抗體檢測常用的方法

『壹』 抗DNA抗體的檢測方法

目前實驗室檢測抗DNA抗體的方法主要有放免法、間接免疫熒光法、斑點免疫金滲濾法、免疫印記法和酶聯免疫（ELISA）法。各種方法由於抗原來源不同、抗原展現形式不同、實驗體系的反應條件不同，檢測結果不具可比性。不同方法學檢測抗DNA抗體的檢測原理、優缺點對比見下表。
綜上所述，ELISA方法適合高標本通量的檢測並且可以在初篩的同時實現精準定量，一次實驗即可得到大量標本的准確定量結果，因此推薦：採用ELISA法聯合定量檢測抗dsDNA抗體和抗ssDNA抗體。

『貳』 艾滋病抗體的檢查方法

艾滋病病毒抗體檢測
艾滋病病毒抗體檢測：檢測血液中的艾滋病病毒抗體是目前最常用的檢測艾滋病病毒感染的實驗室方法，一般要經過兩個步驟：首先做初篩試驗，如果為陽性，再做確認試驗，確認試驗陽性才可診斷為艾滋病病毒感染。
常用的方法有：
1病原檢測病原檢測主要指用病毒分離培養、電鏡形態觀察、病毒抗原檢測和基因測定等方法從宿主標本中直接檢測病毒或病毒基因。由於前兩種方法難度大，且需要特殊設備和專業技術人員。因此僅抗原檢測和RT-PCR(反轉錄－PCR)可用於臨床診斷。
2 抗體檢測血清中HIV抗體是判斷HIV感染的間接指標。根據其主要的適用范圍，可將現有HIV抗體檢測方法分為篩檢試驗和確證試驗。
3 確證試劑篩檢實驗陽性血清的確證最常用的是Western blot（WB），由於該法相對窗口期較長，靈敏度稍差，而且成本高昂，因此只適合作為確證實驗。隨著第三代和第四代HIV診斷試劑靈敏度的提高，WB已越來越滿足不了對其作為確證實驗的要求。FDA批準的另一類篩檢確證試劑是-免疫熒光-試驗（IFA）。IFA比WB的成本低，而且操作也相對簡單，整個過程在1-1.5小時內即可結束。此法的主要缺點是需要昂貴的熒光檢測儀和有經驗的專業人員來觀察評判結果，而且實驗結果無法長期保存。現在FDA推薦在向WB不能確定的供血員發布最終結果時以IFA的陰性或陽性為准，但不作為血液合格的標准。
4篩檢試驗篩檢試驗主要用於對供血員進行篩查，因此要求操作簡便，成本低廉，而且靈敏、特異。目前世界上主要的篩檢方法仍然是ELISA，還有少數的顆粒凝集試劑和快速ELISA試劑。ELISA有很高的靈敏度和特異性，操作簡單，僅需要實驗室配備酶標儀和洗板機即可應用，特別適合於試驗室大規模篩檢使用。顆粒凝集實驗是另一種操作簡單方便，成本低廉的檢測方法，該方法結果可通過肉眼判定，靈敏度很高，特別適合發展中國家或大量篩選供血員時使用，缺點是必須使用新鮮樣品，特異性較差。80年代後期發展起來的斑點印跡檢測（Dot-blot assay）是一種快速ELISA（Rapid ELISA）方法，這種方法操作極為簡便，過程短暫，整個過程多數在5-10分鍾內甚至3分鍾內即可結束，但該法比ELISA和顆粒凝集試劑昂貴得多。金免疫測定是以膠體金為標記物，以硝酸纖維素膜為載體的固相免疫測定，分為滲濾和層析兩種形式。用於HIV抗體檢體金試紙條屬於金免疫層析，且大多數為間接法及雙抗原夾心法，兩種方法各有優缺點，但都簡單而快速，數分鍾即可得出結論，不需儀器設備，操作人員不需特殊訓練，試劑穩定，適用於單份測定等。

『叄』 免疫檢測方法

免疫檢測方法大全2017

免疫學檢測技術的用途非常廣泛，它們可用於有關免疫疾病的診斷、療效評價及發病機制的研究。如對傳染病、免疫增殖性疾病、免疫缺損病、超敏反應、自身免疫病、移植排斥反應腫瘤的免疫學檢測，對診斷、治療均有很大幫助。此外在醫學生物學研究中對抗原性物質或細胞的定性、定量檢查不僅推動了對各種免疫學現象的研究，而且擴大免疫學與醫學生物許多領域的聯系。本章僅介紹常用免疫學檢測方法的原理，簡要過程和實用意義。下面是我為大家帶來的關於免疫學檢測法的知識，歡迎閱讀。

第一節抗原或抗體的檢測

一、檢測的原理

藉助抗原和抗體在體外特異結合後出現的各種現象，對樣品中的抗原或抗體進行定性、定量、定位的檢測。

1.抗原與抗體的親和力(affinity)抗原抗體的結合就像酶與底物的結合，激素與其受體的結合一樣不是化學的反應，而是非共價鍵的可逆的結合。抗原決定簇和抗體分子可變區互補構型，造成兩分子間有較強的親和力。空間構型互補程度不同，抗原和抗體分子之間結合力強弱也不同。互補程度高，則親和力強。此外，反應溫度、酸鹼度和離子濃度對抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響，抗體與抗原決定簇之間的結合力大小可用親合力來表示。高親合力的抗體與抗原的結合力強，即使抗原濃度很低時也有較多的抗體結合抗原形成免疫復合物。

2.抗原或抗體外檢測原理根據抗原抗體結合形成免疫復合物的性狀與活性特點，對標本中的抗原或抗體進行定性、定位或定量的檢測。定性和定位檢測比較簡單，即用已知的抗體和待檢樣品混合，經過一段時間，若有免疫復合物形成的現象發生，就說明待檢樣品中有相應的抗原存在。若無預期的現象發生，則說明樣品中無相應的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測樣品中是否有相應抗體。

對抗原或抗體進行定量檢測時，以反應中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫復物的濃度呈函數關系。

(1)根據免疫復合物產生的多少來推算樣品中抗原(或抗體)的含量：在一定的反應條件下，加入的已知抗體(或抗原)的濃度一定，反應產生的免疫復合物多少與待檢樣品中含有相應抗原(或抗體)量成正比。也就是抗體濃度一定時，免疫復合物越多則樣品中的抗原量也越多。可用實驗性標准曲線推算出樣品中抗原(或抗體)的含量。如免疫單向擴散試驗、免疫比濁試驗和酶聯免疫檢測等都屬於這類方法。

(2)抗原或抗體效價滴定的原理：當抗原抗體復合物形成多少不能反應抗原抗體反應強弱時，就不能以檢測反應強度來對抗原或抗體進行定量。在實際工作中，把濃度低的反應成分(抗原或抗體)的濃度固定，把濃度高的另一種反應成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3隻家兔，比較3隻家兔產生抗體的多少，即滴定3隻兔血清抗體效價，可用雙向瓊脂擴散法來滴定，例如將抗體濃度固定，將抗原作不同的稀釋度，分別將抗原或抗體滴入瓊脂的相應小孔中，觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現明顯沉澱淺的抗原稀釋度(如甲兔的抗體效價為1/2000，而丙免的是1/8000則可比較出後者比前者產生抗體的效價要高)。也就是表示效價的稀釋度越高，樣品中所含待檢成分越多。因人血清(抗原)和抗體(免疫兔血清)相比，濃度高，故應稀釋抗原。

二、抗原或抗體檢測的實用意義

1.抗體檢測的意義檢測抗體可用於評價人和動物免疫功能的指標。抗體用於臨床治療或實驗研究時也需做純度分析和定量測定。臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、抗過敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體，對有關疾病的診斷有重要意義。

2.抗原檢測的意義可做為抗原進行檢測的物質可分為以下四類：

(1)各種微生物及其大分子產物：用於傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以及對菌苗、疫苗的研究。

(2)生物體內各種大分子物質：包括各種血清蛋白(如各類免疫球蛋白、補體的各種成分)、可溶性血型物質、多肽類激素、細胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進行檢測。在對這些成分的生物學作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。

(3)人和動物細胞的表面分子：包括細胞表面各種分化抗原(如CD抗原)、同種異型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相關抗原和腫瘤相關性情抗原等。檢測這些抗原對各種細胞的分類、分化過程及功能研究、對各種與免疫有關的疾病的診斷及發病機制的研究，均有重要意義。

(4)各種半抗原物質：某些葯物、激素和炎症介質等屬於小分子的半抗原，可以分別將它們偶聯到大分子的載體上，組成人工結合的完全抗原。用其免疫動物，制備出各種半抗原的抗體，應用於各種半抗原物質的檢測，例如對某些病人在服用葯物後進行血中葯物濃度的監測。對運動員進行服用違禁葯品的檢測，都是應用半抗原檢測的方法。

三、抗原或抗體檢測的方法

由於各種檢測方法中所用的抗原性狀不同，出現結果的現象也不同。最廣泛應用方法有下述幾種：

(一)沉澱反應

可溶性抗原與抗體結合，在兩者比例合適時，可形成較大的不溶性免疫復合物。在反應體系中出現不透明的沉澱物，這種抗原抗體反應稱為沉澱反應(precipitation neaction)。

1.環狀沉澱試驗先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小於0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊於上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復合物沉澱環，故名為環狀沉澱試驗(ring precipitationtest),此法簡便易行，需用材料較多是其缺點。

2.單向免疫擴散試驗單向免疫擴散試驗(single immunodiffusion)是在凝膠中進行的沉澱反應。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注於玻片上，製成含有抗體的瓊脂板，在適當位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復合物。當復合物體積增加到一定程度時停止擴散，出現以小孔為中心的圓形沉澱圈，沉澱圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關。本方法簡便，易於觀察結果，可測定抗原的靈敏度(最低濃度)約為10～20μg/ml，常用於定量測定人或動物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點是需1～2天才能看結果

3.免疫比濁法 當抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見的小免疫復合物，它可使通過液體的光束發生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復合物也增多，光散射現象也相應加強。免疫比濁法(immunonephelomytry)就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經過一段時間，用光散射濁度計(nephelometry)測量反應液體的濁度，來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便，可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。

4，雙向免疫擴散試驗 雙免疫擴散試驗(double immunodiffusion)是在瓊脂板上按一定距離打數個小孔，在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現2～3條沉澱線，本法常用於抗原或抗體的定性或定量檢測，或用於兩種抗原材料的抗原相關性分析。

5.對流免疫電泳對流電泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴散。將瓊脂板放入電泳槽內，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，於負極側的孔內加入抗原，於正極側的孔內加入抗體，通電後，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉澱線。只需1小時左右即可觀察結果。

6.免疫電泳 免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個步驟，即先進行電泳，再進行瓊脂擴散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然後在適當的位置上沿電泳方向挖一直線形槽，於槽內加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散，可形成多答卷沉澱線。常用此法進行血清的蛋白種類分析。對於免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義

7.免疫印跡法免疫印跡法(immunoblotting)又稱為Western印跡法，用於AIDS的血清抗體檢測。第一步，為電泳分離HIV抗原，在電場中根據分子量大小不同病毒抗原各成分散開。第二步，將電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維膜上(電印跡)，然後將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕於病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾種抗原相對應的抗體的話，則在該抗原印跡部位形成免疫復合物沉澱。在洗去未沉澱的抗原和抗體後，在膜上加標記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復合物發生反應，最後加入顯色底物(如果抗人Ig是用酶標記的)或做放射自顯影(抗人Ig用125Ⅰ標記)以顯示結果

第一步：經電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離;

第二步：將已分離的抗原經電印跡轉移到硝酸纖維膜上;

第三步：將待檢病人血清加入覆蓋於硝酸纖維膜上;

第四步：加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上;

第五步：加入顯色底物(或放射自顯影)顯現第二抗體

(二)凝集反應

細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆粒抗原，當與相應抗體結合，抗原與抗體結合形成凝集團塊，即稱為凝集反應(agglutination)。

1.直接凝集 直接凝集(direct agglutination)是將細菌或紅細胞與相應抗體結合產生的細菌凝集或紅細胞凝集現象。可用於傳染病診斷如肥達氏反應(Widal reaction)診斷傷寒病。或利用血細胞凝集現象檢查血型。

2.間接凝集 間接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳膠顆粒或紅細胞表面，與相應抗體混合出現的凝集現象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測類風濕關節炎病人血清中的類風濕因子，用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用於檢測甲狀腺球蛋的抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標本中的抗原，如細菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒，一旦與含有相應抗原的腦脊液混合，便可發生凝集，可進行快速診斷。故凝集反應即可測定抗原，也可測抗體，方法簡便、敏感。

3.抗球蛋白試驗 抗球蛋白試驗(antiglobulin test,coombs test)的原理為間接凝集試驗。例如應用於診斷自身免疫溶血性貧血症時，Rh+紅細胞與抗Rh血清間的反應。因抗Rh抗體是IgG只有兩個結合價，分子較小(不如IgM結合價多，分子大)很難直接引起Rh+紅細胞凝集。如果加入抗IgG的抗體，就可幫助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細胞。也就是經抗Ig的作用提高凝集反應的'靈敏度。

(三)補體參與抗原抗體反應

這一類反應主要包括溶血反應(hemolytic assay)、補體介導的細胞毒試驗(complement mediated cytotoxicuty test)及補體結合試驗(complement fixation test)。

1.溶血反應 抗體與紅細胞表面抗原相遇，形成紅細胞-抗體復合物即可使加入反應中的補體活化，導致紅細胞溶解，此方法可用於紅細胞的各種抗原或相應抗體的檢測，此法比凝集反應敏感。溶血反應也是用於抗體分泌細胞即空斑形成細胞(PFC)檢測的原理。

2.補體介導的細胞毒試驗各種有核細胞與針對其表面抗原的抗體相遇，所形成的免疫復合物能活化反應中的補體，引起細胞膜穿孔，在一定時間內，細胞仍能維持一定的形態不破碎，加入水溶性染如伊紅Y(eosin Y)或台盼藍(trypan blue)後，染料即可進入被活化補體穿孔的細胞，不帶相應抗原細胞膜保持完整的活細胞不著色。此方法可用於帶各種抗原的細胞的檢測，如進行細胞MHC抗原的鑒定，和進行淋巴細胞中T細胞總數或其亞類的計數。在一些免疫學實驗中也可用這種方法，根據需要特異地消除帶某種抗原的細胞。

3.補體結合試驗當抗原(可溶性或顆粒性)與相應抗體結合，由於濃度低不出現可見反應時，應用補體結合試驗可檢出此抗原抗體反應，它比凝集反應或沉澱反應靈敏度高。本法包括兩個抗原抗體系統。一為檢測系統由待檢樣品與已知抗原(或抗體)組成;另一為指示系統，由綿羊紅細胞(SRBC)和抗SRBC組成。另加入作為補體的新鮮豚鼠血清。試驗時試管中先加入檢測系統和補體，混合經37℃30分鍾使抗原、抗體、補體形成復合物，再加入指示系統，如出現溶血現象，說明檢測系統中沒有相對應的抗原抗體，補體是游離的指示系統的SRBC和抗體結合而出現溶血，即為反應陰性。如不出現溶血，表明檢測系統中有抗原抗體復合物並結合補體，則指示系統無多餘的補體作用而沒有溶血現象，即為陽性。

在敏感的抗原、抗體檢測方法(如酶標方法)出現之前補體結合試驗曾廣泛用於檢測各種細菌、病毒或螺旋體(如梅毒)的抗原或抗體，由於本試驗影響因素多，結果不穩定現已被新檢測方法所代替。

四、用標記抗體或抗原進行的抗原、抗體反應

用熒光素、同位素或酶標記抗體或抗原，用於抗原或抗體檢測是目前廣泛應用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標記物與抗原或抗體化學連接之後不改變後者的免疫特性。本方法可用於定性、定量或定位檢測。

1.免疫熒光技術免疫熒光技術(immunofluorescence techni)是用化學方法使熒光素標記的抗體(或抗原)與組織或細胞中的相應抗原(或抗體)結合，進行定性定位檢查抗原或抗體的方法。

(1)直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細胞懸液，細胞塗片或組織切片上進行染色，經抗原抗體反應後，洗去未結合的熒光抗體，將待檢標本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應抗原存在，此法可用於病毒感染細胞、帶某種特異抗原的細胞(如T細胞和B細胞)或病原菌的檢查，也可用於組織中沉著的免疫復合物的檢查。本法的缺點是檢查多種抗原，就需分別制備相應的多種標記抗體。

(2)間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復雜操作。將組織或細胞上的抗原直接與相應抗體(不標記熒光)結合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結合的熒游標記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒游標記的第二抗體，觀察結果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用於檢查抗原的第一抗體是人或動物的只需制備一種抗人或動物的免疫球蛋白熒光抗體

免疫熒光技術在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查抗原或抗體，如查出IgM抗體，可做為近期接觸抗原的標志，所以使用熒游標記抗IgM可診斷近期感染。除微生物學方面的應用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細胞的亞類。使用流式細胞儀(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自動檢測細胞的大小、熒光強度。針對細胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素(FITC)發黃綠熒光，用羅丹明(TMRITC)發紅色熒光。由於熒光顏色不同標記兩種不同的抗體，對同一細胞進行雙標記染色。對淋巴細胞亞類鑒定起著巨大推動作用。應用間接熒光法也用於自身免疫病的抗核抗體檢查。

2.放射免疫分析法 放射免疫分析法(radioimmunoassay RIA)應用競爭性結合的原理，應作放射性同素標記抗原(或抗體)與相應抗體(或抗原)結合，通過測定抗原抗體結合物的放射活性判斷結果，本方法可進行超微量分析，敏感性高，可用於測定抗原、抗體、抗原抗體復合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。

放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：

(1)液相法：將待檢標本(例如含胰島素抗原)與定時的同位素標記的胰島素(抗原)和定時的抗胰島素抗體混合，經一定作用時間後，分離收集抗原抗體復合物及游離的抗原，測定這兩部分的放射活性，計算結合率。在反應系統中，待檢標本的胰島素抗原與同位素標記的胰島素競爭奪戰性與胰島素抗體結合。非標記的抗原越多，標記抗原與抗體形成的復合物越少。非標記抗原含量與標記抗原抗體復合物的量呈一定的函數關系。預先用標準的非標記抗原作成標准曲線後，即可查出待檢標本中胰島素的含量

(2)固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然後加待檢標本，最後加標記抗體。測定固相載體的放射活性，常用的固相載體有溴化氰(CNBr)海豹化的紙片或聚苯乙烯小管

放射免疫分析法應用范圍廣泛，包括多種激素(胰島素、生長激素、甲狀腺素等)維生素、葯物、IgE等。

3.酶聯免疫分析法 酶聯免疫分析法(enzyme immunoassay,EIA)是當前應用最廣泛的免疫檢測方法。本法將抗原抗體反應的特異性與酶對底物高效催化作用結合起來，根據酶作用底物後顯色，以顏色變化判斷試驗結果，可經酶標測定儀作定量分析，敏感度可達ng水平。常用於標記的酶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酶(alkaline phosphatase)等。它們與抗體結合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩定性，製成酶標抗體可保存較長時間。目前常用的方法有酶標免疫組化法和酶聯免疫吸附法。前者測定細胞表面抗原或組織內的抗原;後者主要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。

(1)酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):是與上述固相RIA相似的原理，將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行政區。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。

(2)夾心法(sandwich assay):將已知的特異抗體包裝在固相載體(塑料板凹孔或紙片上)，加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。

間接法(indirecr ELISA)常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本(可能含有相應抗體)，再加入酶標抗Ig的抗全(即第二抗體)，經加底物顯色後，根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。

(3)BAS-ELISA：近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素(avidin)分子可以結合4個生物素分子(biotin)。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合，而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統(biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA)，它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統，同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。

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『肆』 HIV抗體檢測怎麼做

HIV抗體檢測怎麼做？HIV抗體檢驗一般有兩種方法，一種是酶聯法，第二種是快速法，測定結果僅憑特製的檢測試紙在短時間內即可獲得。

如何檢測HIV

1、酶聯法 ：即「酶聯免疫法」，簡稱ELISA。它的中心就是讓抗體與酶復合物結合，然後通過顯色來檢測。步驟很簡單：ELISA用血清來檢測，首先血液要經過至少半個小時的凝集，然後取血清。將酶復合物用稀釋液稀釋後，加血清及陰性、陽性對照，還有質控品。經過一個小時的孵育，然後洗板，加底物，半個小時避光反應後加終止液即完成反應部分，然後讀數。由數值來判斷結果的陰性或陽性。

嚴格的講，如果第一次檢測為陽性的話，無論是哪個實驗室，必須按照CDC的HIV操作規程來進行第二次檢測，第二次的方法必須與第一次的不同，如還是陽性，將送艾滋病確認實驗室確認。

2、快速法 ：即「金標法」，又叫「膠體金法」，金標法是國際上較為先進的靈敏，特異，快速，簡便，准確率高的體外診斷方法。測定結果僅憑特製的檢測試紙在短時間內即可獲得。金標法（艾滋病檢測試紙），取血後滴在試紙上，用15分鍾的時間觀察該試紙有無顏色變化。

艾滋病快速檢測法可以在家裡自己檢測，操作簡單方便，不需要特殊的儀器，在艾滋病試紙上先滴兩滴血，再滴一滴稀釋液，然後等待15分鍾讀取結果。結果判讀也很簡單，如果試紙上出現一條紅色的直線，說明是陰性，如果是兩條紅線，就是陽性。如果檢測出現陽性，按照HIV檢測流程，需要進行復測。

使用快速法（艾滋病試紙）進行艾滋病自我檢測應該在專業人員指導下進行，以確保整個自測操作過程規范正確，結果准確可靠。

3、蛋白免疫印跡法（WB）

艾滋病確診實驗室常用的方法，主要用於確認試驗，當初篩出現陽性時，需採用此方法進行確認實驗。基本原理是HIV全病毒抗原經過SDS-PAGE電泳，將分子量大小不等的蛋白帶分離開來，然後再把這些已經分離的不同蛋白帶電轉移到硝酸纖維素膜上。將此膜切割成條狀，每一條硝酸纖維素膜上均含有經電泳分離過的HIV病毒抗原。將待檢血清樣品用稀釋液稀釋成1/100，再把它直接加到硝酸纖維素膜上，恆溫震盪，使其充分接觸反應。血清中若含有抗HIV抗體，就會與膜條上的抗原帶相結合。加入抗人IgG酶結合物和底物後，即可使有反應的抗原抗體結合帶呈現紫褐色，根據出現條帶情況判定結果。

『伍』 自身抗體檢測的理想篩選實驗方法是

1.ELISA
：用於單項檢測；合適樣本數量大的時候！特異性，靈敏度都非常好！
2.膜條與斑點法：多個項目一同檢測，一次就能檢測幾個抗體結果出來，合適樣本數少，比較全面的檢測。
3.膠體金、晶元法、化學發光法：檢測速度快，幾分鍾到十幾鍾就能出結果，膠體都是單項目檢測，合適樣本數不多，檢測技術不高，沒有什麼設備的醫院；化學發光法與晶元法，對設備要求高，檢測成本也高，但速度快，項目多。樣本通量也很大！設備很貴，有錢的醫院合適；
4.westen
blot:檢測全面，可以一次完全檢測一個人的全部自身抗體，可以知道蛋白分子量，檢測被全世界科學界公認，缺點：特異性與敏感性不是太好，檢測復雜，時間長，同時顯色液用DAB有致癌作用，電泳時用的SDS-PAGE，其成膠前的單體是神精毒素，一般做科研的用，也...1.ELISA
：用於單項檢測；合適樣本數量大的時候！特異性，靈敏度都非常好！
2.膜條與斑點法：多個項目一同檢測，一次就能檢測幾個抗體結果出來，合適樣本數少，比較全面的檢測。
3.膠體金、晶元法、化學發光法：檢測速度快，幾分鍾到十幾鍾就能出結果，膠體都是單項目檢測，合適樣本數不多，檢測技術不高，沒有什麼設備的醫院；化學發光法與晶元法，對設備要求高，檢測成本也高，但速度快，項目多。樣本通量也很大！設備很貴，有錢的醫院合適；
4.westen
blot:檢測全面，可以一次完全檢測一個人的全部自身抗體，可以知道蛋白分子量，檢測被全世界科學界公認，缺點：特異性與敏感性不是太好，檢測復雜，時間長，同時顯色液用DAB有致癌作用，電泳時用的SDS-PAGE，其成膠前的單體是神精毒素，一般做科研的用，也有上市的試劑盒，深圳就有一家買WB的！人家是做好的膜，直接做就行了！比較快！

『陸』 艾滋病怎麼檢測

艾滋病是一種嚴重的性病，一個朋友當中懷孕自己得了這種疾病，到醫院進行過檢測，那麼，艾滋病怎麼檢測?下面和大家介紹一下。
1. 檢測方法一、抗體檢測。主要有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和免疫熒光試驗(IFA)。快速檢測法，也稱為金標法，也是抗體檢測的一種方法，根據免疫層析法的原理，用於HIV抗體檢測的定性檢測，這也是一種最常用的方法，同時檢測的准確率高達90%。


2. 檢測方法二、抗原檢測。用ELISA檢測P24抗原,在HIV感染早期尚未出現抗體時,血中就有該抗原存在.由於P24量太少,陽性率通常較低。現有用解離免疫復合物法或濃縮P24抗原，來提高敏感性。


3. 檢測方法三、核酸檢測。用PCR法檢測HIV基因，具有快速、高效、敏感和特異等優點，目前該法已被應用於HIV感染早期診斷及艾滋病的研究中。


注意事項
艾滋病是一種嚴重的疾病，特別是也會有潛伏期，在平時的時候要重視對這種疾病的預防，主要是在進行性生活的時候要做好防護的措施，而且也要注意輸血等情況的保護方法。

『柒』 如何測定抗體

在《抗體工程》上有親和力常數的測定方法，如平衡透析、競爭結合、熒光增強法、硫氰酸鹽洗脫法、ELISA和固相放射免疫測定法（SPRIA）等。其中ELISA和SPRIA是最敏感的檢測方法。通常採用競爭結合以及Scatchard作圖法。如果有條件用SPR方法，這是目前國際上流行的方法，該方法靈敏，客觀。

另外測親和力之前最好先測定抗體的有效濃度，方法是夾心法，用標准免疫球蛋白做標准品。因為在作OD-抗體濃度曲線時如果抗體濃度不夠，做不出來好的S形曲線，達不到最高值。所以建議你先測定抗體的濃度。如果濃度較低的話，你可以濃縮一下，方法很多，如PEG法，真空冷凍乾燥，超速離心等等。

『捌』 指出ELISA有哪幾種常用方法各種方法在操作上有什麼異同

• 也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，操作步驟如下：

• 
  

• 1） 將特異性抗體與固相載體聯結。RF是一種自身抗體，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

• 
  

• 假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇。

• 
  

• 2;夾心復合物"，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去，以提高試驗的特異性.間接法測抗體

• 
  

• 間接法是檢測抗體常用的方法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同。小分子激素，HBsAg有adr，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。

• 
  

• 在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，測知標本中抗原的量，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。

• 
  

• 3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體。

• 
  

• 4.競爭法測抗體

• 
  

• 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質;（conjugate）：

• 
  

• 1）將特異性抗原與固相載體聯結，故稱為間接法。操作步驟如下，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。此法中受檢標本不需稀釋。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

• 
  

• 5.競爭法測抗原

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• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，應注意可測范圍的最高值，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質;（immunosorbent）、ayr，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體.雙抗原夾心法測抗體

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• 反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：

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• 1.雙抗體夾心法測抗原

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• 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果、adw，固相載體上只留下特異性抗體；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"：（1）固相的抗菌素原或抗體，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，在檢測過程中標本須先行稀釋（1。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。

• 
  

• 4）加底物顯色

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• 本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

• 
  

• 間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，可直接用於測定，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。

• 
  

• 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。

• 
  

• 3） 加酶標抗體。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，已被列為這類試劑的一項考核指標。

• 
  

• 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。

• 
  

• 3。

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• 4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色、AFP。

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• 雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，尋找合適的標記方法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，試驗中也發生假陽性反應:40~1:200）。IgG的吸附性很強，即"免疫吸附劑"，例如HBsAg，但應盡可能予以純化。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect）。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E，從而消除RF的干擾。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。競爭法測抗體有多種模式，因此其敏感度相對高於間接法；（3）酶反應的底物、ayw4個亞型，因其不能形成兩位點夾心，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。

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• 2）加稀釋的受檢血清、HBeAg，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，以避免過高的陰性本底影響結果的判斷，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。

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• 2） 加受檢標本、葯物等ELISA測定多用此法。

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• 6.捕獲包被法測抗體

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• IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式。

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• 類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

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• 7.ABS-ELISA法

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• ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體。在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性

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『玖』 抗體檢測怎麼檢測（核酸、抗原、抗體檢測）

自 2020 年新冠疫情爆發以來，「核酸檢測」作為一項檢測是否感染的重要指標，開始反復出現在我們的生活中。2022 年 3 月 10 日，國務院應對新型冠狀病毒肺炎疫情聯防聯控機制綜合組發布通知，決定推進「抗原篩查、核酸診斷」的檢測模式，在核酸檢測基礎上增加抗原檢測作為補充。

抗原檢測是什麼？和其他的檢測手段有什麼不同？這篇文章，我們以新型冠狀病毒為例，講講常見的快速篩查手段，聊聊相關的原理以及適用范圍。

當我們做篩查時，能查的究竟有什麼

想要對一種疾病或是一種物質進行篩查，我們首先要弄清楚的就是「從何下手」的問題，其次是「如何檢測」，讓微觀世界的變化反映到我們眼前，幫助我們作出判斷。

從何下手

我們面對的是病毒。根據大家耳熟能詳的中學生物課知識，病毒是一類由遺傳物質和蛋白質外殼組成的類生命體 。如果想對病毒的感染情況進行探測，就需要從它的組分下手。接下來的內容，希望大家帶著自己中學的生物知識閱讀。

以目前正在困擾我們的 SARS-CoV-2 為例。它屬於冠狀病毒科下，冠狀病毒亞科的乙型冠狀病毒屬，是已知的第七種能夠感染人類的冠狀病毒。所有的冠狀病毒都是具有 包膜 的 正義單鏈 RNA 病毒 ，也就是說，它們的遺傳物質是一條單獨的 RNA 鏈，並且這條 RNA 鏈可以直接作為 mRNA（信使 RNA）參與翻譯，指導蛋白質的合成。

編號為NPRC 2020.00002的毒種，圖片由國家病原微生物資源庫（中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所）提供。

我們現在的目的是檢測標本中是否存在這種病毒，無論是檢測它本身，還是檢測病毒帶來的產物，能夠下手的方向也就是兩種：蛋白質外殼（包膜）、遺傳物質。

如何檢測

順著這個邏輯，那最顯而易見的方法就是檢查它「能不能看到」，但病毒本體小得很，SARS-CoV-2 的直徑在 80-120 nm，要想每個標本都拿電鏡過一遍是不現實的，人力物力和財力都撐不住。那麼更經濟實惠的方法，就是通過某些措施，讓 病毒的組分 ，或是因為病毒而出現的 某些特殊物質 積攢到一定數量級後發光、變色，出現 宏觀表現 。

那麼我們的問題就轉化成了，選擇一種可以觀察到宏觀尺度變化的方法，和病毒的組分、病毒引發的某種物質產生關聯。我們能選擇的物質也擺在檯面上：病毒的遺傳物質，在這里是它的 RNA；病毒的包膜，也就是蛋白質外殼；以及，如果你還記得一些基礎的生物知識，人體的免疫系統會在感染病毒之後產生抗體以抵抗入侵，它也是不錯的選材。

我們目前採用的幾種檢測方式，也就從這些物質（以及它們的相關物質）脫胎而來，分別為針對遺傳物質的核酸檢測，針對包膜的抗原檢測，以及針對抗體的血清抗體檢測。

核酸檢測

作為病毒的遺傳物質，核酸序列載寫了能夠鑒定病毒為某一特定種的基因特徵，因此核酸陽性，也就意味著病毒在體內存在過。

我們目前進行的「核酸檢測」其實分為兩個部分。平常我們進行的「捅鼻子」「捅嗓子」取樣和後續的定性是第一部分。在取得標本之後，因為病毒量太少，樣本會在實驗室中進行一定次數的擴增，並根據熒光反應結果來判定陽性陰性。

第二部分，確定為陽性的樣本，還需要通過基因測序，確定樣本病毒的分型，以便溯源。這一步已經不屬於日常篩查的范疇，但在流行病學調查上具有重大意義，如果有興趣了解，可以參看 Wikipedia 簡要了解。

我們平常參與的作為 篩查 工具的核酸檢測，指的就是採集到定性的第一部分。

在感染了 SARS-CoV-2 之後，咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液等標本中均可發現病毒核酸。不同部分標本核酸檢測的陽性率有一定差異，隨著病程進展，各個部位的檢出率也會發生變化。

我們習慣稱呼的「鼻拭子」與「咽拭子」，其實都是採集咽腔後壁的分泌物與組織，前者採集鼻咽，後者採集口咽。也有採用其他標準的，比如唾液等亦可作為檢測標本，本質上也是不同地區規定有差異

鼻（咽）拭子與（口）咽拭子已經是綜合了陽性率與便利程度的考量。糞便和尿液等其實也可以作為標本採集的對象。而且根據一項對 31 例患者的研究，肛拭子的准確率要高於鼻咽與口咽采樣，尤其病程後期，肛拭子確診病例的鼻拭子陽性率不到 30%。 4 但顯然，由於操作的限制，它無法作為早期篩查的首選手段。

接下來的工作，就是從獲取的那一點點標本中提取核酸。由於樣本中病毒的數量級很小，不足以拿來分析，還需要將其擴增並標記。需要用到的同樣是高中學過的知識：聚合酶鏈式反應（PCR）——這一步看起來麻煩，但由於它的原理和工序已經研究成熟，實際操作中只需要加好試劑送機器，整個核酸檢測的過程里最麻煩的還是讓待測者安安分分弄來標本（笑）。

各地疾控機構或檢測中心會采購合適的核酸 提取試劑盒 與核酸 檢測試劑盒 。提取試劑盒負責將 RNA 從混雜的樣本（細胞碎屑、分泌物、灰塵等雜質）中提取出來，常見的有磁珠法、離心柱法和釋放劑法，不同提取方法可能對後期檢測的准確度略有影響 。之後，提純出的 RNA 就會移交給檢測試劑盒（也有一些試劑盒將兩者合一），進行之後的工序。

檢測試劑盒帶著樣本在機器中進行的過程，就是這個檢測中最主要的反應：RT-qPCR（實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應）。

接下來需要你撿起高中生物的知識。一般的 PCR 反應有以下幾步：

加熱：讓雙鏈 DNA 解旋變形，成為兩條單鏈； 退火：讓混合的單鏈 DNA 與根據需要復制的片段而設計好的引物結合； 延伸：調整溫度，讓 DNA 聚合酶順著引物開始工作，復制出新鏈，形成新的雙鏈。

在對病毒的探測中，我們要做的工作也無非上面幾步，只是需要多出兩樣東西：

在第一次反應之前，使用 逆轉錄酶 （依賴 RNA 的 DNA 聚合酶），合成病毒單鏈 RNA 的互補鏈，組合成 cDNA ； 在退火與延伸的階段，除了引物和所需的酶外，還需要 TaqMan 探針 。

你可以把 TaqMan 探針這樣理解：它的主體部分是一段寡核苷酸鏈，被設計成能和一小部分需要復制的基因片段配對成雙鏈的樣子；它一端接了一個熒光分子，另一端接了一個開關（淬滅基團），兩者和探針相連時，熒光就會被淬滅基團壓制，探測不到。退火時，這個探針會和引物一起結合在要復制的單鏈片段上。在延伸的過程中，DNA 聚合酶會把擋在面前的障礙物切碎，其中就包括這段探針，淬滅基團和熒光分子就這樣分離，熒光就表現出來。

隨著循環數的增多，擴增的 DNA 片段和熒光也越來越多。對比每個循環的熒光亮度和前若干次循環的基準亮度，我們就能得出目前的 DNA 片段量，也可以直接用循環數和熒光亮度做定性的判斷。

那麼具體復制哪一部分呢？既然要探測病毒，那我們就選取最有代表性的核酸片段。現行的標准中，ORF 基因與 N 基因是常用的檢測位點。

檢測試劑盒負責的就是將提取出的 RNA（樣本）投入後，根據試劑盒上的程序說明，設定對應的 PCR 溫度與時長，由機器控制完成擴增過程，在固定的環節收集熒光信號，記錄對應的循環數（Ct 值）。判斷陰性陽性 / 是否還具有傳染力的標准，就是看熒光信號達到閾值時，目前循環數是多少。根據目前現行的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》，解除隔離管理的標准為 Ct 值 ≥ 35 。和此前通行的 ≥40 標准相比，出院與解除隔離的時間會大大縮短 。

免疫測定

經 RT-PCR 的核酸檢測到現在都是確診的金標准，因為它在方法學的角度看來，（理論上）可以做到 100% 准確。但核酸檢測耗時長、對環境與操作人員要求高，在環境條件達不到標准、物資與儀器不齊全等情況下，大批量的核酸檢測會帶來巨大人力與財力消耗。

在本次疫情中，我們採用的免疫測定包括了快速抗原檢測與抗體檢測，它以 抗原-抗體反應 為基本原理，旨在通過抗原與抗體快速的中和效應，以較少的時間成本探測樣本中是否存在待測物。兩者都屬於免疫層析法的范疇。

以盒裝方式出現、可以自行操作的抗原檢測就很適合作為物資不足、自我測定等情況下的補充。

抗原檢測

核酸檢測檢查的是病毒的（標志性）遺傳物質，是病毒的「內里」。那麼（快速）抗原檢測檢查的就是病毒的「外在」，直接檢查完整的病毒顆粒。目前通過審批的抗原檢測試劑盒包括三種類型：膠體金法、乳膠法、熒光免疫層析法。三者內在原理一致。但其中熒光免疫層析法試劑盒仍然需要專用的檢測儀或紫外線手電筒，不適合家庭自測；膠體金法和乳膠法則都是將檢查結果轉化成肉眼可見的條帶，差別在於用於標記上色的物質不同。

當然，抗原檢測自然有它的劣勢在，它的 假陰性率 （是陽性但顯示陰性）要更高，可能導致漏檢錯檢。但放在一杯茶就能出結果的時間優勢面前，准確性上的差距在某些特定情況下可以暫時讓步。

圖源：How the SARS-CoV-2 EUA Antigen Tests Work | ASM.org

和核酸檢測相比，抗原檢測增加了「鼻拭子」這一采樣途徑，降低了個人自測的難度。拭子上的樣本在緩沖液中洗脫，取液體滴加在加樣孔後，液體會因為毛細作用，帶著潛在的抗原，經過一片預載了抗體的區域（結合墊，conjugate pad）。

這片區域上的抗體，是抗目標抗原（SARS-CoV-2）的單克隆抗體，每一個抗體分子都和特別的標記結合，它們與樣本中的抗原發生反應，形成抗原-抗體復合物，並隨著毛細作用向下一條帶流去。

緊接著經過的是檢測線（T 線，test line），在檢測線上附著的同樣是抗目標抗原的單克隆抗體，你可以理解成這里的東西和結合墊上的一樣，只是沒帶標記。此時，如果受測者已經感染了 SARS-CoV-2，他留在樣本中的抗原形成的抗原-抗體復合物，會在此處與固定在線上的抗體再次結合。在這里，這些帶著標記的復合物不斷沉積，最終會顯示出一條或深或淺的條帶。條帶的顏色來源，就是之前結合墊上的抗體分子附著的標記，在膠體金法中是膠體狀態的金顆粒，在乳膠法中是上色的乳膠滴，在熒光法中是熒光分子。所以你在使用這類試紙時，會發現剛剛加樣結束，液體剛開始擴散的時候，擴散的最前端會有一點點很淡的顏色不斷推移，這就是還沒有固定沉積的標記的顏色。

接下來，液體繼續擴散，經過質控線（C 線，control line），在質控線上附著的是另一種抗體——『抗「抗目標抗原的單克隆 抗體 」 的 單克隆 抗體 』，簡稱「 二抗 」。這種新的抗體是讓上一種抗體在另一種動物的免疫系統中反應得來的，比如結合墊的抗體來自兔，那這里的抗體就來自羊，是羊抗兔的單克隆抗體。也就是說， 二抗的抗原是 之前在 結合墊上的抗體 。這條線就是為了檢測液體有沒有正常擴散、結合墊上的抗體有沒有失效等等而存在的。此時，液體中剩餘的大量來自結合墊的抗體就會作為抗原，與質控線上的二抗發生抗原抗體反應，形成復合物，顯出一條明顯的條帶。

由於結合墊上的抗體非常充裕，這條質控線條帶會出現得非常快、非常顯色，而檢測線由於抗原（病毒）數量不一定，顯色速度會有差別，但一般在 15 分鍾內就足夠判斷結果。所以不要看 C 線很明顯，T 線隱隱約約就覺得「沒事了」， T 線不管深淺，只要有，就是陽性 。

具體操作方面，可以參考醫政醫管局發布的 教學視頻。目前國家也在逐步推廣抗原自測試劑盒，在一定程度上可以減輕未來醫療與街道的壓力。

血清抗體檢測

除了前兩種檢測手段外，還有一種使用不太多，但同樣重要的檢測方法，就是同屬免疫測定方法的「血清抗體檢測」。

抗體檢測採用的試劑盒與抗原檢測非常接近，但標本的限制更大——由於檢測的對象變成了抗體，標本就必須是明確有抗體存在的血液（或血漿、血清）。而且人體在初次感染病毒後，並不會第一時間內產生抗體。抗體能夠明確達到被檢測的數量級，一般是在初次感染（或接種疫苗）的一到兩周之後。這些條件限制了抗體檢測不能作為確診性質的檢查。目前，血清抗體檢測僅作為一定情況下檢查疫苗是否生效，或查驗受測者近期是否感染過新冠病毒的方法。

在人體中有五種抗體，分別是 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM。IgA 主要負責黏膜免疫。IgD 與免疫反應激活有關。IgE 抵禦寄生蟲，同時也參與過敏反應。剩下的 IgG 與 IgM 就是對抗病原體的過程中，免疫系統派出的主力軍。

SARS-CoV-2 作為病原體，人體經刺激主要分泌的就是 IgG 與 IgM 兩種。現有的抗體檢測試劑盒，主要也是針對人體對 SARS-CoV-2 的 N 蛋白（核衣殼蛋白）或 S 蛋白（刺突蛋白）產生的 IgG 與 IgM。

抗體試劑盒的檢測裝置外觀和抗原檢測別無二致。二者的差別就是上文中提到的結合墊、檢測線、質控線上附著的物質。

這次，加樣孔中滴入的樣本可能有對 SARS-CoV-2 的抗體。因此，結合墊上就應當是帶了標記物的抗原——當然不可能放活病毒上來。一般這里使用的都是設計檢測的抗原蛋白，比如前文提到的 N 蛋白或 S 蛋白，或是重組病毒，無論是哪種，它都必須包含受體結合域（RBD）作為抗體結合的靶點。在檢測線上，附著的就是抗 IgM 或抗 IgG 抗體，以捕獲結合了抗原的抗體蛋白。最後，質控線上附著抗原的特異性抗體，捕獲剩餘的游離抗原。

小結

總的說來，三種檢測方式針對的是不同的需求，互有優勢，互相補充。核酸檢測作為金標准，直接查驗病毒的 RNA，負責看被檢者帶不帶病毒；抗原檢測作為快速檢測方法，查的是病毒的蛋白質，但准確度不如核酸檢測，對傳染力強的感染者更有效；抗體檢測查的是疫苗有沒有生效、人近期有沒有感染過病毒。

近期，新冠疫情在各地卷土重來。Omicron 變種與此前流行的 Delta 變種相比，雖然病死率與重症率明顯下降，但潛伏期更短，病毒復制速度更快，傳染力明顯增強。希望大家在這樣的環境中保持健康。