移液槍檢測弧菌方法

『壹』 副溶血弧菌的檢測方法

用高鹽血瓊脂培養基，在限定的條件下培養副溶血性弧菌時出現的溶血反應，稱此溶血性能為「神奈川現象」。
此試驗要求是用人或兔的新鮮紅血球制備高鹽血平板，經37℃、24h培養，如在單個菌落周圍呈現透明溶血環或在菌落下面有明顯溶血者，為「神奈川現象」陽性，若不出現透明溶血環或無明顯溶血者，為「神奈川現象」陰性。有致病性的副溶血性弧菌，多數為神奈川現象陽性，但亦有少數為陰性。 副溶血性弧菌有三種抗原，即O抗原（菌體抗原），K抗原（莢膜抗原）及H抗原（鞭毛抗原），其中血清學分類上有意義的是前兩謹侍祥者：O抗原有13種血清群，K抗原有65種血清型。
進行副溶血性弧菌血清學鑒定時，可用O抗原分群，將18-24h的培養物，用3%食鹽水作成較濃的菌懸液，121℃高壓1h或100℃煮沸後，用此菌懸液進行O抗血清玻片凝集試驗，同時用無菌生理鹽水作對照，如O凝集反應陽性時，可用祥搏不經加熱的菌懸液進行K抗血清玻片凝集反應分型判定。天津生物晶元公司的診斷血清產品覆蓋了該菌所有的O血清群及K血清型。 所有副溶血弧菌分離株都含有不耐熱溶血毒素（TLH），這種溶血素是副溶血弧菌所特有的，因此它的編碼基因tlh基因常被用作檢測副溶血弧菌的靶基因。而tlh並不是一個毒素基因，真正與致病相關的是副溶血弧菌的耐熱直接溶血素（TDH）和溶血相關溶血素（TRH），因此它們的編碼基因tdh、tlh基因常被用作副溶血弧菌致病性檢測的特異基因。基於此，天津生物晶元推出一系列常規PCR試劑盒及熒光PCR試劑盒。
1）常規PCR：鑒定標準是通過電泳談肢來判斷是否有擴增的核酸片段以及擴增產物的大小是否正確。
2）實時熒光PCR：通過對實時熒光PCR反應的每一個循環產物進行熒光信號的實時監測來判斷分析。

『貳』 革蘭氏染色法

革蘭氏染色法的原理
革蘭氏染色法的原理： 簡單來說：通過結晶紫初染和碘液媒染後，在細菌細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的復合物，再用95%乙醇脫色。

具體來說：通過結晶紫初染和碘液媒染後，在細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯緻密，故遇乙醇脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色； 而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色數衡答劑後，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而鬆散的肽薯慧聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色後仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。 G﹢菌：細胞壁厚，肽聚糖網狀分子形成一種透性屏障，當乙醇脫色時，肽聚糖脫水而孔隙縮小，故保留結晶紫-碘復合物在細胞膜上。

呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯鬆散，乙醇脫色不能使其結構收縮，其脂含量高，乙醇將脂溶解，縫隙加大，結晶紫-碘復合物溶出細胞壁，番紅染液復染後呈紅色。

(2)移液槍檢測弧菌方法擴展閱讀：革蘭氏染色法，是指細菌學中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法，屬於復染法。這種染色法是由丹麥醫生攔肆革蘭於1884年所發明，最初是用來鑒別肺炎球菌與克雷伯肺炎菌。

革蘭染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟。未經染色的細菌，由於其與周圍環境折光率差別甚小，故在顯微鏡下極難區別。

經染色後，陽性菌呈紫色，陰性菌呈紅色，可以清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些結構特徵，從而用以分類鑒定。 操作流程：革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是： （1）載玻片固定。

在無菌操作條件下，用接種環挑取少量細菌於干凈的載玻片上塗布均勻，在火焰上加熱以殺死菌種並使其粘附固定。 （2）草酸銨結晶紫染1分鍾。

（3）自來水沖洗，去掉浮色。 （4） 用碘-碘化鉀溶液媒染1分鍾，傾去多餘溶液。

（5）用中性脫色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脫色30秒，革蘭氏陽性菌不被褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌被褪色而呈無色。酒精脫色為整個流程最關鍵的一步。

（6）用蕃紅染液或者沙黃復染30秒，革蘭氏陽性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌即被區別開。

參考鏈接：網路-革蘭氏染色法。
革蘭氏染色法的原理
通過結晶紫初染和碘液媒染後，在細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯緻密，故遇乙醇脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑後，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而鬆散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色後仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

(1)載玻片固定。在無菌操作條件下，用接種環挑取少量細菌於干凈的載玻片上塗布均勻，在火焰上加熱以殺死菌種並使其粘附固定。

(2)草酸銨結晶紫染1分鍾。

(3)自來水沖洗，去掉浮色。

(4) 用碘-碘化鉀溶液媒染1分鍾，傾去多餘溶液。

(5)用中性脫色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脫色30秒，革蘭氏陽性菌不被褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌被褪色而呈無色。酒精脫色為整個流程最關鍵的一步。

(6)用蕃紅染液或者沙黃復染30秒，革蘭氏陽性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌即被區別開。
革蘭氏染色法
革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫師Gram創立 細菌先經鹼性染料結晶染色，而經碘液媒染後，用酒精脫色，在一定條件下有的細菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），後者為革蘭氏陰性菌（G—）。

為觀察方便，脫色後再用一種紅色染料如鹼性蕃紅等進行復染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。

有芽胞的桿菌和絕大多數和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應；弧菌，螺旋體和大多數致病性的無芽胞桿菌都呈現負反應。 [原理]：革蘭氏染色目前有三種觀點：等電點學說、化學學說和滲透學說。

1. 等電點學說，革蘭氏陽性菌的等電點在PH2-3，比陰性菌（PH4-5）低，加之碘為弱氧化劑，可降低革蘭氏陽性菌的等電點，致使兩類菌的等電點差異擴大，因此陽性菌和鹼性染料的結合力比陰性菌更強。 2.化學學說，碘液在菌體內與結晶紫結合後又和菌體內核糖核酸鎂鹽-蛋白質復合物結合，此結合物不易被丙酮酒精脫掉，呈革蘭氏染色陽性。

因革蘭氏陰性菌缺乏核糖核酸鎂鹽，故對碘與結晶紫結合物攝取少，且不牢固，易被丙酮酒精脫色而呈革蘭氏染色陰性。 3.滲透學說，乙醇使陽性菌所含粘肽多糖脫水而致細胞壁間隙縮小，通透性降低，在菌體內保留了染料-碘復合物，呈紫色。

陰性菌含粘肽少，細胞壁變化不大，通透性不受影響，菌體內的染料-碘復合物較易透出，失去紫色，被復染成為紅色。 [試劑]：Crystal violet（結晶紫）、Gram Iodine（碘液）、Decolourizer（丙酮酒精）、Safranin（稀釋沙黃） [操作]： 1.標本處理：（1）.有菌部位的標本，如痰液、糞便、各種拭子、創面等可直接塗片。

（2）.無菌部位的標本，如腦脊液、胸水、腹水、膽汁、尿液、關節液等，應取適量標本（最高可達5-7ml），經3000rpm 離心10min.，取沉渣塗片染色。 2.塗片製作：菌液塗片時，用接種環沾取菌液點在載玻片上，標本可直接在玻片上塗布；菌落塗片時，先取生理鹽水一滴，置玻片上，用接種針挑取菌落在鹽水中塗布。

製作的塗片應自然乾燥，並經火焰固定，固定的溫度不宜過高，以玻片背面接觸手背不燙為准，否則可能使細菌形態改變。將固定後的塗片進行染色。

3. 染色方法： （1）.加上Crystal violet（結晶紫）後，染色3-5秒或更久，之後用自來水沖洗之。 （2）.加上Gram Iodine（碘液）後染色3-5秒或更久，之後用自來水沖洗之。

（3）.以Decolourizer（丙酮酒精）脫色約5-10秒，並用自來水沖洗之。 （4）.加上Safranin（稀釋沙黃）後，染色3-5秒或更久，之後用自來水沖洗之。

（5）.吸干或在空氣中涼干後，置油鏡鏡檢。 4.結果觀察：紫色為革蘭氏陽性，紅色為革蘭氏陰性。

[報告方式]：革蘭氏染色：檢出革蘭氏陽性球菌 ；革蘭氏陰性球菌 檢出革蘭氏陽性桿菌 ；革蘭氏陰性桿菌 [注意事項]： 1.標本塗片不能太厚，嚴格按操作要求進行。 2.玻片通過火焰溫度不能太高。

3.若塗片較厚，應延長脫色時間，直至不在出現紫色為止。 [臨床意義]：通過革蘭氏染色，將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，便於臨床治療。

[附] 1 沙黃（番紅）Safranine T [C20H19ClN4=350.85] 紅棕色粉末；鹼基性染料。在水中溶解，在乙醇中易溶。

2 碘液配製：0.01mol/l碘液——稱取1.3g碘，置於50mol燒杯中，加入2.5g碘化鉀及25毫升蒸餾水，不斷攪拌之，使其溶解均勻。再加0.2mol濃鹽酸（體積質量1.19g/cm3），再加蒸餾水稀釋到1000mol。

溶液應貯藏在棕色試劑瓶中，儲於低溫暗櫥內。有效期為一個月左右 革蘭氏陰性菌，以[大腸桿菌]為代表。

大腸桿菌為兼氣性菌種，一般生存於腸道中及厭氧的還境中。革蘭氏陰性菌細胞壁的特徵為有一層out member 與陽性菌種不同。

目前對大腸桿菌的研究很多，除了它是一般食物中是否有被污染的指標外，很多分子生物學方面的研究皆需要使用到大腸桿菌當作實驗宿主。
【革蘭氏染色法he染色法姬姆薩染色法銀染色法的機理可以舉一些的
初染劑結晶紫進行初染，再用碘液媒染，然後用乙醇（或丙酮）脫色，最後用復染劑（如番紅）復染.經此方法染色後，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色（紅色），該菌屬於革蘭氏陰性菌.革蘭氏染色法所以能將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細菌細胞壁的結構和組成不同決定的.實際上，當用結晶紫初染後，像簡單染色法一樣，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色.碘作為媒染劑，它能與結晶紫結合成結晶紫一碘的復合物，從而增強了染料與細菌的結合力.當用脫色劑處理時，兩類細菌的脫色效果是不同的.革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網狀結構組成，壁厚、類脂質含量低，用乙醇（或丙酮）脫色時細胞壁脫水、使肽聚糖層的網狀結構孔徑縮小，透性降低，從而使結晶紫-碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內，經脫色和復染後仍保留初染劑的藍紫色.革蘭氏陰性菌則不同，由於其細胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂質被乙醇（或丙酮）溶解，細胞壁透性增大，使結晶紫-碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染後，細胞被染上復染劑的紅色.。
什麼是革蘭氏染色法？染色過程應注意什麼
一、定義 革蘭氏染色法是由1884年由丹麥醫師Gram創立的一種復染色法，用以清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些結構特徵，對其進行分類鑒定。

二、染色原理 1、G﹢菌：細胞壁厚，肽聚糖網狀分子形成一種透性屏障，當乙醇脫色時，肽聚糖脫水而孔隙縮小，故保留結晶紫-碘復合物在細胞膜上。呈紫色。

2、Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯鬆散，乙醇脫色不能使其結構收縮，其脂含量高，乙醇將脂溶解，縫隙加大，結晶紫-碘復合物溶出細胞壁，番紅染液復染後呈紅色。三、染色目的 在細胞發放之前，利用標準的革蘭氏染色法對即將發放的細胞懸液進行檢測，判斷細胞懸液中是否含有革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌。

四、染色方法步驟 1 、塗片：取滅過菌的載玻片於實驗台上，用移液槍吸取10ul待檢樣品滴在載玻片的中央，用燒紅冷卻後的接種環將液滴塗布成一均勻的薄層，塗布面不宜過大。 2、 乾燥：將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。

3、固定：固定常常利用高溫，手持載玻片的一端，標本向上，在酒精燈火焰處盡快的來回通過2-3次，共約2-3秒種，並不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃），放置待冷後，進行染色。 4、 初染：在塗片薄膜上滴加草酸銨結晶紫1-2滴，使染色液覆蓋塗片，染色約1min。

5 、水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。 6 、媒染：用100-1000ul移液槍吸取約300ul碘液滴在塗片薄膜上，使染色液覆蓋塗片，染色約1min。

7 、水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。 8 、脫色：斜置載玻片，滴加95%乙醇脫色，至流出的乙醇不現紫色為止，大約需時20-30S，隨即水洗。

9 、復染：在塗片薄膜上滴加沙黃染液1-2滴，使染色液覆蓋塗片，染色約1min。 10 、水洗：斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。

11 、乾燥、觀察：用吸水紙吸掉水滴，待標本片干後置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發現目的物後滴一滴浸油在玻片上，用油鏡觀察細菌的形態及顏色，紫色的是革蘭氏陽性菌，紅色的是革蘭氏陰性菌。五、注意事項 1、革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色。

如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受塗片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規定。

2、染色過程中勿使染色液乾涸。用水沖洗後，應吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。

3、選用幼齡的細菌。G+菌培養12h-16h,E.coli培養24h。

若菌齡太老，由於菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。
什麼是革蘭染色法？其原理、結果和意義
革蘭染色法由丹麥病理學家Christain Gram於1884年創立，是細菌學中很重要的鑒別染色法，因為通過此法染色，可將細菌鑒別為革蘭陽性菌（G+）和革蘭陰性菌（G-）兩大類。

原理：

G﹢菌：細胞壁厚，肽聚糖網狀分子形成一種透性屏障，當乙醇脫色時，肽聚糖脫水而孔隙縮小，故保留結晶紫-碘復合物在細胞膜上。呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯鬆散，乙醇脫色不能使其結構收縮，其脂含量高，乙醇將脂溶解，縫隙加大，結晶紫-碘復合物溶出細胞壁，番紅染液復染後呈紅色。

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

(1)載玻片固定。在無菌操作條件下，用接種環挑取少量細菌於干凈的載玻片上塗布均勻，在火焰上加熱以殺死菌種並使其粘附固定。

(2)草酸銨結晶紫染1分鍾。

(3)自來水沖洗，去掉浮色。

(4) 用碘-碘化鉀溶液媒染1分鍾，傾去多餘溶液。

(5)用中性脫色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脫色30秒，革蘭氏陽性菌不被褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌被褪色而呈無色。酒精脫色為整個流程最關鍵的一步。

(6)用蕃紅染液或者沙黃復染30秒，革蘭氏陽性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌即被區別開。

『叄』 水產養殖中對於池塘底質中弧菌的檢測方法

水禪羨飢產養殖中對於池塘底質中弧菌的檢測方法：抓一把池底的沙子混合少量池水，搖勻後，測瓶里水中弧菌。

預防池底弧菌對早期蝦苗的影響方法：

1. 放養優質健康的蝦苗是關鍵，減少苗帶菌的情況。

2. 放苗後3天檢測一次弧菌，在天氣變化時，尤其重視做到2天一測，做到早發現早預防。因為弧菌的繁殖速度超快，一個弧菌分裂繁殖一代（2個弧菌）也只需要10分鍾。一個池塘水體中肯定不止一個弧菌，有時我們感覺可能會超標時，建議在檢測的同時，就先預防加以控制，因為很可能在我們檢測結果還未出來的那10幾個小時里，弧菌不斷繁殖，蝦就開始發病了。

3. 控制弧菌，盡量採用菌相+藻相+蛭弧菌的生物控制方案，不到非用不可，盡量減少消毒劑的使用。

4. 管理好水質和底質也是弧菌防控的關鍵。

5. 養殖動物和養殖水體是一個有機整體，我們在處理好水質的同時一定不要忽略養殖動物本身，本身體質好，抵抗力就強，攜帶的病原菌相對較少，反之則多，在養殖過程中會隨代謝物排入水體污染水質，增加弧菌爆發的幾率。因此在處理水環境的同時派磨加強賀返內服是關鍵。

6. 加大增氧，提高水體溶解氧含量，對抑制弧菌有明顯效果。

7. 在放苗前，降低水體鹽度可減少弧菌感染的機會。

『肆』 檢測霍亂弧菌都會用到實驗室儀器 列個清單哦

設備和材料
3.1 冰箱： -20℃～4℃。
3.2 恆溫培養箱： 36±1℃。
3.3 暗視野顯微鏡： 10×～100×。
3.4 架盤葯物天平： 0g～500g, 精確至0.5g。
3.5 錐形瓶： 100 mL、500 mL。
3.6 滅菌吸管： 1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。
3.7 滅菌平皿： 直徑90 mm。
3.8 滅菌試管： 16 mm×160 mm.。
3.9 潔凈的載玻片。
3.10 潔凈的蓋玻片。
3.11 接種環。
3.12 生物安全櫃：Ⅱ級。
4.培養基和試劑
4.1鹼性蛋白腖水。（pH8.4-8.6，8-10 mL）
4.2慶大霉褲州素瓊脂。（培養基加熱煮沸3次；一份源純陸標本用一塊90mm平皿）
4.3霍亂弧菌診斷血清：O1群和O139群霍亂弧菌診斷血清（標明名稱、日期；稀釋後的診雹頃斷血清放4-8℃保存，當年使用；未稀釋的診斷血清冷凍保存，有效期內使用

『伍』 弧菌稀釋液是什麼

弧菌稀釋液是一種用於處理食品和水樣品的培養基。弧菌是海洋中常見的細菌，是一種厭氧細菌，能夠仿念引起人類和動物腸胃道感染。因此，弧菌稀釋液通常用於檢測食品、食品加工廠以及其他熱帶和亞熱帶地區水源中是否存在弧菌。

弧菌稀釋液的制備方法包括將稀襪孝釋液加入含有營養物質的培養基中，並進行適當的混合和發酵處理，從而獲得含有一定濃度的弧菌的培養基。常見的弧菌稀釋液中會添加一定量的鹽和營養物質，以提供弧菌生長的必要條件。

通常，在進行食品或水樣檢測時，需要將待檢測樣品加入到弧菌稀釋液中，然後通過置於恰當的環境下進行培養，觀察是否有弧菌的生長出現。這種方法可以在短時間備好睏內對弧菌進行快速檢測，以便進行必要的措施，防止疾病的傳播。

『陸』 甘油保存菌種的方法，保存菌種的溫度

回答
1、方法:准備好鑷子、EP管、槍頭等工具，並進行殺菌處理;手和鑷子用酒精擦拭消毒，用鑷子取出約10支的EP管放到試劑盒裡;找到移液槍，取出50%的甘油(等體積蒸餾水加等體積甘油，甘油需要慢慢吸)放到EP管裡面，再取出菌種放到EP管裡面;最後把所有的菌種都裝入到一個大袋子里蓋好蓋子標注好保存起來，放入-20°C的冰箱里保存。2、溫度要求:長期保存，建議在-70°C下凍存;短期保存，可在-20°C保存。
一、甘油保存菌種的方法
1、原料/工具
甘油、鑷子、EP管、移液槍。
2、方法/步驟
(1)准備工具並殺菌:准備好鑷子、EP管、槍頭等工具，把這些工具放到高壓轎配纖滅菌的鍋里進行殺菌。
(2)把EP管放入試劑盒:用酒精將手和鑷子擦拭消毒，用鑷子取出約10支的EP管放到試劑盒裡。
(3)把甘油和菌種放入EP管:找到移液槍，取出50%的甘油(甘油稀釋至50%濃度的方法:等體積蒸餾水加等體積甘油，甘油需要慢慢吸)放到EP管裡面，再取出菌種放到EP管裡面。
(4)保存並放入冰箱:把所有的菌種都裝入到一個大袋子里蓋好賣巧蓋子標注好保存起來，放在-20°C的冰箱里保藏。
二、甘油保存菌種的溫度
1、甘油保存菌種，閉仿若是長期保存，建議在-70°C下凍存，保藏時間一般為2-4年左右;在-20°C保存時間較短，通常只有1年左右。目前實驗室大都採用-80°C(-70°C)冰箱保藏。
2、甘油冷凍保藏菌種是目前實驗室應用最為廣泛的一種的菌種保藏方法，原理是以甘油為保護劑，低溫冷凍條件下，使微生物的新陳代謝趨於停止，從而達到長期有效的保藏。一般來說，保藏溫度越低，保藏效果越好。這種方法適用於一般細菌的保存，同時也適用於鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種。

『柒』 養殖生產過程中如何檢測水體中的弧菌含量

將採集的水樣進行弧菌培譽螞養計數。採用平板慶培埋計數，將水樣加吐溫80℃後搖床震盪30分鍾，10倍系列中差稀釋，塗布弧菌選擇性TCBS培養基，在28℃恆溫條件下，培養48小時後計數。

『捌』 霍亂弧菌的檢測方法

根據弧菌O抗原不同，分成Ⅵ個血清群，第Ⅰ群包括霍亂弧菌的兩個生物型。第Ⅰ群A、B、C三種抗原成份可將霍亂弧菌分為三個血清型：含AC者為原型（又稱稻葉型），含AB者為異型（又稱小川型），A、B、C均有者稱中間型（彥島型）。
1992年10月在印度東南部又發現了一個引起霍亂流行的新血清型菌株（0139），它引起的霍亂在臨床表現及傳播方式上與古典型霍亂完全相同，但不能被01群霍亂弧菌診斷血清所凝集，抗01群的抗血清對0139菌株無保護性免疫。在水中的存活時間較01群霍亂弧菌長，因而有可能成為引起世界性霍亂流行的新菌株，推薦使用天津生物晶元生產的霍亂弧菌診斷血清。 1,普通聚合酶鏈反應法
核酸擴增技術，即聚合酶鏈式反應（polymerase chainreaction，PCR），其基本原理是設計、合成兩條寡核苷酸，作為引物，對應於待測病原微生物某一段特異性序列的兩端，然後在體外模擬DNA體內復制的過程反復擴增，使靶序列放大上萬倍甚至上百萬倍而被檢測出來。一般選擇霍亂腸毒素(cholera enterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作為靶基因。一些非產毒株(如環境來源的菌株)有可能通過基因水平轉移獲得毒力基因成為產毒株，若僅檢測ctx基因容易造成漏檢。因此，霍亂弧菌的其他重要基因，如毒力協同調節菌毛A基因(tcp A)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表達調控基因(toxR)等也被選用為PcR的靶基因，這大大提高了檢測的特異度.
2 ,多重PCR法
與常規PCR相比，多重PCR一次反應可檢測多個基因，節省了時間和成本。國內、外許多學者選用霍亂弧菌的毒素基因ctx、tcp與其他基因如ompW、rfb、hly進行組合，作為共同的靶基因，克服了由於毒力基因特異度不夠高而造成的假陽性。多重PcR同時可准確區分不同血清型的霍亂弧菌和快速鑒定其是否為產毒株，可謂一舉多得，大大提高了檢測效率。
3.熒光定量PCR法
熒光定量PCR自動化程度高、特異性強、無交叉污染，在霍亂弧菌的快速診斷中得到廣泛應用。尤其是近年來，隨著引物與探針的設計更精確、多通道熒光PCR儀的開發與廣泛使用，多重熒光定量PCR技術日臻成熟，並以其高通量、低成本、高效率等優點而廣泛應用於病毒、細菌、真菌等多種病原體的快速檢測，成為應用的熱點. 與PCR方法相比，基因晶元技術能同時獲得更多病原學、生物學方面的信息，從而更為全面地分析、掌握病原微生物的特徵。Vora等[12]運用基因晶元技術對多種致病性弧菌的毒力、毒素、耐葯基因及潛在的毒力基因進行全面分析，對掌握這些細菌的致病性及進行有效預防、控制等具有重要意義。但基因晶元成本較高，距離推廣應用尚需時間等待 。

『玖』 微生物菌落檢測中，這樣的菌是什麼細菌

細菌菌落總數是微生態制劑樣品檢測必做的一項指標。菌落總數檢測同其他檢驗一樣，也存在檢測誤差。平板計數法是檢測飼料中細菌總數、活酵母數、芽孢桿菌數及空陵乳酸菌數的常用方法之一，因此，該值准確與否直接關繫到微生物飼料添加劑類產品的質量好壞。微生物平板計數的通常方法為每個樣品用 3個稀釋度，每個稀釋度常做 3個重復。但如何對平板菌落進行正確計數、3個稀釋度以哪一個稀釋度進行計數及微生物檢測允許誤差等問題，在飼料標准中並未有所規定，而這些問題與統計值的准確性密切相關。我們就實際檢測芽孢桿菌工作中遇到一些菌落計數的問題，與大家進行探討。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1樣品：隨機抽取微生態飼料添加劑合生素樣品3份。
1.1.2培養基：營養瓊脂。
1.1.3儀器設備：磁力攪拌器，無菌培養皿，培養箱，振盪器。
1.2 試驗方法
1.2.1樣品的振盪時間對菌數檢測的影響
選擇1個樣品，稱取10 g，放入無菌錐形瓶內，加入90 mL無離子水，磁力攪拌分別為l0、20、30、40和60 min。
用1 mL移液槍從中吸取1 mL樣品懸濁液加入到盛有9 mL去離子水的試管中，用振盪器使樣品充分均勻，以此類推，製成10-1～1O-7不同稀釋度的樣品溶液。
平板塗布法檢測菌含量：用移液槍從樣品稀釋液中各吸取200uL，每個樣品稀釋液3個重復；將平板倒置於35-37℃培養箱中培養24 h。
1.2.2檢測方法斗租戚對菌數檢測的影響
各個樣品稱取l0 g，放入無菌錐形瓶內，加入90 mL無離子水，磁力攪拌分別為40 min。並稀釋成10-1～l0-7不同稀釋度的樣品溶液。
傾注平板法檢測菌含量：用移液槍從各個平行樣品相應稀釋液中各吸取1 mL，每個樣品稀釋液3個重復，待培養基表面乾燥後，將平板倒置於35-37℃培養箱中培養24 h。
平板塗布法檢測菌含量：用移液槍從各個平行樣品相應稀釋液中各吸取200uL塗布平板，每個樣品稀釋液3個重復；將平板倒置於35～37℃培養箱中培養24 h。
2結果
2.1樣品的振盪時間對菌數檢測結果的影響
採用細菌平板計數的方法，不同振盪時間對合生素中芽孢桿菌檢出量的結果見表1。從表l中可見：不同振盪時間獲得的細菌菌落數量有較大差別。總體而言，在一定時間內，隨著振盪時間的延長檢出有效菌含量增加，說明細菌從載體上解析需要一定的時間；當振盪時間為40 min後產品中的菌含量基本穩定。採用適當振盪時間才能更精確的顯示產品中有效菌的含量。
表1 震盪時間對有效菌含量結果的影響 億CFU／g
震盪時間
10min
20min
30min
40min
60min
含菌量
2
6
10.5
15
14
2.2 檢測方法對菌數檢測結果的影響
表2 檢測方法對有效菌含量結果的影響 億CFU／g
檢測方法
樣品平行
1
2
3
傾注平板法檢測有效菌含量
16.1
13.0
15.3
平板塗布法檢測有效菌含量
14.5
11.2
14.2
採用不同的檢測方法，對合生素中芽孢桿菌檢出量的結果見表2。從表2可見：不同方法獲得的細菌菌落數量有差別，傾注平板法相較平板塗布法檢測的菌含量多，但基本在20％誤差范圍內。平板計數法操作相對簡單、快捷且影響因素較少。傾注法培養基營養分布較均勻，對部分蔓延菌落能控制，但對操作人員熟練程度要求相對較高。
3分析與討論
3.1樣品處理對結果的影響
取樣時對樣品取樣口和取樣工具要消毒，防止樣品交叉污染。
3.2樣品的均質處理對結果的影響
固體樣品要用均質器或玻璃珠等充分均質，也可在稀釋液中添加相應溶解液（如吐溫80和液體石蠟等）的稀釋液，以保證樣品的充分均質。
測定芽孢桿菌活菌數時，不同振盪時型好間獲得的細菌菌落數量有較大差別，因為細菌從載體上解析並均勻分散到溶液中需要一定的時間，待測樣品應在振盪器上充分振盪，使得芽孢桿菌可以充分和均勻地分散到待測溶液中，避免因為菌體未完全釋放而引起結果中細菌含量偏低的現象。
3.3 試驗過程中操作方法的影響
加樣l mL時，用1 mL的吸管並且每做一個稀釋度都要換1支吸管，否則稀釋度間菌落計數誤差會超過10％，說明存在操作誤差。用吸管向平皿里加樣，平皿開口要小，吸管要直立且加樣結束後，讓吸頭接觸皿底乾燥處，保證加樣的體積不少。