菌，免疫磁珠分離得到的目標菌可繼續用於分離培養使大腸埃希菌0157最低檢測限由200 cfu·g 提高到2 cfu·g～；IMBS結合聚合酶鏈反應(IMBS—PCR)可對培養條件比較特殊的細菌如苛養菌、厭氧菌進行快速檢測，肉類中的產毒素型產氣莢膜梭菌經IMBS．PCR檢測，檢測時間縮短到10 h，最低檢測限可達10cfu·g～，有研究者利用IMBS結合實時熒光定量PCR(IMBS—RT—PCR)成功檢測出了水中的輪狀病毒和草莓的諾如病毒，檢測時間大大縮短；Leon—Velarde等利用IMB8結合酶聯檢測，大大提高了沙門菌的檢測效率。3 基因檢測隨著科技水平發展，分子生物學檢測技術日新月異，對病原微生物的鑒定已不再局限於對普通外部形態結構和生理生化特性等的一般檢驗上，而是深入到了分子水平、核酸水平。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特異的，有別於其他種或屬，檢測其特有的基因片段序列可用來鑒別病原微生物。隨著科技的發展，基因檢測技術逐漸代替其它檢測技術，成為臨床檢驗科和基礎實驗室對病原體的主流檢測技術。3．1 核酸雜交技術具有一定互補序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按鹼基互補配對原則締成異質雙鏈的過程叫核酸雜交，其雜交雙方是所使用探針和要檢測的核酸。在病原微生物檢測中核酸分子雜交主要包括膜上印跡雜交和核酸原位雜交兩種。膜上印跡雜交是指將核酸從微生物細胞中分離出來，純化後在體外結合到一定的固相支持物上，與存在於液相中標記的核酸探針進行雜交。核酸原位雜交是指標記的核酸探針直接與細胞或組織切片中的核酸進行雜交。探針還可以用熒游標記，在熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡下即可鑒別病原體還可顯示在三維空間中的位置。核酸分子雜交檢測技術與其它方法相比顯著地優點是簡便、敏感、快速、特異。Wong 等用熒游標記2個不同的寡核苷酸探針從血液標本中檢測出假單胞菌屬和不動桿菌屬的細菌，最低檢測限為10 cfu·mL～，特異度為100％ ，檢測時間不到2 h。寡核苷酸探針是針對病原體特異基因序列設計的，可以將待檢測的病原體定位在不同的分類等級，如科、屬、種、亞種「 。（病原微生物檢測技術進展）3．2 基因晶元技術基因晶元(DNA chip)又稱為DNA微陣列(DNA microarray)或DNA晶元，是生物晶元的一種 j，是核酸分子雜交技術發展延伸而來的。通過微加工技術，將數以萬計甚至百萬計的基因探針即DNA片段有規律地排列成二維DNA探針陣列，固定到矽片、玻片等固態支持物上，與標記的樣品分子進行核酸雜交，用於基因檢測工作。其測序原理與核酸雜交一樣，但解決了傳統核酸雜交技術操作繁雜、檢測效率低、自動化程度不高的缺點。基因晶元在病原微生物感染診斷上的應用，大大縮短了確診所需要的時間，而且能檢測出病原體是否耐葯、對那些抗生素耐葯、對那些抗生素敏感。Naas 等設計的基因晶元可以檢測出銅綠假單胞菌、腸桿菌屬、鮑氏菌屬中各型B一內醯胺酶類耐葯基因。蔡挺等設計的基因晶元檢測出大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動桿菌、陰溝腸桿菌對l7種抗菌葯物的耐葯率。Batchelor 等開發的基因晶元可以檢測出編碼耐超廣譜8．內醯胺酶、磺胺類、四環素類、氨基糖甙類等47個耐葯基因的大腸埃希菌和沙門氏菌。基因晶元技術同樣還有些問題有待解決，如提高晶元的特異性和檢測信號的敏感性，降低晶元的製作成本等，而且多數晶元都需要昂貴的檢測儀器，這些問題使得基因晶元到目前主要局限於實驗室研究而未能廣泛應用於臨床病原微生物的檢測與鑒定。（病原微生物檢測技術進展）3．3 PCR技術聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種在體外是用已知寡核苷酸引物引導未知片段中微量待測基因片段並進行擴增的技術。由於PCR可以對待測基因進行擴增，特別適用於病原體感染早期的診斷，但是如果引物特異性不強，可能會造成假陽性的出現。PCR技術在近20年裡發展迅速，從基因擴增到基因的克隆和改造以及遺傳分析，可靠性逐步提高。Jbara 用PCR和傳統法直接檢測75例樣本中的流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌，與傳統方法相比，PCR檢測的特異度和靈敏度分別為87．3％ 和100％ 。1988年Chamberian等提出了多重PCR的概念，同一PCR反應體系裡加上二對以上引物，可同時擴增出多個核酸片段，適合大量樣本的分析與鑒定。多重PCR具有：(1)高效性，在同一反應體系內可同時檢出多種病原微生物，或對同一病原微生物的不同型別進行分型；(2)系統性，多重PCR很適宜於成組病原體的檢測，如幾種肝炎病毒同時感染；淋球菌、梅毒螺旋體、艾滋病病毒等多重性病病原體的感染；需特殊培養的無芽胞厭氧菌感染；破傷風桿菌，炭疽桿菌，產氣莢膜桿菌，鼠疫耶爾森菌等戰傷感染細菌感染；(3)經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時被檢出，節省試劑、節約費用、節省時間，為臨床提供更快更多更准確的診斷信息。Reyes等 用多重PCR從90例發熱但培養陰性的兒童細菌性腦膜炎腦脊液樣本中檢測出了腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌，特異度100％ ，敏感度89％。實時熒光定量PCR，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程。具有高度靈敏、高度特異、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時熒光定量PCR對性病病原體早期確診、窗口期篩查、療效檢測、基因變異分析和預後評估等具有重要價值，為流行病學調查提供幫助 J。王娉等 建立了多重實時熒光定量PCR反應體系，同一體系能同時快速檢測出耐甲氧西林和產腸毒素A的金黃色葡萄球菌。熒光基團標記的特異性引物可准確反映病原體感染和葯物療效，特別適用於不可人工培養和難以培養的病原體如病毒、衣原體等感染的診斷。基因晶元技術與多重PCR結合可以通過PCR對目的基因進行放大，通過基因晶元的熒光探針增加檢測的靈敏性和特異性，使得兩種檢測技術的優勢互補，已廣泛應用於病原微生物的檢測。將病原體特異性基因作為靶基因設計出引物與探針，進行多重PCR擴增，制備出寡核苷酸晶元，再對待測樣本靶基因進行多重PCR擴增，將擴增產物與病原菌多重PCR基因晶元檢測體系雜交，可根據雜交信號直觀地判讀樣品中所含病原體的種類、型別、毒力、侵襲力，從而對病原體進行檢測和鑒定。（病原微生物檢測技術進展）3．4 其它基因檢測技術分子生物學技術飛速發展，各種新的基因檢測手段不斷出現。Notomi等於2000年開發出一種新的環介導恆溫核酸擴增法(1oop—mediated isothermal amplifi—cation of DNA，簡稱LAMP)，針對靶基因序列上6或8個特異區域設計出4或6條引物，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下形成環狀結構和鏈置換對目標DNA大量擴增。短短幾年LAMP已被廣泛應用於疾病診斷、食品檢驗、環境監測、生物安全等各方面心 ]。李蒙等 運用LAMP法60 min檢測了16例開放性傷口深部傷口感染分泌物中的破傷風芽孢梭菌，其中陽性為4例，最低檢測限為4 x 10 。有研究報道l2 用LAMP技術快速檢測了200例肺結核患者的痰標本，結核分枝桿菌的陽性檢出率遠遠高於培養法和染色法。多位點可變數目串聯重復序列分析(Multiple—locus Variable—nun—ber Tandem repeat Analysis，MLVA)是一種根據病原體基因組中可變數目串聯重復序列的特徵來對病原體基因分型的一種技術，廣泛應用於金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、炭疽芽胞桿菌等的基因分型與鑒定 ⋯。4 小結與展望對病原體進行快速准確的檢測和鑒定是傳染病防治工作的首要問題。隨著生物學研究由宏觀領域向微觀領域的發展，病原體檢測方法也從組織形態學水平深入到分子水平、基因水平。近年來發展起來的病原微生物高通量檢測技術樣本需要量少、快速省時、無污染、診斷結果精確、自動化程度高，相信隨著研究的不斷進展和深入，這些高通量診斷技術和方法必將在病原微生物的診斷分析方面起到越來越重要的作用，而多種檢測技術的聯合和綜合更是有著廣闊的應用前景。

3. 怎樣消除（或中和、分解、）β-內醯胺酶有沒有檢測β-內醯胺酶的簡單方法謝謝~~！

一、消除：
暫時沒有什麼有效的針對性清除辦法，比較可行的是使用舒巴坦（Sulbactam）之類的不可逆競爭性β-內醯胺酶抑制劑。前者和β-內醯胺酶發生不可逆的醯化反應使酶失活,當抑制劑去除後酶的活性也不能恢復，其作用比較顯著。

二、檢測：
1.常規方法
(1).微生物法：
[原理] 以一種對青黴素高度敏感的細菌-枯草芽孢桿菌作為指示劑，試驗時如果被測細菌株產生青黴素酶，破壞了青黴素，則此高度敏感菌株即可生長，否則，指示劑則被抑制。
[方法] 以枯草芽孢桿菌為指示菌，用棉拭子將枯草芽孢桿菌接種於瓊脂培養基上，或傾注方法將枯草芽孢桿菌混於瓊升凱喚脂平板內。然後將被測菌與產青黴素酶陽性及陰性對照菌株，按下圖接種劃線，在瓊脂培養基中央放置一含青黴素G（1單位）紙片。放置35℃培養24小時後觀察結果。
[結果判斷] 如被檢菌產生青黴素酶，則沿著被測菌處的枯草芽孢桿菌抑菌環出現凹痕。

(2).碘量法[3]
[原理] β-內醯胺酶能裂解青黴素的β-內醯胺環形成青黴噻唑酸，它與澱粉競爭游離碘，破壞了碘和澱粉的蘭色復合物，使蘭色變為無色。
[方法]
①將0.25克青黴素溶於41.7mlPH6.0的磷酸鹽緩沖液中，使其濃度成6000ug/ml。取0.1ml於一小試管中。孫團
②將培養18-24小時的細菌在含青黴素試管內製成濃厚菌懸液（109/ ml）。
③在37℃水浴中吵凱放置30分鍾，不時搖動，使酶能破壞青黴素。
④加入1%可溶性澱粉溶液0.5 ml，搖勻。
⑤加入碘液0.02 ml。
⑥在37℃水浴中放置10分鍾，觀察結果。
[結果] 在10分鍾內能使蘭色完全消退的菌株為β-內醯胺酶陽性，不消退者為陰性。
[注意事項]
①由於青黴素很容易分解，因而用於實驗的青黴素應新鮮配製。
②澱粉也新鮮配製，在100 ml蒸餾水中加入1克可溶性澱粉，放到開水中水浴直到澱粉溶解。
③實驗應按照步驟操作，如果碘加得過早，酶反應就會停止，產生假陰性結果。
④每次試驗最好用陽性和陰性對照。
（3）.紙片酸度定量法[3]
[原理] β-內醯胺酶能破壞青黴素中的β-內醯胺環，形成青黴噻唑酸，使PH降低，指示劑溴甲酚紫顏色由紫變黃。
[方法]
①將一小片Whatman濾紙放於空平皿中。
②讓濾紙吸足青黴素溶液（0.05M磷酸緩沖液，PH8.0+0.2%溴甲酚紫+5%無緩沖劑的結晶青黴素）。
③用接種環把10-20個菌落塗到濾紙上，
④蓋好平皿後，將濾紙片在37℃孵育30分鍾，觀察結果。
[結果] 產β-內醯胺酶的菌株使濾紙顏色由蘭色變黃色，一般在10分鍾內即能看到。
（4）.產色頭胞菌素法[4]
[原理] 產色頭胞菌素如頭胞硝噻吩（nitrocefin）的β-內醯胺環能被β-內醯胺酶所破壞，使其顏色由淺黃色變為粉紅色，以此來測定細菌的產酶情況。
[方法] 將頭胞硝噻吩（nitrocefin）紙片置於干凈的平皿內，用無菌的牙簽或接種環挑取細菌菌落塗於紙片上，觀察紙片有無顏色變化。
[結果] 紙片塗抹處如顏色由淺黃色變成粉紅色，表示該菌產生β-內醯胺酶，如顏色不變，表示細菌不產生β-內醯胺酶。
檢測β-內醯胺酶方法中，生物學方法是古老的方法，由於特異性差、靈敏度低，現在基本上很少被採用，頭胞硝噻吩（nitrocefin）主要檢測淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）、葡萄球菌，結果可靠。紙片酸度定量法一般用於檢測淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌和葡萄球菌。碘量法常用於檢測淋病奈瑟氏菌，但莫拉氏菌（布拉漢氏菌）只能用頭胞硝噻吩（nitrocefin）法。
對於淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌（布拉漢氏菌）快速測定β-內醯胺酶比做葯敏試驗能更快地得到臨床需要的結果。β-內醯胺酶試驗還可驗證葡萄球菌對紙片法青黴素的敏感試驗結果是否可信。腸桿菌科、假單胞菌科及其它需氧革蘭氏陰性桿菌不必測定β-內醯胺酶，因其結果常常不能預測這類細菌對臨床常用來治療β-內醯胺類抗生素葯物的敏感性[5]。

4. 微生物生長的常用檢測方法

一、生長量測定法

1.1體積測量法：又稱測菌絲濃度法。

通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間（如5分鍾）和轉速（如5000rpm），離心後，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。

1.2稱乾重法：

可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，並用清水離心洗滌1-5次，進行乾燥。乾燥可用烘箱在105℃或100℃下烘乾，或採用紅外線烘乾，也可在80℃或40℃下真空乾燥，乾燥後稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾後用少量水洗滌，在40℃下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常採用這種方法，如活性乾酵母（activitydryyeast,ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

1.3比濁法：

微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600nm處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.Coli的生長及誘導時間。

1.4菌絲長度測量法：

對於絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度，或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管，到入合適

的培養基，卧放，在開口的一端接種微生物，一段時間後記錄其菌絲生長長度，藉此衡量絲狀微生物的生長

二、微生物計數法

2.1血球計數板法:

血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平台，兩嵴的表比兩平台的表面高0.1mm，每個平台上刻有不同規格的格網，中央0.1mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

2.2染色計數法：

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色後在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。

2.3比例計數法：

將已知顆粒（如黴菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的'細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標准。

2.4液體稀釋法：

對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15隻裝培養液的試管中，經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然後查最大或然數表MPN（mostprobablynumber）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

2.5平板菌落計數法：

這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液塗布於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養後，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。

2.6試劑紙法：

在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養後在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標准紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷准確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

2.7膜過濾法：

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。

2.8生理指標法：

微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸鹼度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。

2.9測定含氮量：

大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母為7.5%，黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱後產生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2後即可測出N2的量。

2.10測定含碳量：

將少量（乾重0.2-2.0mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加熱30分鍾後冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標准樣品做標准曲線。

2.11還原糖測定法：

還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用於大規模工業發酵生產上微生物生長的常規監測。方法是，離心發酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鍾，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點時加入澱粉溶液，繼續加Na2S2O3至終點，查表讀出還原糖的含量。

2.12氨基氮的測定：

方法是，離心發酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02N的使之變色，根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。

2.13其他生理物質的測定：

P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙醯胞壁酸）等含量以及產酸，產氣，產CO2（用標記葡萄糖做基質），耗氧，黏度，產熱等指標，都可用於生長量的測定。也可以根據反應前後的基質濃度變化，最終產氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如我所在BMP-2的發酵生產上，隨時監測溶氧量的變化和酸鹼度的變化，判斷細菌的長勢。

拓展：微生物的現代定義

肉眼難以看清，需要藉助光學顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的一切微小生物的總稱。微生物包括細菌、病毒、真菌和少數藻類等。（但有些微生物是肉眼可以看見的，像屬於真菌的蘑菇、靈芝等。）病毒是一類由核酸和蛋白質等少數幾種成分組成的「非細胞生物」，但是它的生存必須依賴於活細胞。根據存在的不同環境分為空間微生物、海洋微生物等，按照細胞結構分類分為原核微生物和真核微生物。

微生物的主要特徵

體小面大

一個體積恆定的物體，被切割的越小，其相對表面積越大。微生物體積很小，如一個典型的球菌，其體積約1mm，可是其表面積卻很大。這個特徵也是賦予微生物其他如代謝快等特性的基礎。

吸多轉快

微生物通常具有極其高效的生物化學轉化能力。據研究，乳糖菌在1個小時之內能夠分解其自身重量1000-10000倍的乳糖，產朊假絲酵母菌的蛋白合成能力是大豆蛋白合成能力的100倍。

生長繁殖快

相比於大型動物，微生物具有極高的生長繁殖速度。大腸桿菌能夠在12.5-20分鍾內繁殖1次。不妨計算一下，1個大腸桿菌假設20分鍾分裂1次，1小時3次，1晝夜24小時分裂24×3=72次，大概可產生4722366500萬億個（2的72次方），這是非常巨大的數字。但事實上，由於各種條件的限制，如營養缺失、競爭加劇、生存環境惡化等原因，微生物無法完全達到這種指數級增長。 已知大多數微生物生長的最佳pH范圍為7.0 (6.6~7.5)附近，部分則低於4.0。

微生物的這一特性使其在工業上有廣泛的應用，如發酵、單細胞蛋白等。微生物是人類不可或缺的好朋友。

適應強 易變異

分布廣 種類多

微生物對我們生活的影響

微生物對人類最重要的影響之一是導致傳染病的流行。在人類疾病中有50%是由病毒引起。微生物導致人類疾病的歷史，也就是人類與之不斷斗爭的歷史。在疾病的預防和治療方面，人類取得了長足的進展，但是新現和再現的微生物感染還是不斷發生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治療葯物。一些疾病的致病機制並不清楚。大量的廣譜抗生素的濫用造成了強大的選擇壓力，使許多菌株發生變異，導致耐葯性的產生，人類健康受到新的威脅。一些分節段的病毒之間可以通過重組或重配發生變異，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都與前次導致感染的株型發生了變異，這種快速的變異給疫苗的設計和治療造成了很大的障礙。而耐葯性結核桿菌的出現使原本已近控制住的結核感染又在世界范圍內猖獗起來。

微生物千姿百態，有些是腐敗性的，即引起食品氣味和組織結構發生不良變化。當然有些微生物是有益的，它們可用來生產如乳酪，麵包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必須通過顯微鏡放大約1000 倍才能看到。比如中等大小的細菌，1000個疊加在一起只有句號那麼大。

微生物能夠致病，能夠造成食品、布匹、皮革等發霉腐爛，但微生物也有有益的一面。最早是弗萊明從青黴菌抑制其它細菌的生長中發現了青黴素，這對醫葯界來講是一個劃時代的發現。後來大量的抗生素從放線菌等的代謝產物中篩選出來。抗生素的使用在第二次世界大戰中挽救了無數人的生命。一些微生物被廣泛應用於工業發酵，生產乙醇、食品及各種酶制劑等；一部分微生物能夠降解塑料、處理廢水廢氣等等，並且可再生資源的潛力極大，稱為環保微生物；還有一些能在極端環境中生存的微生物，例如：高溫、低溫、高鹽、高鹼以及高輻射等普通生命體不能生存的環境，依然存在著一部分微生物等等。看上去，我們發現的微生物已經很多，但實際上由於培養方式等技術手段的限制，人類現今發現的微生物還只佔自然界中存在的微生物的很少一部分。

微生物間的相互作用機制也相當奧妙。例如健康人腸道中即有大量細菌存在，稱為正常菌群，其中包含的細菌種類高達上百種。在腸道環境中這些細菌相互依存，互惠共生。食物、有毒物質甚至葯物的分解與吸收，菌群在這些過程中發揮的作用，以及細菌之間的相互作用機制還不明了。一旦菌群失調，就會引起腹瀉。

隨著醫學研究進入分子水平，人們對基因、遺傳物質等專業術語也日漸熟悉。人們認識到，是遺傳信息決定了生物體具有的生命特徵，包括外部形態以及從事的生命活動等等，而生物體的基因組正是這些遺傳信息的攜帶者。因此闡明生物體基因組攜帶的遺傳信息，將大大有助於揭示生命的起源和奧秘。

工業微生物涉及食品、制葯、冶金、采礦、石油、皮革、輕化工等多種行業。通過微生物發酵途徑生產抗生素、丁醇、維生素C以及一些風味食品的制備等；某些特殊微生物酶參與皮革脫毛、冶金、採油采礦等生產過程，甚至直接作為洗衣粉等的添加劑；另外還有一些微生物的代謝產物可以作為天然的微生物殺蟲劑廣泛應用於農業生產。通過對枯草芽孢桿菌的基因組研究，發現了一系列與抗生素及重要工業用酶的產生相關的基因。乳酸桿菌作為一種重要的微生態調節劑參與食品發酵過程，對其進行的基因組學研究將有利於找到關鍵的功能基因，然後對菌株加以改造，使其更適於工業化的生產過程。國內維生素C兩步發酵法生產過程中的關鍵菌株氧化葡萄糖酸桿菌的基因組研究，將在基因組測序完成的前提下找到與維生素C生產相關的重要代謝功能基因，經基因工程改造，實現新的工程菌株的構建，簡化生產步驟，降低生產成本，繼而實現經濟效益的大幅度提升。對工業微生物開展的基因組研究，不斷發現新的特殊酶基因及重要代謝過程和代謝產物生成相關的功能基因，並將其應用於生產以及傳統工業、工藝的改造，同時推動現代生物技術的迅速發展。

經濟作物柑橘的致病菌是國際上第一個發表了全序列的植物致病微生物。還有一些在分類學、生理學和經濟價值上非常重要的農業微生物，例如：胡蘿卜歐文氏菌、植物致病性假單胞菌以及中國正在開展的黃單胞菌的研究等正在進行之中。日前植物固氮根瘤菌的全序列也剛剛測定完成。借鑒已經較為成熟的從人類病原微生物的基因組學信息篩選治療性葯物的方案，可以嘗試性地應用到植物病原體上。特別像柑橘的致病菌這種需要昆蟲媒介才能完成生活周期的種類，除了殺蟲劑能阻斷其生活周期以外，只能通過遺傳學研究找到毒力相關因子，尋找抗性靶位以發展更有效的控制對策。固氮菌全部遺傳信息的解析對於開發利用其固氮關鍵基因提高農作物的產量和質量也具有重要的意義。[10]

在極端環境下能夠生長的微生物稱為極端微生物，又稱嗜極菌。嗜極菌對極端環境具有很強的適應性，極端微生物基因組的研究有助於從分子水平研究極限條件下微生物的適應性，加深對生命本質的認識。

5. 流感嗜血桿菌的症狀診斷

大部份流感嗜血桿菌型燃橋都是機會性感染細菌，即它們會在寄主體內生存而不引起任何疾病，但當某一些因素（如病毒感染或免疫力下降）出現後則會引發病症。流感嗜血桿菌一般有六種菌段鉛株，稱為a型、b型（又稱乙型）、c型、d型、e型及f型。
由流感嗜血桿菌自然產卜猛生的疾病只會在人類出現。在嬰兒及孩童中，乙型流感嗜血桿菌會引致菌血病症及急性細菌性腦膜炎。偶爾地它會引致蜂窩組織炎、骨髓炎及關節感染。自從1990年開始，美國使用HiB結合型疫苗後，HiB病症的患病率減少至每十萬名兒童有1.3名兒童感染。但是，HiB仍然是發展中國家引致嬰兒及兒童下呼吸道疾病的主因。沒有莢膜的流感嗜血桿菌會引致兒童的耳朵感染（如中耳炎）、眼睛感染（結膜炎）及鼻竇炎，並且聯帶肺炎。
Hib肺炎通常發生於1歲左右兒童。大多數病人發病前有感冒，50%左右早期出現胸腔積液。菌血症和膿胸不常見。大部分受無莢膜菌株感染的成年人產生類似其他細菌性肺炎的支氣管肺炎。
痰液革蘭氏染色示大量小的革蘭氏陰性球桿菌；此種細菌對培養的營養需要較為嚴格且往往寄生在上氣道內，因此培養常出現假陰性和假陽性。

6. 流感嗜血桿菌肺炎的檢查

1.實驗室檢查
白細胞總數增高；血清腺苷慶液脫氨酶增高。
2.病原學檢查
痰液革蘭染色示大量小的革蘭陰性桿菌。
3.X線檢查
常為肺段及肺葉實變。呈支氣管肺炎影像，表現為斑片狀或多葉性浸潤，很少形成肺團差行膿腫，約20%發生塌嘩膿胸。

7. 流感嗜血桿菌感染的檢查

1.病原學檢查（1）塗片直接檢查肺炎患者的痰，腦膜炎患者的腦脊液，化膿性感染病灶處膿性分泌物，均可做塗片染色檢查，如發現革蘭陰性短桿菌有助於診斷。（2）細菌培養流感桿菌腦膜炎等感染與其他細菌性腦膜炎等表現並無不同，最可靠的診斷依據是由血液、腦脊液中及局部分泌物中查到病原菌；以免疫化學方法鑒定新分離菌的莢膜腫脹反應及從上述體液、濃縮尿等標本中檢查莢膜物質，這些也可作為佐證。咽培養和痰培養則不能除外為帶菌所致，須結合臨床及其他檢查綜合考慮。（3）對流免疫電泳（CIE）對細菌性腦膜炎患兒的腦脊液進行細菌培養和CIE檢測Hib抗原發現，細菌培養陽歷顫性率為13.3%（8/60），CIE陽性率為90%（54/60）；其中b型流感孫念嗜血桿菌培養陽性率5.0%（3/60），b型流感嗜血桿菌CIE檢測陽性率51.7%（31/60）。（4）細菌核酸檢查已有人在試用，聚合酶鏈反應法檢查細菌特異性核酸片段，但敏性和特異性尚不夠穩定，仍在研究中。（5）免疫學檢查用酶聯免疫吸附試驗檢測則爛困特異性免疫球蛋白M（IgM）抗體，用反向血凝試驗檢測細菌抗原，比細菌培養更快獲得結果。（6）其他檢查依據患者感染部位可選擇進行X線拍片、CT等檢查以協助診斷。肺炎者X線表現與肺炎球菌肺炎相似。2.血象血白細胞計數，輕症者可在正常范圍，重症者則可增高達10×10 /L以上，中性可佔80%以上。3.腦脊液檢查與其他化膿菌引起者相似，蛋白增多，糖和氯化物減少，白細胞計數增多達1000×10 /L以上，多核細胞佔多數。

8. 微生物檢驗標本的正確採集及注意事項(2)

微生物檢驗標本的正確採集及注意事項

六、泌尿道

根據衛生部《醫學感染診茄棗斷標准》（試行）通知，泌尿系統臨床診斷為：患者出現尿頻、尿急、尿痛等尿路刺激症狀，或有下腹觸痛、腎區叩痛、伴或不伴發熱，並具有下列情況之一：

（1）尿檢白細胞男性≥5個/高倍視野，女性≥10個/高倍視野，插導尿管患者應結合尿培養;

（2）臨床已診斷為泌尿道感染，或抗菌治療有效而認定的泌尿道感染。

1、中段尿

（1）採集方法

①女性 采樣前用肥皂水或0。1%的高錳酸鉀溶液沖洗外陰，用手指陰x分開排尿，棄其前段尿，不終止排尿，留取中段尿10ml於滅菌容器內。

②男性 用肥皂水清洗尿道口，或0。1%的碘伏溶液消毒尿道口，滅菌紗布擦乾，上翻包皮，棄其前段尿，不終止排尿，留取中段尿10ml於滅菌容器內。

（2）注意事項

①導尿雖然可以減少污染，但是多次重復導尿可以造成逆行性感染，因此近年來大多採用中段尿。

②女性病人最好採取膀胱截石位由護士採取標本，減少污染。

③採集標本以晨起第一次尿液為佳。

④採集標本後，若不能在1h內送檢，暫放4℃冰箱，但不能超過8h。若尿液標本在室溫下放置超過2h，即使接種培養結果細菌數≥104 cfu/ml獲103cfu/ml，也不能作為診斷依據，應重新留取標本送檢。

⑤疑為尿道炎時可將最初3—4ml尿液收集在滅菌容器內。該尿中即使有少數細菌，如反復檢查為同一細菌，也應考慮為病原菌。

⑥兒童在多數情況下，僅沖洗外陰是不夠的，故採集標本較為困難。如果尿內細菌明顯增多，可以高度懷疑為蠢派尿路感染，無菌則可否定。

⑦若細菌培養結果為兩種或兩種以上細菌，需考慮污染可能，建議重新留取標本送檢。

⑧尿液中不得加入防腐劑，消毒劑否則影響陽性檢出率。

2、膀胱穿刺採集法

避免污染是很困難的，培養結果與病情不符時，或尿厭氧菌培養，或嬰幼兒中段尿採集困難時，可以用恥骨上穿刺膀胱內采尿。

3、留置導尿者採集法

拔去閉式引流的集尿袋，棄去導尿管前段尿液，留無污染的膀胱內尿液10ml送檢。不可從集尿袋下端留取標本。

七、腦脊液

1、採集方法

由臨床醫師以無菌方法收集腦脊液3—5ml（細菌1ml，真菌2ml抗酸桿菌2ml，病毒1ml）盛於無菌試管或小瓶中立即送檢。

2、注意事項

（1）採集標本後立即送檢，因腦膜炎奈瑟菌離體後迅速自溶，肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌也易死亡;

（2）疑為上述細菌感染時，應注意保溫，不可置冰箱或低溫保存。

八、膽汁

1、十二指腸引流法

在無菌操作下，將十二指腸導管吞咽至十二指腸乳頭部（距齒65—70cm）時，收集A液（來自總膽管，為橙黃或金黃色），隨之注入25%硫酸鎂溶液40ml，經1—2min後再採取B液（來自膽囊，為棕黃綠色），隨後收取C液（來自肝膽管，為檸檬色），一般認為B液做細菌培養意義較大。

2、膽囊穿刺法

膽囊造影術時，可同時採取膽汁。

3手術採取法

由總膽管、膽囊直接穿刺採取膽汁。

以上採集之標本應立即送檢，否則置於4℃冰箱內，採集時需小心，避免被唾液、十二指腸液細菌污染。

九、穿刺液標本

穿刺顫檔拆液包括胸水、腹水、心包液、關節液、鞘膜液。

1、採集方法

由臨床醫師行穿刺術抽取。胸腹水可收集5—10ml，心包液、關節液收集2—5ml，置於無菌含抗凝劑的試管或小瓶中，充分混勻後，立即送檢。抗凝劑10%EDTA二鈉鹽，標本與抗凝劑之比10：1。

2、注意事項

⑴標本採集應在患者用葯之前或停止用葯1—2天後進行;

⑵不能立即送檢可置4℃冰箱保存;

⑶疑為淋病性關節炎患者的關節液，採集後立即送檢，或床旁培養為佳;

⑷不能用棉拭子浸蘸標本送檢。

十、膿汁及病灶分泌物

1、傷口

⑴表面傷口拭子採集方法及注意事項

① 僅限於皮膚與皮下組織，包括手術切口、褥瘡潰瘍、新生兒臍炎、嬰兒膿瘡病。

②用無菌生理鹽水或75%的酒精擦去病灶表面滲液;

③用無菌棉拭子抹去及較深部的膿汁分泌物或組織送檢;

④採集褥瘡潰瘍標本時應採集褥瘡邊緣的膿性分泌物，拭子放在運送培養基中立即送檢，不要採集創口表面的滲液。

⑵傷口、膿腫、竇道、壞疽組織採集方法及注意事項

①閉鎖性膿腫用碘酒和酒精消毒皮膚後，用滅菌注射器穿刺抽取全部膿液送檢，疑為厭氧菌感染時，排去針管內空氣將針頭插入滅菌橡膠塞內送檢;

②傷口處若有膿及滲出物要用無菌棉簽深入各種竇道中擦拭，用小刀刮取，穿刺抽吸或手術切除獲得深處傷口標本;

③當創傷出血時，敷有葯物在2h以內及燒傷在12h內均不應採集標本，此時獲得陽性結果機會甚少。

④採集標本注意觀察膿汁及分泌物性狀、色澤、氣味等。可為培養鑒定提供依據。

⑶燒傷創面

①燒傷創面需要膿性分泌物，焦痂迅速分離變棕黑、黑或紫羅蘭色，燒傷邊緣水腫。患者發燒>38℃或低體溫<36℃，合並低血壓。

②用無菌生理鹽水沖洗傷口創面。

③由於創面部位不同，細菌種類也不盡相同，要用滅菌棉拭子採集多個部位的炎症區送檢。

④採集痂下變黑或變性的不健康區邊緣或引流液等做定量培養及組織活檢。

2、厭氧傷口拭子

⑴厭氧專用棉棒或玻璃棒觸及深部膿汁;

⑵可用注射器抽吸，排去針管內空氣將針頭插入滅菌橡膠塞內送檢;

⑶立即送檢，送檢過程中必須保持在無氧條件;

⑷不宜做厭氧菌培養的有痰、喉拭子、鼻咽拭子、齒齦拭子、直腸、陰道和宮頸拭子以及回腸、結腸造瘺術的流出物，胃、小腸及大腸內容物等。

3、尿道口分泌物拭子

⑴男性用無菌紗布擦拭和清洗尿道口，然後採取從尿道口溢出的膿性分泌物;

⑵採集前列腺液時，先將尿道、膀胱沖洗，然後從肛門用手指按摩前列腺，促使前列腺液溢出;

⑶女性病人先用滅菌紗布或棉拭子仔細擦拭或清洗尿道口，然後從陰道內診壓迫尿道，使分泌物溢出;

⑷取子宮頸分泌物，先用內窺鏡擴張陰道，然後從宮頸口用滅菌棉拭子採取分泌物，盡量避免被陰道宮頸附近正常菌群的污染。

4、蜂窩織炎

⑴用無菌生理鹽水或酒精消毒皮膚;

⑵用細針在炎症最顯著處穿刺吸引;

⑶抽少量滅菌生理鹽水在針管內;

⑷注入無菌試管內送檢。

5、組織標本

⑴活體組織採取的微量標本，可直接接種在培養基內;

⑵表淺組織可直接用棉拭子擦拭、小刀颳去;

⑶較大組織塊的表面可採用燒灼或浸入沸水中5—10s，然後用滅菌剪刀切開，取其中的膿汁;

⑷深部組織標本可經皮膚穿刺或手術切取送檢;

⑸組織標本不可用福爾馬x固定;

⑹有時也可將沾有膿汁的最內層敷料放入無菌平皿內送檢。

十一、眼標本採集

⑴一般細菌，以無菌棉拭子採集眼分泌物，尤其膿性分泌物;

⑵沙眼衣原體，首先擦去眼結膜上面的分泌物，然後用無菌小刀刮取穹窿部及眼結膜上皮細胞，用鏈黴素處理後備用;

⑶對於剛治療或葯物沖洗過的患者最好12—24h後採集標本;

⑷對於淚囊炎患者可稍加擠壓後以無菌棉拭子採集標本。

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9. 病原微生物中細菌常見檢測方法有哪些

1、快速測試片技術法

快速測試片是指以紙片、紙膜、膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在上面，通過微生物在上面的生長、顯色來測定食品中微生物的方法。

細菌總數檢測紙片的研製始於 20 世紀 80 年代，其主要優點是簡便、實用、經濟、操作性強。近年來以濾紙和美國某公司的 Petrifilm 為載體的測試片已開始被廣泛應用。

2、生物電化學方法

生物電化學方法是指通過電極測定微生物產生或消耗的電荷，從而提供分析信號的方法。微生物在滋生代謝過程中，培養基的電化學性質如電流、電位、電阻和電導等會發生變化，所以可以通過檢測分析這些電化學參量的變化來實現對微生物的快速測定。

常見的有：阻抗分析法、電位分析法、電流分析法等。生物電化學方法具有測量快速、直觀、操作簡單、測量設備成本低和信號的可控性等特點。

3、微菌落技術

微菌落是指細菌生長繁殖早期在固相載體上所形成的只能藉助於顯微鏡觀察的微小菌落。微菌落技術具有快速、經濟、實用的特點，其研究始於 20 世紀50年代，定量測定技術從 20 世紀 70 年代開始，國外已有報道將該法應用於水、食品中細菌總數的快速檢測。

4、氣相色譜法

氣相色譜應用到微生物的檢測中，主要是依據不同微生物的化學組成或其產生的代謝產物各異，利用上述色譜檢測可直接分析各種體液中的細菌代謝產物、細胞中的脂肪酸、蛋白質、氨基酸、多肽、多糖等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

5、高效液相色譜法

利用高效液相色譜檢測可分析各種體液中的細菌代謝產物、病原微生物等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

10. 溶血嗜血桿菌Haemophilus haemolyticus和流感嗜血桿菌Haemophilus influenzae

嗜血桿菌屬常見的兩個致病菌為 流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae)和 杜克雷嗜血桿菌 (Haemophilus creyi)。 溶血嗜血桿菌 是人呼吸道定植的共生菌，經常和流感嗜血桿菌混淆，但少有引起疾病的報道。但有研究證明，溶血嗜血桿菌可引起侵襲性感染性疾病。症狀和流感嗜血桿菌是不同的。為提高檢出陽性率和正確率，有必要使用PCR和常規微生物檢測方法共同進行。

溶血嗜血桿菌和流感嗜血桿菌不同於其他嗜血桿菌屬細菌，前者生長時需要血紅素（hemin,X facteor)和煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD,V factor)。莢膜型流感嗜血桿菌能夠形成6種不同結構的莢膜，而溶血嗜血桿菌沒有莢膜，可以使用片子凝集試驗(slide agglutination assay )確定。而無莢膜和不定型流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌從形態、生化、和遺傳性上很難區分。

（1）溶血嗜血桿菌有明顯的馬血瓊脂β溶血反應；但是也受多種因素影響，溶血嗜血桿菌丟失到溶血反應；
（2）90%以上的溶血嗜血桿菌可產生硫化氫（H2S）；少部分流感嗜血桿菌biotype IV也可產生硫化氫。
（3）流感嗜血桿菌攜帶蛋白D（hpd）基因和墨角藻糖激酶（fucK），如果兩個基因都具有，則強提示是流感嗜血桿菌；有部分溶血嗜血桿菌攜帶hpd基因，但是是種特異性的。
（4）兩者的16S rRNA形成不同的進化簇；

結合表型和遺傳學分析可提高兩者的識別正確率。

溶血嗜血桿菌可分離自血液、關節滑液、胰腺組織。引起的病症多為菌血症、帆乎膿毒性關節炎、腹膜炎、心內膜炎等，病人多免舉碰疫低低下（有基礎性疾病（癌症、態答悉COPD、心衰、肝炎、酗酒、糖尿病）或者外傷導致（外科手術、槍傷））。

In addition to the hpd and fucK genes, other biomarker genes have been proposed to differentiate H. haemolyticus from H. influenzae , such as the H. influenzae adherence and penetration protein gene hap , the [Cu, Zn]superoxide dismutase gene sodC , the immunoglobulin A protease gene iga , and the outer membrane protein P6 ( 4 , 13 , 16 – 18 , 24 ). The hpd and iga genes are more reliable than the fucK , hap , sodC , and protein P6 genes for distinguishing the two organisms ( 2 , 4 , 12 – 14 , 23 , 24 ). 16S rRNA gene sequencing is used for identification of bacterial species ( 20 ), but the low bootstrap value ( Fig. 1 ) has suggested that single gene sequences may not be able to phylogenetically discriminate H. haemolyticus and H. influenzae . McCrea et al. have shown that concatenated sequences of multiple genes, including the 16S rRNA gene, adk (adenylate kinase gene), pgi (glucose-6-phosphate isomerase gene), recA (recombination protein gene), and infB (translation initiation factor 2 gene), separate the two species into distinct clusters ( 13 )

J Clin Microbiol . 2012 Jul; 50(7): 2462–2465.]
[Haemophilus haemolyticus Isolates Causing Clinical Disease]
[ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3405640/]
doi: [10.1128/JCM.06575-11]
2012-6, Article