丙肝酶聯免疫法檢測方法

『壹』 酶聯免疫吸附測定的方法類型和操作步驟

ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。該法適於測定細胞培養上清、血清、血漿及組織液中的樣本，干擾小可以測到每毫升納克水平的細胞因子（或受體）的水平。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。
（2）用脫脂奶粉或BSA進行封閉。洗滌除去多餘的脫脂奶粉或BSA。
（3）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
（4）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
（5）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。 在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。
（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。
（3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。
（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。 競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。
（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：
（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。
（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。 親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。
親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。
ELISA 普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗. 在這種方法中, 通常標准配體是固定的, 通過加入溶液相受體或蛋白質來使之成鍵. 通過加入與受體特異性反應的抗體來定量成鍵的受體, 而且最初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測量. 第二種抗體能識別抗體的末端, 在其末端的鹼性磷酸酯或過氧化物酶等與酶發生反應, 從而使溶液顯色.

『貳』 酶聯免疫法的檢測步驟

ELISA用血清來檢測，首先血液要經過至宏亂少半個小並慶時的凝集，然後取血清。將酶復合物用稀釋液稀釋後，加血清及陰性、陽性對照，還有就是質控品（這是嚴格的要求，它的范圍必須在質控范圍內）。經過一個小時的孵育，然後洗板，加底物，半個小時避光反應後加終止絕絕握液即完成反應部分，然後就是讀數。由數值來判斷結果的陰性或陽性。

『叄』 丙型肝炎病人的治療方法

丙型病毒性肝炎有很多種類型，因此治療方法也要因類型而異，在確定治療方案時要判斷丙肝患者是否是由丙肝抗體感染引起的，只有是由丙肝抗體感染的患者還要接受抗病毒的治療。
阻斷慢性丙肝的發展關鍵是進行病原丙肝的治療方法，在控制和消滅病原的過程中，也應認識到必伴有肝組織的損害，病人應重視科學的檢測。先進的檢測技術可以幫助丙肝患者選擇丙肝的治療方法，幫助下一步治療提供重要依據。
1、遺傳學檢查—HLA—A2檢測：檢測預後和葯物的敏感度。
2、特異性免疫學檢測：檢測機體的免疫功能，制定恰當的治療方案。
3、酶聯免疫斑點法檢測：檢測患者免疫耐受的程度及對治療方案的敏感度，以便及時調整治療方案。
4、細胞分子生物學檢測技術：檢測病毒血清中的含量，觀察用葯過程中的療效及是否出現耐葯傾向。
一般的丙型病毒性肝炎患者是不需要抗病毒治療的，但是根據肝臟受損的程度不同，治療方案也有很大的差異，針對老年人和兒童、酗酒、吸毒等特殊人群的治療方案更是各不相同，丙肝的治療方法是根據丙肝患者的自身情況而制定的適合的治療方案。

『肆』 初步診斷hcv的微生物學方法主要是

初步診隱悄李斷hcv的微生物學方法主要是採用免疫學的方法。根據查詢相關運銷資料可得出，診斷hcv所採用的免疫學的方法就是利用抗原抗體反應的特性來進行檢測，比如酶聯免疫法，化學發光法，金標法等，此外，現在還有採用常灶遲見的分子生物學的方法。

『伍』 丙肝病毒的生存和死亡條件,及特性.謝謝!

把我的備課筆記給你參考吧
一、生物學特性
（一）形態培養
HCV病毒體呈球形，直徑小於80nm（在肝細胞中為36～40nm，在血液中為36-62nm ），為單股正鏈RNA病毒，在核衣殼外包繞含脂質的包膜，包膜上有剌突。HCV體外培養尚未找到敏感有效的細胞培養系統，但黑猩猩對HCV很敏感。
（二）基因結構：
HCV-RNA大約有9500－10000bp組成，5′3′非編碼區（NCR）分別有319-341bp，和27-55bp，含有幾個順向和反向重復序列，可能與基因復制有關。在5′非編碼區下游緊接一開放的閱讀框（ORF），其中基因組排列順序為5'-C-E1-E2/NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-3',能編碼一長3014個氨基酸的多聚蛋白前體，可經宿主細胞和病毒自身蛋白酶作用後，裂解成各自獨立病毒蛋白，即三種結構蛋白，為分子量19KD的核衣殼蛋白（或稱核心蛋白，C）和33KD（E1），72Kd（E2/NS1）的糖蛋白，及四種分子量為23KD、52KD、60KD、116KD的非結構蛋白分別與NS2、NS3、NS4、NS5相對應。由於GP72正好與瘟病毒表面蛋白或黃病毒第一個非結構蛋白（NS1）相對應，故將GP72的基因標記稱謂E2/NS1。E1和E2/NS1糖蛋白能產生抗HCV的中和作用。NS2和NS4的功能還不清楚，發現與細胞膜緊密結合在一起。NS3蛋白具有螺旋酶活性，參與解旋HCV-RNA分子，以協助RNA復制，NS5有依賴於RNA的聚合酶活性，參與HCV基因組復制。
(三)變異性：
HCV具有顯著異源性和高度可變性，對已知全部基因組序列的HCV株進行分析比較其核苷酸和氨基酸序列存在較大差異。並表現HCV基因組各部位的變異程度不相一致，如5′—CR最保守，同源性在92-100%，而3′NCR區變異程度較高，在HCV的編碼基因中，C區最保守、非結構（NS）區次之，編碼包膜蛋白E2/NS1可變性最高稱為高可變區。
(四)基因分型：
HCV基因分型還無統一標准，因用於基因分型的部位和採用的技術方法不同，出現了各種基因分型結果，但各種基因型分類方法之間有一定的對應關系。
現知歐美國家多數HCV-Ⅰ型感染，而亞洲國家以Ⅱ型為主，Ⅲ型次之。Okomoto報告日本慢性丙型肝炎患者和健康獻血員主要為Ⅱ型感染，分別佔59.3%和82.4%,而血友病人約50%為Ⅰ型感染，原因是應用輸入美國進口凝因子Ⅷ。Wang氏報告我國北京慢性丙型肝炎患者86.2%為Ⅱ型感染，Ⅲ型感染為13.8%。而新疆病人Ⅲ型感染卻佔50%，說明不同型HCV具有一定的地區和人群分布特徵。此外不同基因型感染引起臨床過程和干擾素治療反應亦表現不同，如Ⅲ型感染臨床症狀較重,有引起嚴懲肝病傾向：Ⅱ型(Simmonds 1b)感染對干擾素治療不敏感效果差。Ⅲ型感染（Simononds 2a）用干擾素治療效果好。
二、致病性與免疫性
丙型肝炎的傳染源主要為急性臨床型和無症狀的亞臨床病人，慢性病人和病毒攜帶者。一般病人發病前12天，其血液即有感染性，並可帶毒12年以上。HCV主要血源傳播，國外30-90%輸血後肝炎為丙型肝炎，我國輸血後肝炎中丙型肝炎佔1/3。此外還可通過其他方式如母嬰垂直傳播，家庭日常接觸和性傳播等。
輸友御入含HCV或HCV-RNA的血漿或血液製品，一般經6-7周潛伏期例急性發病，臨床表現全身無力，胃納差，肝區不適，1/3病人有黃疸，ALT升高，抗好坦岩HCV抗體陽性。臨床丙型肝炎病人50%可發展為慢性肝炎，甚至部分病人會導致肝硬及肝細胞癌。其餘約半數病人為自限性，可自動康復。
丙型肝炎發病機理仍未十分清楚，當HCV在肝細胞內復制引起肝細胞結構和功能改變或干擾肝細胞蛋白合成，可造成肝細胞變性壞死，表明HCV直接損害肝臟，導致發病起一定作用。但多數學者認為細胞免疫病理反應可能起重要作用，發現丙型肝炎與乙型肝炎一樣，其組織浸潤細胞以CD3+為主，細胞毒T細胞（TC）特異攻擊HCV感染的靶細胞，可引起肝細胞損傷。
臨床觀察資料表明，人感染HCV後所產生的保護性免疫力很差，能再感染不同，甚至部分病人會導致肝硬信頌化及肝細胞癌。其餘約半數病人為自限性，可自動康復。
丙型肝炎發病機理目前仍未十分清楚，當HCV在肝細胞內復制引起肝細胞結構和功能改變或干擾肝細胞蛋白合成，可造成肝細胞變性壞死，表明HCV直接損害肝臟，導致發病起一定作用。但多數學認為細胞免疫病理反應可能起重要作用，發現丙型肝炎與乙型肝炎一樣，其組織浸潤細胞以CD3+為主，細胞毒T細胞（TC）特異攻擊HCV感染的靶細胞，可引起肝細胞損傷。
臨床觀察資料表明，人感染HCV後所產生的保護性免疫力很差，能再感染不同株，甚至同株HCV。可能與HCV感染後病毒血症水平低及HDV基因級變異性有關。
三、微生物學診斷
(一)放射免疫診斷（RIA）或酶聯免疫試驗（ELISA）檢測血清中抗HCV
1989年，Kuo等建立了抗-C-100放射免疫試驗方法（RIA），隨後Ortho公司又研製成功酶聯免疫試驗方法（ELISA）檢測抗-C-100。這兩種方法均用重組酵母表達的病毒抗原（C-100-3，為NS4編碼的蛋白，含363個氨基酸），經純化後包被微量塑料板孔，然後加被檢血清，該病毒抗原即與被檢血清中抗-C-100結合，最後加同位素或酶標記的鼠抗人IgG單克隆抗體，加底物顯色判斷結果。
用上述酶聯免疫試驗法（ELISA）檢測抗-C-100有如下缺點：1. 抗-C-100出現較晚，約半數輸血後丙型肝炎病人於輸血後4～6個月抗—C-100首次陽轉，因此，不宜作為急性丙型肝炎的常規實驗室診斷；2.抗-C-100不是中和抗體，也不是IgM抗體，而是IgG 抗體； 3.本法不夠靈敏，少數丙型肝炎病人檢測不到抗-C-100；4.有非特異性，一些自家免疫性慢性肝病患者可出現假陽性，因此，抗HCV陽性需作重組免疫印跡試驗（Recombinant Immune Blot Assay, RIBA, 或稱 Western Blot）證實。
由於HCV核心抗體出現較早，因此，最近美國第二代酶聯免疫試驗法（ELISA）檢測抗HCV。該試劑盒採用HCVC區編碼蛋白C-22-3和非結構區NS3編碼蛋白C-33-3和C-100-3包被載體。用本法檢測抗HCV，其檢出率可提高25～30%，且檢出抗HDV的時間也可提早16～42天。
（二）免疫組化法檢測肝組織中HCV抗原
感染HCV的黑猩猩或病人血清中提取IgG，用間接免疫熒光或間接免疫酶組化法檢測肝內HCV抗原。
四、防治原則
丙型肝炎的預防方法基本與乙型肝炎的相同。目前，我國預防丙型肝炎的重點應放在對獻血員的管理，加強消毒隔離制度，防止醫源性傳播。
國外報告，對獻血員進行抗HCV篩查，可排除85%具有HCV傳染性的獻血員，從而明顯降低輸血後丙型肝炎的發病率。由於獻血員抗HCV陽性率與ALT水平和抗-HBc是否陽性有關，ALT（丙氨酸轉移酶）異常和抗HBc陽性者抗HCV陽性率明顯高於ALT正常和抗HBc陰性者（44%：0.5%），因此，在目前尚無條件進行抗HCV篩查的地區，可對獻血員作ALT和抗HBc篩查。據報道，排除ALT異常的獻血員後，輸血後丙型肝炎發病率可下降47.4%；排除抗HBc陽性的獻血員後，輸血後丙型肝炎發病率下降33%；如上述兩項指標異常的獻血員均被排除，則輸血後丙型肝炎發病率可下降61.2%。
最近，美國疾病控制中心報告，經皮膚感染丙型肝炎病人血液者，於暴露後立即注射免疫蛋白（0.06ml/kg）可能有預防作用。
本病的最終控制將取決於疫苗預防。HCV分子克隆的成功，為本病的疫苗預防提供了可能性，未來的丙型肝炎疫苗應包括各種不同重組的HCV毒株，或根據各地流行的HCV毒株來構建丙型肝炎疫苗。
干擾素治療丙型肝炎，可緩解病情，防止約1/2急性丙型肝炎向慢性化發展，慢性丙型肝炎用IFN治療後有效率為50%，但有半數復發，維持有效率為20-25%。

『陸』 丙肝的檢查方法有哪些

丙型肝炎是由丙肝病毒所引起，是通過輸血或血製品、血透析、單采血漿還輸血球、腎移植、靜脈注射毒品、性傳播、母嬰傳播等傳染引起的。
丙肝檢查方法都有哪些呢?
1. Anti-HCV(丙肝抗體檢驗)：抗體是由於人體免疫細胞對病毒感染或疫苗所做出的反應而產生的。抗體在血液中循環而且通常終生都會存在。丙肝抗體檢驗就是通過檢驗丙肝抗體的存在，來確定之前病毒的存在，而不是檢驗病毒本身。
由於從丙肝病毒的入侵到丙肝抗體的產生大約需要三個月，所以在感染丙肝的最初三個月，可出現假陰性。如果一個人有著比較差的或者被抑制的免疫系統(像艾滋病此雹導致的情況那樣)，也可能會產生假陰性結果，因為機體不能產生抗體。因此，免疫系統差的人應該通過核酸PCR試驗來檢驗是否得了丙肝。
2.HCV-RNA(聚合酶鏈反應測試(PCR))：這個測試是探測血液中丙肝病毒的實際存在情況。這是一個很靈敏的測試，可以在感染兩星期內檢測到病毒。HCV-RNA測試有兩種：
a) 定性：這是最靈敏的測試，很容易就可以檢測到病毒是否存在於血液中。檢測的結果要麼是陽性(指病毒存在)要麼是陰性(指未檢測到有病毒)
b) 定量：這個測試是衡量存在於血液中的病毒總量(也稱病毒載量)。檢測的結果是有多少個「拷貝」。
丙肝怎麼檢查呢?
丙肝的檢查首先必須明確感染丙型肝炎病毒，不一定就患丙型肝炎，因為丙型肝炎也存在無症狀病毒攜帶者，他們一般沒有明顯的肝臟損害。診斷丙型肝炎主要包括兩個方面：一是丙型肝炎病毒的標志物是否為陽性，二是有無肝臟損害及損害的嚴重程度。
病毒標志物主要包括血清抗—HCV(抗丙型肝炎病毒抗體)和HCV RNA(丙型肝炎病毒核糖核酸)。肝臟損害的檢查主要包括肝功能、B超及肝臟病理組織學的檢查。丙肝病毒指標陽性加上肝功能損害的指標，即可明確診斷為丙型肝炎。
假如只有丙肝病毒指標陽性，而未發現任何肝臟功能損害的證據，尤其是肝活檢組織病理無明顯肝細胞破壞時，則診斷為丙肝病毒無症狀攜帶者。正確診斷丙肝，全面把握病情是了解丙型肝炎的病情轉歸與預後的重要前提。
丙肝檢查項目都有哪些呢?
丙肝檢查項目有：血清生化學檢查項目、丙肝抗體檢查項目、丙肝病毒RNA檢查以及肝臟病理學檢查。
1、血清生化學檢測，其水平升高可能與肝臟炎症反應有關。
2、丙肝抗體檢測，丙肝抗體檢測是用於診斷丙肝的最重要手段，適用於高危人群的篩查，也可以用於丙肝感染者的初次篩查。
3、丙肝病毒RNA檢測，病毒基因檢測是檢測血液中丙肝病毒的實際存在情況，可在感染2周內檢測到病毒。
4、肝臟病理學檢查，肝臟病理組織學檢查對於丙肝的診斷、衡量肝臟炎症和纖維化程度、評估葯物療效等均非常重要。
丙肝傳染途徑是什麼呢?

丙型肝炎此州病毒簡稱丙肝，為黃病毒科丙型肝炎毒屬病毒。HCV是一個大小為30-80nm的單股正鏈RNA病毒，基因組長度為904kb。目前，全世界以發現10個以上的HCV基因型和亞型，我國北方以阿拉伯數字3/2a型為主，南方以阿拉伯數字2/1b型為主。
傳播途徑以經血液傳播途徑為主，可經輸入染有病毒的血液。血製品或森扒帆使用染有病毒的注射器材及醫療器具等傳播。母嬰傳播是重要的傳播途徑，包括經胎盤、分娩、哺乳等方式傳播。家人之間日常生活的密切接觸也是重要的傳播途徑。

『柒』 什麼是酶聯免疫法酶聯免疫試劑盒如何使用

酶聯免疫試劑的基本原理 酶聯免疫試劑 http://www.cusabio.cn/ 測定法，簡稱酶聯免疫法，或者ELISA法。 它的中心就是讓抗體與酶復合物結合，然後通過顯色來檢測。 ①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。 ②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。 ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑： ①固相的抗原或抗體 ②酶標記的抗原或抗體 ③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。

『捌』 酶聯免疫法的檢測方法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
一、將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。
二、加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
三、加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
四、加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。
在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步法檢測。
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段，從而可消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。
雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
雙抗原夾心法測抗體
反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用於測定，因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。 在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
⑴將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。
⑵加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他抗體及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。
⑶加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。
⑷加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因競爭吸附而影響包被效果。
間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。 競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
⑴將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。
⑵待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。
⑶加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。一般情況，是通過方波伏安法，檢測培養體系的峰電流，通過峰電流與抗原抗體的線性關系來最終確定體系的最終檢測目標的濃度。
當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：
⑴將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。
⑵加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
⑶加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
⑷加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
⑸加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。 親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。
親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。 在臨床檢驗中一般採用商品試劑盒進行測定。ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物等。完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：
⑴已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；⑵酶標記的抗原或抗體（結合物）；
⑶酶的底物；
⑷陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標准品和控制血清（定量測定中）；
⑸酶聯物（結合物）及標本的稀釋液；
⑹洗滌液；
⑺酶反應終止液。

『玖』 酶聯免疫檢測的方法及原理是什麼

（1）酶聯免疫吸附試驗（,ELISA）：是將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。
（2）夾心法（sandwichassay）:將已知的特異抗體包裝在固相載體（塑料板凹孔或紙片上），加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。
間接法（indirecrELISA）常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本（可能含有相應抗體），再加入酶標抗Ig的抗全（即第二抗體），經加底物顯色後，根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。
（3）BAS-ELISA：近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素（avidin）分子可以結合4個生物素分子（biotin）。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合，而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統（biotinavidinsystem-ELISA,BAS-ELISA），它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統，同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。

『拾』 第二代酶聯免疫試驗法（ELISA）檢測抗HCV是什麼原理

原理都一樣都是間接法，只不過是固相包被成分不一樣，第一代試劑利用來自HCV病毒基因組中的部分NS3和NS4區重組表達抗原（C100）作為固相包被進行檢測；第二代試劑利用來自HCV基因組NS3區的C33C和部分NS4區的融合表達抗原（C200）、再加上C區的核心抗原C22-3作為固相包被進行檢測；第三代試劑在第二代抗原的基礎上，又加入了來自NS5區的重組表達抗原，另外，部分公司的產品中又引進了合成肽抗原。