細胞乾性的檢測方法

1. 細胞活性檢測的方法有多少種

細胞活性測定方法有台盼藍染色法、克隆（集落）形成法、 3H 放射性同位素摻入法、 MTT 法等。其中 MTT 法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應用。但 MTT 法形成的 Formazan 為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由於在去上清操作時會有可能帶走小部分的 Formazan ，故有時重復性略差。為了解決這個問題，研究人員又開發了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如 XTT 、 CCK-8 （ WST-8 ）等。

2. 怎樣驗證一個細胞是幹細胞

常用類胚體、畸胎瘤或嵌合體三種實驗方法驗證 。
以小鼠幹細胞為例
類胚體實驗：幹細胞在懸浮培養時，培養基中不添加LIF（一種分化抑念銀仿製劑），靜下觀察會發現細胞形成的球狀細胞團並相互融合，中心由於缺少養分死亡搏臘形成空腔。
畸胎瘤實驗：將幹細胞注射到同品系小鼠的背部仔纖皮下，會形成有三個胚層的畸胎瘤。
嵌合體實驗：將幹細胞注射到同品系小鼠胚胎的囊胚腔中，出生後檢測該小鼠的遺傳物質會發現有些細胞是由注射的幹細胞分化而來的。

3. 細胞免疫功能檢測常用有哪幾種方法

細胞免疫（CMⅠ）是由多種細胞相互作用的結果。免疫細胞間相互作用導致多種細胞因子的釋放。因此細胞功能測定不僅涉及T細胞的數量和功能與包括各類因子活性測定，因此評價機體的細胞免疫功能不僅程序復雜，且很難標准化。
一、遲發型過敏反應的體外檢測方法
皮膚試驗和接觸性過敏的誘發是檢測遲發型過敏反應（DTH）的兩種常用方法。皮膚試驗中誘發對曾經使病人致敏的抗原的再次應答，而接觸性過敏是測試受者對從未接觸過的物質發生致敏的能力。
1．皮膚試驗 用皮膚試驗診斷DTH，常用的抗原有結核菌純蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人類試驗時在前臂皮內注射少量可溶性抗原，24～48小後，測量紅腫硬結的大小，硬結直徑大於10mm即被看作為陽性。表明受試者對該病原菌有了一定的細胞免疫能力，若皮試無反應，可用更高濃度的抗原重復試驗，若仍無反應即為陰性，需排除皮試技術誤差，也可能受試者從未接觸過此抗原，也可能由於細胞免疫功能缺損，或由於細胞免疫功能缺損，或由於嚴重感染（麻疹、慢性播散性結核）造成的無反應性。
2．接觸性過敏常應用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）誘生接觸性過敏。化合物與皮膚蛋白質結合而導至DTH反應。在動物試驗時，初次皮膚上塗抹DNCB後間隔7～10天再激發刺激，則皮膚出現即為陽性。此試驗人類已不使用。
二、細胞免疫的體外檢測方法
體外檢測淋巴細胞的數量和功能，最易採集的是血標本，首先需分離或純化淋巴細胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重為1.077的淋巴細胞分層液，當將血液重疊於淋巴細胞分層液之上離心時，由於紅細胞（1.092）、多形核白細胞（1.090）、淋巴細胞（1.070）的比重不同而相互分開。淋巴細胞和單核細胞在血漿和分層液交界處形成一薄層。仔細分出這一薄層的細胞，其中淋巴細胞佔80%，單核細胞佔20%，淋巴細胞中T細胞佔80%，B細胞佔4%～10%，其作為非DT、非B細胞。
1．T細胞計數
（1）E花環法：人類T細胞表面有SRBC受體（CD2）能與SRBC結合形成玫瑰花環樣結構，將經分層液分離現的RBM懸液與SRBC在含有血清的平衡鹽水中混合，經37℃培養5～10分鍾放4℃過夜，取細胞懸計數，外周血淋巴細胞中約70%～80%淋巴細胞結成花環即為T細胞。目前此方法已用來分離T細胞，而不用做T細胞計數。
（2）用單克隆抗體計數T細胞：將人的PBM分成三等份，分別用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的單克隆抗體作第一抗體與細胞結合，再用FITC標記的兔抗小鼠IgG抗體作第二抗體進行間接免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下或流式細胞儀檢測結果，在PBM中被CD3抗體染上熒光的細胞稱為CD3 細胞即總T細胞。正常人在PBM中T細胞佔70%～80%。正常人的CD4 細胞和CD8 細胞之和應與CD3 細胞數一致。CD4 細胞與CD8 細胞的比值正常人約為2/1而艾滋病患者則比值小於1.7。
2．T細胞活化試驗 T細胞能被非特異的物質稱為有絲分裂原所激活而向淋巴母細胞轉化。T細胞轉化過程可伴隨有DNA、RNA、蛋白質的合成增加，最圖導致細胞分裂。在光學顯微鏡下可計數轉化後的淋巴細胞數，也可用氚標記的胸腺嘧啶核苷（3HTdR）摻入正在分裂的淋巴細胞，用液閃測定儀檢查摻入正在分裂的淋巴細胞，用液測量儀檢查摻入的3H-TdR的多少確定淋巴細胞轉化率。最近有一種不用同位素，又可用儀器測量的淋巴細胞增殖反應的檢查法，稱為MTT檢測法，MTT是一種甲氮唑鹽，它是細胞線粒體脫氫酶的底物，細胞內的酶可將MTT分解產生藍黑色甲（fromazan）產物。該產物的多少與活性細胞數正相關。結果可用酶標檢測儀（595mm）測量匯豐銀行密度，做為MTT法的檢查指標。此法的結果與3H-TdR摻入法平行，並能反應試驗中的活細胞數。
3．細胞毒試驗 TC細胞、NK細胞、LAK細胞、TIL細胞對其靶細胞有直接的細胞毒（殺傷）作用。常用的栓測細胞毒效應的方法是51Cr-Na2Cro4鹽水溶液與靶細胞胞混合，於37℃培養1小時左右，51Cr即可進入靶細胞，與胞漿蛋白結合，洗去游離的51Cr後，即可得到51Cr標記的靶細胞，將待檢細胞毒性的細胞與51Cr標記的靶細胞混合（比例約為50：1或100：1）靶細胞被殺傷越多，釋放到上清液中的液游離的51Cr越多，且不能被其他細胞吸收。用γ射線測量儀檢測上清液中的cpm值，即可計算出待檢細胞殺傷活性的高低。
細胞毒試驗檢測Tc細胞效應功能是否健全，及經IgG介導的ADCC效應，或NK細胞在抗腫瘤免疫中的作用是有意義的。
4．混合淋巴細胞的反應（MIR） 是體外研究T細胞的較好的方法，雙向MLR常被用來篩選骨髓移植的供體。來自不同供體的淋巴細胞分別與病人的淋巴細胞混合培養4～5天，在最後8小時摻入51TdR摻入法測T細胞的反應性。或用細胞毒法觀察受刺激的T細胞與活的靶細胞混合（靶細胞來自與刺激細胞相同的個體）如果T細胞受刺激後產生了細胞毒T細胞，可殺死活的細胞，根據靶細胞釋放51Cr的多少算出T細胞移動抑制因子）和LIF（白細胞移動抑制因子）來評估細胞免疫功能。近年來應用測定IL-2的免疫酶技術，操作簡單，並能定量以取代了MIF和LIF的測定。單個核細胞與分裂原一起培養24小時，然後測定清液中的IL-2活性。在細胞免疫功能缺損時，特別是AIDS病人，IL-2分泌明顯降低。而有些疾病，如多發性硬化、類風濕關節炎、移植排斥反應等病人體內血清中IL-2水平升高，表明病人T細胞活性增高。發生移植排斥反應的病人尿中IL-2也可升高。
也可用酶聯免疫吸附試驗測定各種體液中活化的T細胞脫落的IL-2受體（CD25），一般來說IL-2的水平和IL-2受體水平是平行的，IL-2和IL-2受體的檢測可用於對某些疾病的監測，如移桿排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治療的病人。
對體外培養的細胞進行細胞因子產生能力檢測是檢查細胞培養上清液中細胞因子的生物活性或抗原性。現已可用核酸雜交技術，即從組織中或細胞中提取RNA，與同位素或酶標記的該種細胞因子的cDNA探針作分子雜交試驗，即印跡（dot blotting）或Northern印跡，若查出有某種因子的mRNA存在，即說明該細胞在所處培養條件下有產生某種細胞因子的能力。

4. 解螺旋24型-第1型增殖

一、增殖

表型的最大特點就是可以通過特定的實驗手段進行檢測

研究層次：人群→動物→組織→細胞→分子

1、分子層面：MCM，PCNA，Ki-67

①直接相關：免疫組化（最常用）PCNA、Ki67（較特異地存在增殖細胞中,但Ki67 G1期不存在，營養缺乏時表達上升；PCNA，由於「 DNA修復」誤認為是「增殖」 ）， PCNA、Ki-67、MCM（MCM最優） ；

微小染色體維持蛋白，minichromasome maintenance protein，MCM，只在細胞的增殖期才能夠檢測搜和到，它的表達在 G1/S轉粗漏叢換點達到峰值 ，在分化期和靜息期時，表達缺失

Ki-67，細胞核相關抗原，在細胞的G0期不表達，G1中期到後期出現表達， S期和G2期表達逐漸增加，有絲分裂期達到高峰

PCNA，增殖細胞核抗原，周期素，參與DNA損傷的修復和間接參與細胞周期的調控，P21是CDK的抑制因子。在G0/G1期幾乎沒有表達，G1晚期表達大幅度增加， S期達到高峰 ,G2/M期表達下降。

②間接相關：檢測腫瘤幹細胞分子marker （如胰腺癌幹細胞的CD44） ，存在爭議，錦上添花；

拓展：幹細胞檢測實驗 「幹細胞懸浮成球試驗」（microsphere formation assay）， 能在離體條件下，形成微球/懸浮球（microsphere），是鑒定具有乾性細胞的方法和指標之一。

檢測抑癌基因， 最常見P53，PTEN表達水平下降（western、qPCR） ，提示腫瘤惡性岩櫻程度上升，增殖表型↑

2、細胞層面：

MTT法；原理：活細胞線粒體中的 琥珀酸脫氫酶 能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶 甲瓚（Formazan） 並沉積在細胞中，而死細胞沒有這個現象。 二甲基亞碸(DMSO )能溶解細胞中的甲瓚，最後用酶標儀在特定的波長處，測定光吸收值，可間接反映活細胞的數量。在做MTT實驗的時候，通常取5個時間點（通常就是5天）。把5天中每一天的吸光度數據都記錄下來，最後形成一條細胞增殖的曲線。通過比較不同處理方式或者不同實驗組之間，細胞增殖曲線的高低，就可以判斷細胞增殖情況的快慢。

CCK8法：MTT衍生，原理類似

BrdU染色法；BrdU是胸腺密啶的衍生物，可以標記活細胞中新合成的DNA，可以代替胸腺嘧啶，選擇性地整合到復制細胞新合成的DNA 中。Br特異性抗體+免疫熒光染色可以用於檢測Br在細胞DNA中的滲入，從而判斷細胞增殖能力/動力（影像）的變化。

E染色法：；BrdU衍生，原理類似

RTCA法（real time cell analyzer），實時細胞分析儀，利用RTCA實時細胞分析儀，當細胞在孔內發生粘附，轉移，增殖的時候，孔內的電阻抗發生變化，被電極實時記錄，研究者也就獲得了相關的實時數據。採用這種RTCA的方法，不僅僅可以用於細胞增殖的數據的獲取，也可以用來檢測細胞的黏附、凋亡、轉移等等，應用范圍廣；

RTCA 是實時記錄，實時記錄的好處就是，不僅能夠獲得關鍵時間點的細胞增殖數據，而且還可以獲得在整個培養周期內的細胞增殖動力學變化過程

克隆形成實驗（不常用）：以評估腫瘤細胞的離體增殖能力的大小以及腫瘤在體外的致瘤能力的大小；

幹細胞懸浮成球實驗

3、組織層面：降低維度，回到細胞生物學和分子生物學層面免疫組化；形態學，檢測細胞形態和組織結構上的差異。但是從總體而言， 從石蠟樣本當中， 能夠獲得mRNA和蛋白的可能性很小，但是通過石蠟樣本可以獲得比較好質量的 DNA樣本和miRNA樣本 。！注意區分腫瘤區域和癌旁區域！存放於 深低溫冰箱（-80 度） 中的新鮮組織樣本只要保存方法合適，是可以從新鮮組織樣本中獲取蛋白，或者是mRNA/lncRNA樣本，可以用於後續的 western實驗或者qPCR 的實驗。

4、動物層面：移植瘤動物模型，腫瘤大小、體積、重量 反映增殖最直觀的數據；組織形態：移植瘤的中心部分形成部分組織和細胞的壞死，移植瘤惡性增殖程度越高，移植瘤內部形成壞死的區域也會愈加的明顯。降低維度，勻漿後檢測蛋白水平（western）、RNA（實時定量PCR）等；石蠟切片可獲得高質量的DNA和miRNA樣本， 注意區分腫瘤區域和癌旁區域。

有了動物模型的移植瘤樣本之後，檢測增殖相關的分子標志物，可以有多種方法。

第一種常見的方法是，把移植瘤的樣本，通過勻漿的方式 抽提總的蛋白或者是總的RNA ，檢測增殖相關的分子標志物蛋白水平的變化或者是RNA水平的變化。檢測蛋白可以用western blot；檢測RNA水平的變化，可以用實時定量PCR的方法。如果對於移植瘤樣本，不進行勻漿，不抽提總蛋白或者總的RNA，而是對移植瘤樣本進行組織切片，然後通過 免疫組化的方法，檢測切片樣本當中，PCNA 以及Ki-67 等增殖相關分子標志物 的表達變化，也能達到類似的效果。

在移植瘤的樣本當中，還可以檢測細胞的組織形態。因為腫瘤細胞會發生不受控制的惡性增殖，會導致移植瘤的中心部分，由於腫瘤細胞的密度過高，無法接觸到外界的氧氣和養分，會使移植瘤的中心部分形成部分組織和細胞的壞死。移植瘤惡性增殖程度越高，移植瘤內部形成壞死的區域也會愈加的明顯。所以可以通過移植瘤的組織切片，檢測移植瘤內部壞死區域的面積大小，評估腫瘤惡性增殖程度的強弱。

總結：

增殖是最常見的表型，可以從分子/細胞/組織/動物 四個層面上進行相關檢測。

在分子層面上 ，常見的有三個PCNA，Ki-67 和MCM。還有兩類和增殖間接相關的分子標志物：一類是幹細胞相關的分子標志物；另一類是檢測抑癌基因，但相對不太常用。

缺點：Ki67在G1期不存在，營養缺乏時表達上升；PCNA，由於「 DNA修復」誤認為是「增殖」

在細胞層面上 ，常見的方法有：1）MTT 比色法；2）Br 染色法；3）RTCA（real time cell analyzer，實時細胞分析法），其中MTT比色法和Br染色法是經典方法，RTCA 對於硬體設備的要求很高，成本高昂。檢測克隆形成，可以使用克隆形成實驗（colony formation assay）。

MTT原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚。

RTCA不僅僅可以用於細胞增殖的數據的獲取，也可以用來檢測細胞的黏附、凋亡、轉移等等，應用范圍廣。

在組織層面上 ，1）可以通過免疫組化的方法，檢測增殖相關的分子標志物（PCNA，Ki-67 和MCM）；也可以取新鮮組織做western或qPCR，但注意區別腫瘤區域和癌旁區域；2）通過形態學，檢測細胞形態和組織結構上的差異。

在動物層面上， 檢測增殖表型最常用的動物模型是移植瘤動物模型，記錄 移植瘤的大小 / 體積，重量等參數 。通過動物的移植瘤樣本，同樣可以檢測增殖相關的 分子標志物 。另外，由於移植瘤中，細胞發生急劇的增殖，會導致移植瘤內部因為缺少氧氣和養分而形成壞死區域，通過形態學檢測移植瘤 內部的壞死區域，也是評估增殖的有效手段 。

5. 細胞活性和細胞毒性檢測的實驗方法

細胞數量確定

1.將細胞懸浮液（100μL/孔）接種在96洞孔板中。將板在潮濕的培養箱中預孵育（例如，在37℃，5％CO2下）。

2.向板的每個孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.讀數。

3.將培養板在培養箱中孵育1-4小時。

4.使用酶標儀測量450 nm處的吸光度。

細胞增殖和細胞毒性測定

1.將種子細胞以103-104個細胞/孔的密度在96孔板中在100μL培養基中培養。將細胞在CO2培養箱中於37℃培養24小時。

2.將不同濃度的待測物質加入板中。

3.將培養板在培養箱中孵育適當的時間（例如，6,12,24或48小時）。

4.使用重復移液器向板的每個孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.讀數。

5.將培養板在培養箱中孵育1-4小時。

6.在讀取孔板之前，重要的是在軌道振動器上輕輕混合1分鍾，以確保顏色均勻分布。

7.使用酶標儀測量450 nm處的吸光度。

數據分析

統計分析有幾種方法，您可以選擇使用O.D.值或細胞數量，我們提供其中一種方法。

細胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100

抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100

As =實驗孔吸光度（含有細胞，培養基，CCK-8和待測化合物的孔的吸光度）。

Ab =空白孔吸光度（含有培養基和CCK-8的孔的吸光度）。

Ac =對照孔吸光度（含有細胞，培養基和CCK-8的孔的吸光度）。

製作標准曲線

1. 細胞計數板計數細胞懸液中的細胞數。

2. 使用培養基，等比稀釋細胞懸液為一個濃度梯度，通常需要5-7個濃度梯度，每組幾個復孔。然後接種細胞。（注意每孔的細胞數量。如果您將細胞懸液稀釋在管中，在加入培養板的孔之前，請小心再次混勻細胞。每孔中細胞懸液的體積應該是一致的。）

3. 培養直至細胞貼壁（通常2-4小時），然後每100 μl培養基加入10 μl CCK-8。繼續孵育1-4小時，用酶標儀測量450nm處的吸光度。製作出一條以細胞數為X軸坐標，O.D.值為Y軸坐標的標准曲線。

可以基於該曲線確定待測樣品的細胞數。使用此標准曲線的先決條件是培養檢測條件相同。

注意事項

1. 確保葯物和CCK8均勻分布在培養基中。

2. 細胞增殖越多, 顏色越深; 細胞毒性越強，顏色越淺。

3. 對於貼壁細胞，每孔至少需要1000個細胞（100 μl培養基）。對於白細胞，由於靈敏度較低，每孔至少需要2500個細胞（100 μl培養基）。推薦的96孔板每孔最大細胞數為25000。如果使用24孔或6孔板進行該檢測，請計算相應的每孔的細胞數，並調整CCK-8的體積，使其為每孔總液體體積的10％。

4. 因為CCK8測定是基於活細胞中的脫氫酶活性，影響脫氫酶活性的條件或化學物質可能導致實際活細胞數與使用CCK-8測定活細胞數之間有差異。

5. WST-8可能與還原劑反應生成WST-8 formazan。如果使用還原劑 (例如一些抗氧化劑)會干擾檢測。如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。

6. 孵育2小時後，背景O.D.值一般為0.1-0.2單位。

7. 注意不要在孔中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.值。

8. 如果您想對CCK8溶液進行滅菌，請使用0.2 μm的膜過濾溶液。

9. 孵育時間因孔中細胞的類型和數量而異。通常，白細胞著色較弱，因此可能需要較長的孵育時間（長達4小時）或大量細胞（~105細胞/孔）。

10. 如果細胞懸液中存在高濁度, 測量並減去樣品在600nm或更高波長的O.D值。

11. CCK8不能用於細胞染色。

12. 培養基中的酚紅不會影響實驗結果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

13. CCK8的毒性非常低，在CCK8測定完成後，相同的細胞可用於其他細胞增殖測定，例如結晶紫測定，中性紅測定或DNA熒光測定。（除非細胞極為稀少，不推薦。）

14. 該試劑盒可用於大腸桿菌，但不能用於酵母細胞。

15. 在讀取平板之前，您可以在搖床上輕柔混勻。

16. 我們建議將細胞接種在靠近培養板中央的孔中，最外圍一圈孔中的培養基容易蒸發，可以用PBS，水或培養基填充這些孔。

17. 如果您沒有450nm濾光片。您也可以使用吸光度在430和490nm之間的濾光片, 450nm濾光片具有最佳靈敏度。

18. 測量450nm處的吸光度，如果您需要進行雙波長測定，作為參考波長可以測定650nm處的吸光度。

19. 葯物中金屬離子的存在可能會影響CCK8的靈敏度。終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制 5%、15%、 90% 的顯色反應，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM的話，將會100%抑制。

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6. 細胞增殖

增殖是一種在生物醫學領域內， 非常伏源常見的表型， 甚至可以說是最常見的一種表型。

細胞增殖是高等生物體最為重要的生命特徵。 高等動物體內的細胞，主要有兩種增殖的方式。第一種是體細胞的增殖方式： 有絲分裂。 有絲分裂也是最常見的一種增殖方式。 在有絲分裂的過程中， 2 倍體的體細胞在經過有絲分裂之後， 產生兩個都是 2 倍體的後代細胞；另一種是性生殖細胞所採用的增殖方式， 被稱為減數分裂。 減數分裂最大的特點是， 2倍體的性生殖細胞， 經過減數分裂後， 形成 2 個單倍體的後代細胞。 由於細胞在分裂前是 2 倍體， 而分裂後變成了單倍體， 使得細胞內的染色體數目變成了原先的一半， 因此得名「減數分裂」 。

增殖是最為常見的表型。 無論是正常生理條件下， 還是異常的病理條件下， 無論是正常的細胞， 還是異常的細胞， 增殖現象都是普遍存在的。

一.增殖表型如何檢測？

1.分子層面檢測增殖表型

有些分子的表達和增殖的表型有密切的關系， 因此， 只要能檢測到這些特定分子的表達， 就表徵了增殖現象的發生。 這類分子就是增殖的 marker 分子。

常見的和增殖相關的 marker 分子有如下幾種：

（1） 與增殖相關的分子標志物

A) MCM （微小染色體維持蛋白， minichromasome maintenance protein， MCM） 。 MCM只存在於真核細胞中。 MCM 在有絲分裂的晚期和 G1 期與染色質緊密結合， 在 S 期和G2 期分開。 MCM 蛋白只在細胞的增殖期才能檢測到， 它的表達在 G1/S 轉換點達到峰值， 在分化期和靜息期時， 表達缺失， 因此可以作為細胞增殖的特殊標志物。

B) 細胞核相關抗原 Ki-67。 這個分子是經典的細胞增殖相關分子標志物， 最早在 1983年在增殖細胞中發現， 目前在病理診斷中使用非常地廣泛。 Ki-67 的一級結構比較特殊，還沒有發現與之同源的蛋白， 所以目前對於 Ki-67 的功能了解得不多。 推測它可能具有如下的幾個功能： 1） 推測 Ki-67 可以調節細胞周期； 2） Ki-67 能和 DNA 或者 RNA 發 生相互結合； 3） Ki-67 在細胞分裂期參與合成核糖體。 Ki-67 在細胞的 G0 期不表達，G1 中期到後期出現表達， S 期和 G2 期表達逐漸增加， 有絲分裂期達到高峰， 細胞禪廳彎分裂後迅速降解。

C) 增殖細胞核抗原 PCNA。 PCNA 又稱為周期素， 它是 DNA 聚合酶δ的輔助蛋白。 這個分子也是經典的增殖相關分子標志物， 最早在 1978 年就有所報道。賀悶 又因為 PCNA 出現在增殖期細胞的細胞核中， 所以被稱之為增殖細胞核抗原。 PCNA 的主要功能有： 1）DNA 聚合酶δ的輔助蛋白； 2） 參與 DNA 損傷的修復； 3） 參與細胞周期的調控； 4）和 p21 相互作用。 P21 是 CDK 的抑制因子， 因此 PCNA 通過和 p21 相互作用， 間接影響細胞周期和增殖。 在增殖細胞的細胞周期中， PCNA 的量會發生明顯變化， 它在 G0/G1期幾乎沒有表達， G1 晚期表達大幅度增加， S 期達到高峰,G2/M 期表達下降。 PCNA 也已經廣泛應用於臨床病理診斷和相關的生物學研究中。

PCNA 和 Ki-67 作為細胞增殖標志物， 所存在的一些缺陷。 PCNA 和 Ki-67在 G1 早期不表達， 因此在整個細胞周期過程中， 存在表達時間上的間隙。 另外 PCNA 在DNA 修復和復制過程中， 發揮了作用， 這會導致結果的「假陽性」。 就是說某些沒有發生增殖， 但是發生了 DNA 修復的細胞， 也會上調 PCNA 的表達， 這會讓研究者誤以為細胞發生了增殖。 Ki-67 也會有類似假陽性現象的存在， 比如說 Ki-67 的表達水平， 會受到外部因素的影響， 比如在營養缺乏的時候。 MCM 蛋白相對於 PCNA 和 Ki-67 而言， 很大的優勢在於整個細胞周期中都有表達， 而且它不受 DNA 損傷修復和其他外部因素的影響。 因此有的研究者認為， MCM 蛋白是優於 PCNA 和 Ki-67 的理想的細胞增殖標志物。 但是從實際的應用層面看， 無論是在臨床應用當中， 還是在基礎科研當中， PCNA 和 Ki-67 的應用， 都更加廣泛。

（2） 和幹細胞相關的分子標志物

根據腫瘤幹細胞的理論， 腫瘤幹細胞是腫瘤中， 具有自我更新的能力並且能夠產生異質性的腫瘤細胞。 腫瘤幹細胞通過自我更新和無限增殖， 維持了腫瘤細胞群的生命力。 因此， 如果通過腫瘤幹細胞相關分子標志物的檢測， 證實腫瘤幹細胞的數量增加， 這就提示腫瘤的惡性程度高， 間接地說明了腫瘤增殖能力的增強。 例如， CD44 是胰腺癌中腫瘤幹細胞常用的分子標志物， 因此可以通過檢測 CD44 的表達水平， 證實胰腺癌中腫瘤幹細胞的情況， 間接地證實腫瘤細胞增殖能力的強弱。 但是採用這種方法是具有局限性的， 因為不同腫瘤的腫瘤幹細胞分子標志物是不同的。 而且在很多腫瘤當中， 腫瘤幹細胞的標志物， 還存在很大的爭議。所以我個人的建議是， 直接檢測 PCNA 或者 Ki-67 之類的細胞增殖相關標志物更好更直接；檢測腫瘤幹細胞相關的分子標志物， 只能間接地說明腫瘤細胞的惡性增殖情況， 只能算是錦上添花而已。

（3） 檢測抑癌基因

檢測抑癌基因相關的分子標志物也是一類和細胞增殖間接相關的分子標志物。檢測這一類分子標志物， 它存在著如下的一種邏輯推理的過程， 首先， 在細胞內抑癌基因的表達水平或者活性明顯下降， 就提示腫瘤的惡性程度明顯提升， 間接地說明了腫瘤的惡性增殖表型會有所增加。 在這一類分子標志物當中常見的抑癌基因有兩個： p53 和 PTEN。 經常可以看到在論文當中， 通過 western 或者 qPCR， 證實 p53 以及 PTEN 分子表達水平降低， 從而間接地說明腫瘤細胞惡性程度上升， 腫瘤的增殖表型也會顯著的提升。

2.細胞層面檢測增殖表型

（1） 直接檢測細胞的增殖狀態

A） 最為經典的方法是 MTT 法。 MTT 是一種染料。 它的檢測原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan） 並沉積在細胞中，而死細胞沒有這個現象。 DMSO 能溶解細胞中的甲瓚， 最後用酶標儀在特定的波長處， 測定光吸收值， 可間接反映活細胞的數量。 MTT 法早已成為研究細胞增殖的經典方法。 後續基於類似的實驗原理，還在 MTT方法的基礎之上，演化出了各種不同的替代技術，比如 CCK8染色實驗等等。 在做 MTT 實驗的時候， 通常取 5 個時間點（通常就是 5 天） 。 把 5 天中每一天的吸光度數據都記錄下來， 最後形成一條細胞增殖的曲線。 通過比較不同處理方式或者不同實驗組之間， 細胞增殖曲線的高低， 就可以判斷細胞增殖情況的快慢。

B） 另一種經常用於檢測細胞增殖的經典方法是 Br 染色法。 Br 是胸腺密啶的衍生物，可以標記活細胞中新合成的 DNA， 可以代替胸腺嘧啶， 選擇性地整合到復制細胞新合成的DNA 中。 這種滲入可以穩定存在， 隨著 DNA 的復制， Br 可以進入子代細胞中。 Br 特異性抗體可以用於檢測 Br 在細胞 DNA 中的滲入， 從而判斷細胞增殖能力的變化。 通常在使用 Br 單克隆抗體之後， 都會結合免疫熒光染色， 顯示增殖的細胞， 同時結合其他細胞標記物， 進行雙重染色， 可以判斷增殖細胞的種類， 增殖細胞的增殖速度， 對研究細胞動力學有重要的意義， 因為組織細胞內沒有內源性 Br 的存在， 所以這種方法用於檢測細胞的增殖， 應用非常廣。 另外， 通過 Br 染色法可以提供影像學相關的數據， 這比單純採用MTT 法（只能提供簡單的折線圖） ， 要更富有視覺效果。 基於 Br 染色方法， 又演化迭代出 E 的染色方法。 E 也是一種胸腺嘧啶核苷類似物， 能夠在 DNA 復制時期代替胸腺嘧啶， 滲入正在合成的 DNA 分子中。 而且在檢測的時候， 直接採用熒光染料與 E 特異性反應， 直接准確地檢測出 DNA 復制活性， 能更有效地檢測細胞增殖現象。

C) MTT 法或者 Br 染色法， 這類技術都屬於 End-point assay（終點分析法） 。 因為這類技術對於細胞都有破壞作用， 在檢測過程中， 細胞已經死亡， 結構也不再完整。 因此， 有公司（例如羅氏） 研發了實時記錄細胞增殖狀態的設備和方法， 這種設備成為 RTCA（real time cell analyzer， RTCA） 。 RTCA 這類技術的特點就是實時（real time） 。 RTCA 實時細胞分析儀， 需要用到特定的細胞培養板（被稱為 E-plate） ， 在 E-plate 每一個孔的底部都含有特製的電極。 電極的作用就是實時記錄孔內的電阻抗（electric impedance） 。 當細胞在孔內發生粘附， 轉移， 增殖的時候， 孔內的電阻抗發生變化， 被電 極實時記錄， 研究者也就獲得了相關的實時數據。 不過需要特別強調的是， 採用這種 RTCA的方法， 不僅僅可以用於細胞增殖的數據的獲取， 也可以用來檢測細胞的黏附， 細胞的凋亡、細胞的轉移等等， 所以它的應用范圍是非常廣的。

（2） 檢測細胞的克隆形成能力

腫瘤細胞由於惡性程度高， 因而還具有一類特殊的增殖能力--被稱為克隆形成能力。 正常細胞在增殖的時候， 需要細胞與細胞之間的信號傳遞。 這些信號的存在， 使得正常細胞增殖過程中， 可以有序地受到調控。 但是腫瘤細胞具有高度的惡性， 它的增殖是不受調控的， 所以即便缺少細胞之間的交互和信號通路， 腫瘤細胞也可以由單獨一個細胞， 增殖形成大量的子代細胞， 最終形成一個細胞克隆。 這種現象就被稱之為克隆形成能力， 可以通過克隆形成實驗， 加以檢測。

對於幹細胞， 也有一種類似於克隆形成實驗的技術， 用於檢測幹細胞的增殖能力， 這種方法被稱為「幹細胞懸浮成球試驗」 （microsphere formation assay） 。 鑒定幹細胞需要很多的指標， 能在離體條件下， 形成微球/懸浮球（microsphere） 是鑒定具有乾性細胞的方法和指標之一。

3.組織層面檢測增殖表型

（1） 檢測分子標志物

臨床上最容易獲得的組織樣本， 通常都是石蠟切片。 基於石蠟切片， 可以進行免疫組織化學IHC 的研究， 檢測和增殖相關的分子標志物， 比如 PCNA 和 Ki-67。

（2） 細胞形態和組織結構上的差異

在臨床組織樣本當中， 除了檢測和增殖表型相關的分子標志物之外， 還可以通過形態學的方式， 檢測細胞形態的多樣性和組織結構上的巨大差異。

通過石蠟切片的染色實驗， 可以觀察到惡性腫瘤細胞一般比正常細胞要大。 而且即便是同一種腫瘤， 在相同的組織部位， 腫瘤細胞的大小和形態也會很不一致， 很不均勻， 有時甚至會出現巨細胞。 在有些腫瘤細胞的細胞核內， 會出現細胞核體積增大的現象， 這就使腫瘤細胞的細胞核與細胞漿的比例異常。 腫瘤細胞的細胞核大小， 形狀都很不均一， 甚至會出現巨核、雙核、 多核或者是形態奇異的奇異型細胞核。 通過詳細的形態學觀察可以判定細胞發生了惡性增殖。

正常組織當中， 是由很多不同類型的細胞所組成。 不同類型的細胞在組織內， 以特定的、 有序的排列順序， 組成了健康的組織。 但是在組織內發生腫瘤之後， 由於腫瘤細胞發生不受控制的惡性增殖， 並且擠壓了周圍的正常細胞， 導致整個正常組織內細胞的有序排列順序被破壞， 組織內不同類型細胞的排列結構發生異常。 通過對於組織內部細胞排列順序和排列結構的檢測， 也能夠獲得腫瘤細胞發生惡性增殖的證據。

4.動物層面檢測增殖表型

大部分的疾病類型都有與之相對應的， 可用於研究的動物模型。 在腫瘤研究當中， 用於研究增殖相關表型的動物模型， 最常見的就是移植瘤動物模型。

在移植瘤當中， 為了獲取和增殖相關的表型， 通常要記錄幾個參數， 比較簡單的有腫瘤的大小也就是體積， 其次是腫瘤的重量， 這些參數是反應腫瘤大小和細胞增殖特性， 最直觀的數據。 有了移植瘤的樣本之後， 我們還是可以通過降低維度的方式， 以移植瘤的樣本作為檢測對象， 檢測分子標志物以及檢測細胞相關的行為學和形態學。

二.總結

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7. 細胞活性檢測的方法有多少種 每種的原理是什麼

在目前的細胞活性檢測方法中，MTT法是較早且較為經典的方法。但是，由於MTT法形成的甲物是非水溶性的，需要加有機溶劑溶解，這不僅增加了研究人員的工作量，也給實驗帶來了一定的誤差。在這里我們向大家介紹一種國外最新檢測方法—CCK-8法，它具有方便、靈敏、快速、無放射性、重復性好的特點。現在已廣泛用於細胞增殖檢測、細胞毒性檢測、葯物篩選、葯敏試驗等。

另外還將向大家介紹幾種氧化應激和蛋白質抗體標記的新方法。
內容：
1、新型細胞活性檢測方法介紹
2、國外氧化應激測定方法介紹
3、蛋白質抗體標記的新方法介紹

原理恕在下不知

8. 表皮幹細胞的鑒別

利用幹細胞最顯著的兩個特徵即慢周期性及自我更新能力來鑒定在體與離體幹細胞是最基本且可靠的實驗手段。由於幹細胞的慢周期性，可採用標記滯留細胞的分析方法識別在體的靜息幹細胞。幹細胞的自我更新能力在體外培養則表現為無限的增殖能力，形成細胞克隆，從而識別離體的幹細胞。但這兩種方法應用不方便，目前利用仔陪表皮幹細胞一些相對特異的標志建立了一系列的表皮幹細胞鑒別方法[1]。
由於表皮幹細胞及短暫擴充細胞表面高表達β1整合素，而有絲分裂後細胞及終末分化細胞不表達β1整合素，因而可以用β1整合素的抗體來鑒別表皮幹細胞及短暫擴充細胞。雖然表皮幹細胞β1整合素的表達量約為短暫擴充細胞的兩慎戚搜倍，但一般的光鏡下尚不能依靠β1整合素陽性強度的不同來區分幹細胞和短暫擴充細胞。如果利用激光共聚焦顯微鏡，將組織切片進行1μm的斷層掃描，即在單層細胞水平上觀察，則可以分辯出幹細胞與短暫擴充細胞表達β1整合素陽性強度的差異[5，10]。
近來，有實驗結合幹細胞表面的α6整合素及另一個與增殖有關的表面標志10G7，可以區分幹細胞與短暫分化細胞。檢測發現α6陽性而10G7陰性（α6bri10G7dim）的細胞處於靜息狀態，在體外培養中具有很強的增殖潛能，證實為幹細胞：而α6與10G7均陽性（α6bri10G7bri）的細胞是短暫擴充細胞，體外培養證實其增殖能力有限；α6陰性的細胞其角蛋白K10則呈陽性表達，說明是有絲分裂後終末分化細胞。因而可以利用α6整寬歷合素與10G7的單抗來區分幹細胞、短暫擴充細胞和分化的表皮細胞[10]。
角蛋白（Keratins）是表皮細胞的結構蛋白，它們構成直徑為10 nm的微絲，在細胞內形成廣泛的網狀結構。隨著分化程度的不同，表皮細胞表達不同的角蛋白，因而角蛋白也可作為幹細胞、定向祖細胞、分化細胞的鑒別手段。表皮幹細胞表達角蛋白19（Keratin19,k19），定向祖細胞表達角蛋白5和14（Keratin5、Keratin14,K5、K14），而分化的終末細胞則表達角蛋白1和10（Keratin1、Keratin 10，K1、K10）。實驗證實表皮基底層中K19與β1整合素表達均為陽性的細胞是標志滯留細胞，具有幹細胞的慢周期性。一般認為毛囊的隆突部幹細胞及胎兒、新生兒表皮基底層幹細胞均表達K19，成人無毛發皮膚如手掌、腳掌部位基底層的幹細胞K19表達陽性，但有毛發皮膚基底層中的表皮幹細胞K19則表達為陰性[11，12]。又有實驗發現毛囊隆突部表皮幹細胞表達角蛋白15（Keratin15,K15），而且在幹細胞的分化過程中，K15表達的減少較K19表達的減少更早，K15陰性而K19陽性的細胞可能是「早期」短暫擴充細胞，故K15可能較K19在鑒別毛囊的隆突部表皮幹細胞更有意義[13]。

9. 細胞活性檢測的方法有多少種 每種的原理是什麼

簡單說幾個把

1. 染色體法 主要在培養基中利用死活細胞對燃料親和力不同 來判斷

2. 克隆形成實驗 原理是單個細胞在體外增至六代後，後代形成的細胞群體 ，通過計算其克隆形成率 來判斷

3. 比色法 也是比較經典的 M,RR 活體細胞中的線粒體中的琥珀酸脫氫酶可以將M，rr還原成藍紫色的結晶甲醋 死細胞無此功能
   

10. 怎麼鑒定一個細胞是幹細胞

幹細胞在形態上具有共性，通常呈圓形或橢圓形，細胞體積小，核相對較大，細胞核多為常染色質，並具有較高的端粒酶活性。幹細胞可分為胚芹冊胎幹細胞和成體幹細胞。升首則幹細胞具有自我更新復吵棚制的能力（Self-renewing），能夠產生高度分化的功能細胞。