㈠ 2021-09-28PCR替代技術，RPA引物與探針的常見問題
RPA擴增的基礎體系（TwistAmp® Basic）含有DNA擴增所需的所有試劑，我們只要准備好引物和模板就行。在這個基礎體系中添入不同的酶和探針，可以實現多樣化的RPA應用，比如RNA擴增檢測和實時RPA檢測等等。
生物通報道：重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術（由英國公司TwistDx Inc開發）。以此為基礎的TwistAmp® 核酸擴增產品，能夠在15分鍾內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬體設備的要求很低，特別適合用於體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。
RPA擴增的基礎體系（TwistAmp® Basic）含有DNA擴增所需的所有試劑，我們只要准備好引物和模板就行。在這個基礎體系中添入不同的酶和探針，可以實現多樣化的RPA應用，比如RNA擴增檢測和實時RPA檢測等等。
RPA****反應需要用多少引物？
RPA基礎反應每次需要480nM引物，TwistAmp® exo、TwistAmp® fpg和TwistAmp® nfo每次需要420nM引物。有時，稍微改動一下引物的用量可以提高其性能。對不同引物濃度進行測試（從200nM 到600nM）將有助於找到最合適的引物濃度。
RPA****反應需要用多少探針？
RPA反應一般每次需要120nM探針。不過，略微改變探針的濃度有時會促進反應的進行。我們可以在一定濃度范圍內（從50nM到150nM），根據自己的具體應用對探針進行優化。
現成的PCR****引物能用於RPA****么？
多半不行。絕此御激大多數PCR引物不能用於RPA，因為它們太短了重組效率低。
現成的PCR****探針能用於RPA****么？
不能。絕大多數常用的PCR探針並不適合RPA反應。特別是用到了聚合酶5』-3』核酸酶活性的探針系統，這樣的酶活性與RPA根本不兼容。
怎樣才算是好引物？我應該怎樣設計RPA****引物？
RPA引物還沒有一個嚴格的設計標准，所以需要進行篩森襪選。（引物設計具體參見： PCR替代技術，RPA全攻略之引物設計 ）
RPA****引物需要多長？
RPA引物一般在32至35個核苷酸之間。某些情況可能用到少於30個核苷酸的引物，但擴增過程會顯著減緩。
RPA****引物應當相距多遠？
這取決於你的具體應用。標准TwistAmp®試劑盒適用於不超過500bp的擴增產物。RPA擴增產物的大小是沒有下限的，不過RPA引物一般需要擴增子超過80bp。擴增產物在100-200bp之間，可以實現最快的RPA擴增。
在特定條件下，RPA擴增產物能夠達到2kb。不過，目前的TwistAmp®試劑盒無法生成這么大的片段。
我需要篩選多少引物？
這取決於你對檢測靈敏度的要求。舉例來說，如果目標分子上千，那麼絕大多數引物都夠用了。對靈敏度要求很高的話，最好是進行系統性的引物篩選。一開始篩選的時拆哪候，候選引物可以有10到20對。測試的引物越多，找到好引物的幾率也就越大。
RPA擴增的基礎體系（TwistAmp® Basic）含有DNA擴增所需的所有試劑，我們只要准備好引物和模板就行。在這個基礎體系中添入不同的酶和探針，可以實現多樣化的RPA應用，比如RNA擴增檢測和實時RPA檢測等等。
生物通報道：重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術（由英國公司TwistDx Inc開發）。以此為基礎的TwistAmp® 核酸擴增產品，能夠在15分鍾內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬體設備的要求很低，特別適合用於體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。
RPA擴增的基礎體系（TwistAmp® Basic）含有DNA擴增所需的所有試劑，我們只要准備好引物和模板就行。在這個基礎體系中添入不同的酶和探針，可以實現多樣化的RPA應用，比如RNA擴增檢測和實時RPA檢測等等。
RPA****反應需要用多少引物？
RPA基礎反應每次需要480nM引物，TwistAmp® exo、TwistAmp® fpg和TwistAmp® nfo每次需要420nM引物。有時，稍微改動一下引物的用量可以提高其性能。對不同引物濃度進行測試（從200nM 到600nM）將有助於找到最合適的引物濃度。
RPA****反應需要用多少探針？
RPA反應一般每次需要120nM探針。不過，略微改變探針的濃度有時會促進反應的進行。我們可以在一定濃度范圍內（從50nM到150nM），根據自己的具體應用對探針進行優化。
現成的PCR****引物能用於RPA****么？
多半不行。絕大多數PCR引物不能用於RPA，因為它們太短了重組效率低。
現成的PCR****探針能用於RPA****么？
不能。絕大多數常用的PCR探針並不適合RPA反應。特別是用到了聚合酶5』-3』核酸酶活性的探針系統，這樣的酶活性與RPA根本不兼容。
怎樣才算是好引物？我應該怎樣設計RPA****引物？
RPA引物還沒有一個嚴格的設計標准，所以需要進行篩選。（引物設計具體參見： PCR替代技術，RPA全攻略之引物設計 ）
RPA****引物需要多長？
RPA引物一般在32至35個核苷酸之間。某些情況可能用到少於30個核苷酸的引物，但擴增過程會顯著減緩。
RPA****引物應當相距多遠？
這取決於你的具體應用。標准TwistAmp®試劑盒適用於不超過500bp的擴增產物。RPA擴增產物的大小是沒有下限的，不過RPA引物一般需要擴增子超過80bp。擴增產物在100-200bp之間，可以實現最快的RPA擴增。
在特定條件下，RPA擴增產物能夠達到2kb。不過，目前的TwistAmp®試劑盒無法生成這么大的片段。
我需要篩選多少引物？
這取決於你對檢測靈敏度的要求。舉例來說，如果目標分子上千，那麼絕大多數引物都夠用了。對靈敏度要求很高的話，最好是進行系統性的引物篩選。一開始篩選的時候，候選引物可以有10到20對。測試的引物越多，找到好引物的幾率也就越大。
篩選引物的時候必須用探針么？
不一定。任何檢測方法都可以用來評估候選引物的性能。不過對於篩選高靈敏度引物來說，用檢測探針對擴增進行實時監控被證明是最快也最省力的方法。
引物篩選時應該用什麼樣的條件？
引物篩選的條件最好盡量模擬實際檢測時的條件，例如模板的拷貝數、樣本純度等等。
給定引物的性能還能再提高么？
一般來說，稍微改動一下引物的序列可以提高其RPA性能。任何給定的引物都可以通過以下方法進行優化：以單核苷酸為基礎略微改變引物的長度；或者保持引物長度不變，以1bp為基礎移動引物的位置。經過了改動的引物，需要重新進行擴增活性的測試。
RPA****引物的熔解溫度應該是多少？
RPA反應是在常溫下進行的，DNA的解鏈與PCR有很大不同。傳統估算的熔點不適用於這個系統。
RPA****引物需要特別純化么？
在進行引物篩選的時候，一般不需要純化。在其他情況下，引物的質量會造成批次間的差異。如果對一致性要求比較嚴格，最好先純化引物再進行RPA反應。
經過一種TwistAmp®****試劑盒測試的引物，能直接用於其它TwistAmp®****試劑盒么？
不一定。舉例來說，經TwistAmp®基礎試劑盒測試的引物，不能直接用於exo或nfo試劑盒，因為exo和nfo還要把探針納入考慮。另外，跑膠檢測、熒光檢測或側流層析檢測對引物有不同的要求，不能一概而論。DNA檢測和RNA檢測也一般不能共用引物，因為逆轉錄酶和聚合酶有著不同的偏好。
我要怎麼選擇探針？
TwistAmp官網上提供有不同檢測探針的設計指南。需要注意的是，TwistAmp® exo探針有一些特殊的限制。TwistAmp® fpg的探針設計更為靈活，但它生成的熒光信號沒有TwistAmp® exo探針強。
使用引物和探針的時候還需要注意些什麼？
引物和探針需要同時添加到體系中，一先一後會使片段重組出現偏向性。
㈡ RPA的應用領域有哪些
RPA可以用來干什麼?(RPA應用范圍)
核酸檢測革命：可替代PCR的犀利技術——RPA
RPA對硬體設備的要求很低，特別適合用於體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。以下為大家介紹RPA在細菌、病毒檢測以及癌症研究等領域的應用情況。
RPA成為致病菌檢測的得力工具
在今年發表的一系列文章中，RPA技術被廣泛用於艱難梭狀芽孢桿菌、結核桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙門氏菌、大腸埃希菌STEC等常見致病菌的檢測。在臨床診斷和食品安全方面，為人們提供了簡單快速的實地篩查方案。
RPA技術建立沙眼衣原體快速檢測方法
沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)感染是最常見的性傳播疾病之一。沙眼衣原體影響5-10%的人口，常見於小於25歲的成年人。目前廣泛使用的沙眼衣原體檢測方法是以聚合酶鏈反應(PCR)技術為基礎，這種方法只適合於經過專業訓練的人員在具有特定儀器的實驗室使用。
日前，發表在《分子診斷雜志雜志上的一項研究中，研究人員利用RPA技術開發了一種檢測沙眼衣原體的快速、靈敏的新方法，利用該方法在20分鍾內即可得出檢測結果。
研究人員利用RPA技術直接從患者尿液樣本中檢測沙眼衣原體，不需要從尿液樣品提取總DNA，也不需要專門的儀器設備。而且該檢測方法還具有少費力、少耗時、更經濟等特點。與目前的沙眼衣原體檢測方法比較而言，該方法還能夠顯著提高檢測的敏感性和特異性
RPA檢測瘧原蟲
澳大利亞科學家首次捕捉到瘧原蟲入侵並摧毀人體紅細胞畫面
核酸擴增是目前最靈敏的瘧原蟲(P. falciparum)特異性檢測法。然而，PCR需要熱循環設備和專業性操作，資源匱乏的地區往往難以滿足這些條件。在這種情況下，與側流層析結合的RPA有著很大的應用前景。
雜志今年三月份發表的一項研究中，研究人員將RPA基礎反應、TwistAmp nfo探針和側流層析結合起來，實現了瘧原蟲18S rRNA基因的高靈敏度快速檢測。在38°C的條件下，只需要不到十分鍾的擴增，就能檢出含有四個瘧原蟲的樣本。加上側流層析的檢測時間，整個流程總共只需要15分鍾，而且肉眼可以直接看到檢測結果。
研究人員用不同瘧原蟲測試了這種方法的靈敏度和特異性。研究顯示，所有瘧原蟲都被成功檢出，所有非瘧原蟲都得出了陰性結果。文章指出，這一方案將大大改善資源匱乏地區的瘧原蟲分子診斷。
RPA檢測冠狀病毒
2012年在中東首次鑒定的中東呼吸綜合症冠狀病毒( Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)是一種新型的冠狀病毒。這種病毒很快傳入了歐洲，給公共安全機構敲響了警鍾。
目前，MERS-CoV檢測主要依賴於實時RT-PCR，需要收集患者樣本然後到專門的實驗室去檢驗。因此，亟需能夠進行實地檢測的快速裝置。
《PLOS Currents：Outbreaks》去年十二月發表的一項研究，開發了一個能在3-7分鍾內鑒定MERS-CoV的攜帶型RT-RPA裝置。在42°C條件下，等溫MERS-CoV RT-RPA與實時RT-PCR一樣敏感，可檢出10個RNA分子。文章指出，這個便攜裝置是監控MERS-CoV傳播，尋找其動物宿主的理想方法。
RPA檢測埃博拉等十種致命威脅
檢測傳染性疾病的綜合panel，有助於資源匱乏地區進行實地分子診斷，對生物防禦工作也有很大的幫助。
RPA檢測HIV
RPA在癌症研究中的應用
㈢ TwistDx英文怎麼讀
twist [twɪst]迪死
核酸檢測革命：可替代PCR的犀利技術
自PCR技術誕生以來已經有三十年了。從經典PCR、實時定量PCR再到現在的數字PCR，這一技術在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。
重組酶聚合酶擴增RPA(Recombinase Polymerase Amplification)，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。英國公司TwistDx Inc以此為基礎開發的TwistAmp® 核酸擴增飢慎產品，能夠在15分鍾內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬體設備的要求很低，特別適合用於體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。
RPA技術犀利在何處
常規PCR必須經過變性、退火、延伸三個步驟，而PCR儀本質上就是一個控制溫度升降的設備。RPA反應的最適溫度在37°C-42°C之間，無需變性，在常溫下即可進行。這無疑能大大加快PCR的速度。此外，由於不需要兄高溫控設備，RPA可以真爛塵敬正實現攜帶型的快速核酸檢測。
據介紹，RPA檢測的靈敏度很高，能夠將痕量的核酸(尤其是DNA)模板擴增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約1012擴增產物。而且RPA還用不著復雜的樣品處理，適用於無法提取核酸的實地檢測。
RPA既可以擴增DNA也可以擴增RNA，還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴增產物進行終點檢測，還可以對擴增過程進行實時監控，甚至可以通過試紙條(側流層析試紙條LFD)讀取結果。
目前，TwistAmp®試劑盒的擴增子長度在500bp以內。不過，經過特別優化的RPA擴增，也可以生成更長的擴增產物，或者減慢擴增速度(便於定量)，甚至在更低的溫度下進行反應。