檢測培養基滅菌效果的常用方法

1. 培養基的配製與滅菌方法說明

培養基 （Medium）是供微生物、植物組織和動物組織生長和維持用的人工配製的養料，一般都含有水、氮源、無機鹽（包括微量元素）、碳源、生長因子（維生素、氨基酸、鹼基、抗菌素、色素、激素和血清等）等。
不同培養基可根據實際需要，添加一些自身無法合成的化合物，即生長因子。有些微生物，如自養型微生物，不需要碳源，所以上述物質只具有一般性。培養基由於配製的原料不同，使用要求不同，而貯存保管方面也稍有不同。一般培養基在受熱、吸潮後，易被細菌污染或分解變質，因此一般 培養基 必須防潮、避光、陰涼處保存。對一些需嚴格滅菌的培養基（如組織培養基），較長時間的貯存，必須放在3-6℃的冰箱內。由於液體培養基不易長期保管，均改製成粉末。

培養基的配製
1.配料
配方換算→在容器中加入少量水（蒸餾水，自然水）→按照配方稱取各種葯品（依次加入）→加足所需水量（一葯一勺，取葯後立即蓋上瓶蓋）。
2.溶解
澱粉溶解：少量冷水調成糊狀加熱溶解，特別是加有瓊脂的培養基，一定要煮沸，瓊脂的熔解溫度95-97℃ ，且需要邊加熱邊攪拌以防止燒焦。
3.調PH
用1N的鹽酸或1N的 NaOH把培養基調節到所要求的值。
4.過濾
濾紙或棉花進行過濾。（有時可以省去）
5.分裝
一般 培養基 放在三角瓶或試管中滅菌使用。
(1)三角瓶
若作靜置培養，判含則100ml培養基/250ml的三角瓶，最多不能超過150ml培養基/250ml的三角瓶，否則滅菌時培養基沸騰容易污染棉塞，造成染菌；若作搖瓶培養，則15-20ml培養基/250ml的三角瓶，保證通氣良好。
(2)試管分裝
液體培養基一衫讓般裝4-5ml，約試管的1/4高度；固體斜面 培養基 一般裝3-4ml，約試管的1/5高度。
6.包紮
分裝好後，塞上棉塞，在用牛皮紙將棉塞包裹好，防止滅菌時水份進入把棉塞弄濕。

7.滅菌
按配方上要求的溫度、壓力進行高壓蒸汽滅菌。如果滅菌的溫度太高，營養成分會被破壞，培養基中的糖、氨基酸會使 培養基 的顏色變深。
8.擺斜面
滅菌後需要擺斜面的試管要趁熱斜著擺放，使其凝固成為一個斜面，約占試管長度的1/2。
9.貯存
培養基 在30℃下放置一天，無污染的即可使用。一般用牛皮紙包裹好存放於2-8℃冰箱中備用。

培養基的滅菌

滅菌是指殺死或消滅一定環境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學滅菌法兩大類。本實驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。
加熱滅菌包括濕熱和乾熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內 蛋白質凝固變性，從而達到殺菌目的。蛋白質的凝固變性與其自身含水量有關，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比乾熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質易於凝固；同時濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。
濕熱滅菌有煮沸消毒法和高壓蒸汽滅菌法兩種，煮沸消毒法是注射器和解剖器械等均可採用此法。先將注射器等用紗布包好，然後放進煮沸消毒器內加水煮沸。對於細菌的營養體煮沸約15～30min，對於芽孢則需煮沸約1～2h。
高壓蒸汽滅菌法是高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學實驗中最常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基於水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經15～30min，可全部殺死鍋內物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌。

培養基注意事項
1、確認工作細胞庫是否被污染，確認毒種工作種子批是否被污染，確認所用培養基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染，均可用細菌、掘塌笑真菌及支原體無菌試驗來確認並排除。同時要對無菌試驗 培養基 的靈敏度進行驗證。實際生產中，可以從配製好的培養液中取少量加入營養瓊脂於恆溫培養箱內培養，48小時即可觀察有無污染。
2、其它：高壓滅菌設備、過濾除菌設備均應進行驗證，確保滅菌和除菌效果;前者應在投產前及其後的每6個月進行驗證，後者應在每次除菌前、後進行驗證工作(至少應在除菌後進行一次)。
3、另外，應將有毒區與無毒區嚴格分開，並有各自獨立的空氣凈化系統及孵室，有毒區對無毒區應保持相對負壓，防止病毒對培養細胞(尤其是細胞庫)的污染。

2. 為檢驗高壓蒸汽滅菌效果,目前常用的方法是

為檢驗高壓蒸汽滅菌效果,目前常用的方法是高壓蒸汽滅菌法。

高壓蒸汽滅菌法適用於普通培養基、生理鹽水、手術器械、玻璃容器及注射器、敷料等物品的滅菌。高壓蒸汽滅猜改菌器裝置嚴密，輸入蒸汽不外逸，溫度隨蒸汽壓力增高而升高，當壓力增至103－206kPa時，濕度可達121.3-132℃。

高壓蒸汽滅菌法就是利用高壓和高熱釋放的潛熱進行滅菌，為目前可靠而有效的滅菌方法。適用於耐高溫、高壓，不怕潮濕的物品，如敷料、手術器械、葯品、細菌培養基等。

手提式高壓蒸汽滅菌器：為金屬圓筒，分為二層，隔層內盛水，有蓋，可穗畝判以旋緊，加熱後產生蒸汽。鍋外有壓力表，耐早當蒸汽壓力升高時，溫度也隨之相應升高。該滅菌器體積小，可自發蒸汽，便於攜帶。

3. 培養基滅菌效果檢驗方法是什麼

滅菌結束後，在鍋內的不同位置，抽取若干支試管或料瓶(袋），貼上標簽，置25℃-30°C下空白培養6天左右進行檢查。如果所有試管或瓶（袋）培養基表面和內部均無任何變化，則表明已達到了滅菌的目的，可供接種使用；如果個別試管或瓶（袋）的培養基上出現有雜菌菌落，這就要作具體分析。可能是在擺放試管、瓶(袋）時，放得太緊，沒有間隙，導致蒸氣不暢通或滅菌鍋的結構不太合理等原因所致，應根據具體情況進行改進；
如果是大部分或全部試管、瓶（袋）培養基上出現了雜菌菌落，基本上可判斷是由於溫度或滅菌時間不夠，這就要提高滅菌壓力或延長滅菌時間。 經多批次滅菌和檢驗後，培養基都能達到徹底滅菌的要求，則以後在採用同樣培養基和同樣滅菌方法時，可不必每批都進行檢驗。

4. 已經滅菌的培養基如何進行無菌檢查

一般滅完菌後將培養基放在30-37度的環境中培養一天，看其有沒有長菌（液體看是否變渾濁，固體看是否長菌落），即可知是否滅菌後為無菌。

培養基配製完畢後，應立即滅菌，通常在高壓蒸汽滅菌鍋內，汽相120℃條件下，滅菌20分鍾。也可採用間歇滅菌法進行滅菌，即將培養基煮沸10分鍾，24小時後再煮沸20分鍾，如此連續滅菌三次，即可達到完全滅菌的目的。

經過滅菌的培養基應置於10℃下保存，特別是含有生長調節物質的培養基，在4～5℃低溫下保存要更好些。

(4)檢測培養基滅菌效果的常用方法擴展閱讀

培養基在使用前通過睜和高壓或過濾滅菌，防止污染應該注意以下事項：

（1）確認工作細胞庫是否被污染，確認毒種工作種子批是否被污染，確認所用培養基及其添加成分（如小牛血清、NaHCO3等）是否被污染，均可用細菌、真菌及支原體無菌試驗來確認並排除。

同時要對無菌試驗培養基的靈敏度進行驗證。實際生產中，可以從配製好的培養液中取少量加入營養瓊脂於恆溫培養箱察睜內培養，48小時即可觀察有無污染。

（2）其它：高壓滅菌設備、過濾除菌設備均應進行驗證，確保滅菌和除菌效果；前者應在投產前及其後的每6個月進行驗證，後者應在每次除菌前、後進行驗證工作（至少應在除菌後進行一次）。

（3）另外，應將有毒區與無毒區嚴格分開，並有各自獨立的空氣凈化系統及孵室，有毒區對無毒區應保持相對負壓，防止病毒對培養細胞（尤其是細胞庫）的污染。

5. 如何檢驗培養基滅菌是否徹底

將五組培養基放入28°的恆溫培養箱中培養（放入培養箱主要為了防止被外界細菌污染，28°是大部分微生物的最適生長溫度）。一般培養兩天左右就可觀察培養基結果，如果培養基中長出黴菌則待測樣品被污染。

確認溫度指示，感測器，溫度記錄儀的讀數值：空載熱分布測試時同時監測設備自身控制系統的溫度顯示示數和驗證儀冷點溫度探頭顯示示數，並記錄3次。

(5)檢測培養基滅菌效果的常用方法擴展閱讀：

注意事項：

1、使用前應仔細閱讀說明書，嚴格按要求操作。

2、先在高壓蒸汽滅菌鍋內加水，加水量應按照說明書上要求。

3、不可裝太滿，否則因壓山畢爛力與溫度不對應，造成滅菌不徹底。

4、記住達到所需壓力的時間，通常滅菌要求1.1kgf/cm2,鍋內達121℃，按不同滅菌要求維持壓力15-40分鍾。

5、不能隨意延長滅菌時數鋒間和增加壓力。培養基要求比較嚴格，既要保證滅菌徹底，又要防止培養基中的成分變質或效力降低，瓊脂在逗漏長時間滅菌後凝固力也會下降，以致不凝固。

6. 新配製的培養基如何滅菌如何檢測效果

用高壓蒸汽滅菌法滅菌，將滅菌後的培養基運改放入恆溫培養箱中培養，觀察是否漏悄鉛有菌落產生，若沒有，則證明培養基消毒返好完全

7. 如何檢驗滅菌後的培養基是否合格

把滅菌後的培養基按滅菌鍋內的不同位置，每處抽取弊源數管(瓶)，標上記號，置25℃～30℃培養一周左右進行檢查。如果培養基沒有什麼變化，說明哪卜隱滅菌效果良好；如果某一位置的培養基出現了雜菌菌落，可能是擺放的太緊，導致蒸汽不暢，或鍋的結構不合理等原因所致，應根據上述情況進行改進；如果大部分或全部菌種瓶都出現雜李廳菌，說明滅菌溫度或滅菌時間不夠，應提高壓力或延長滅菌時間。經過幾次檢驗都證明能徹底滅菌後，以後按同樣條件滅菌的則不必進行檢查。
經過幾次檢驗都證明能徹底滅菌後,以後按同樣條件滅菌的則不必進行檢查。

8. 如何檢驗培養基滅菌是否徹底

將五組培養基放入28°的恆溫培養箱中培養（放入培養箱主要為了防止被外界細菌污染，28°是大部分微生物的最適逗漏生長溫度）。一般培養兩天左右就可觀察培養基結果，如果培數鋒養基中長出黴菌則待測樣品被污染。

確認溫度指示，感測器，溫度記錄儀的讀數值：空載熱分布測試時同時監測設備自身控制系統的溫度顯示示數和驗證儀冷點溫度探頭顯示山畢爛示數，並記錄3次。

(8)檢測培養基滅菌效果的常用方法擴展閱讀：

注意事項：

1、使用前應仔細閱讀說明書，嚴格按要求操作。

2、先在高壓蒸汽滅菌鍋內加水，加水量應按照說明書上要求。

3、不可裝太滿，否則因壓力與溫度不對應，造成滅菌不徹底。

4、記住達到所需壓力的時間，通常滅菌要求1.1kgf/cm2,鍋內達121℃，按不同滅菌要求維持壓力15-40分鍾。

5、不能隨意延長滅菌時間和增加壓力。培養基要求比較嚴格，既要保證滅菌徹底，又要防止培養基中的成分變質或效力降低，瓊脂在長時間滅菌後凝固力也會下降，以致不凝固。

9. 微生物檢測中常用滅菌和消毒方法匯總......

消毒和滅菌兩個詞在實際使用中常被混用，其實它們的含義是有所不同的。消毒是指應用消毒劑等方法殺滅物體表面和內部的病原菌營養體的方法，而滅菌是指用物理和化學方法殺死物體表面和內部的所有微生物，使之呈無菌狀態。

利用溫度進行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高溫可使微生物細胞內的蛋白質和酶類發生變性而失活，從而起滅菌作用，低溫通常起抑菌作用。

a.灼燒滅菌法：

利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合於接種針、環、試管口及不能用的污染物品或實驗動物的屍體等的滅菌。

b.乾熱空氣滅菌法：

這是實驗室中常用的一種方法，即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160℃，恆溫1小時即可。此法適用於玻璃皿、金屬用具等的滅菌。

在同樣的溫度下，濕熱滅菌的效果比乾熱滅菌好，這是因為一方面細胞內蛋白質含水量高，容易變性。另一方面高溫水蒸汽對蛋白質有高度的穿透力，從而，加速蛋白質變性而迅速死亡。

a.巴氏消毒法：

有些食物會因高溫破壞營養成分或影響質量，如，牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物的營養和風味，又進行了消毒，保證了食品衛生。該法一般在62℃，30分鍾即可達到消毒目的。此法為法國微生物學家巴斯德首創，故名為巴氏消毒法。

b.煮沸消毒法：

直接將要消毒的物品放入清水中，煮沸15分鍾，即可殺死細菌的全部營養和部分芽孢。若在清水中加入1%碳酸鈉或2%的石炭酸，則效果更好。此法適用於注射器、毛巾及解剖用具的消毒。

c.間歇滅菌法：

上述兩種方法在常壓下，只能起到消毒作用，而很難做到完全無菌。若採用間歇滅菌的方法，就能殺滅物品中所有的微生物。具體做法是：將待滅菌的物品加熱至100℃，15～30分鍾，殺死其中的營養體。然後冷卻，放入37℃恆溫箱中過夜，讓殘留的芽孢萌發成營養體。第2天再重復上述步驟，三次左右，就可達到滅菌的目的。此法不需加壓滅菌鍋，適於推廣，但操作麻煩，所需時間長。

d.加壓蒸汽滅菌法：

這是發酵工業、醫療保健、食品檢測和微生物學實驗室中最常用的一種滅菌方法。它適用於各種耐熱、體積大的培養基的滅菌，也適用於玻璃器皿、工作服等物品的滅菌。

加壓蒸汽滅菌是把待滅菌的物品放在一個可密閉的加壓蒸汽滅菌鍋中進行的，以大量蒸汽使其中壓力升高。由於蒸汽壓的上升，水的沸點也隨之提高。在蒸汽壓達到1.055公斤/厘米2時，加壓蒸汽滅菌鍋內的溫度可達到121℃。在這種情況下，微生物（包括：芽孢）在15～20分鍾便會被殺死，而達到滅菌目的，如，滅菌的對象是砂土、石蠟油等面積大、含菌多、傳熱差的物品，則應適當延長滅菌時間。

在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個問題是，在恆壓之前，一定要排盡滅菌鍋中的冷空氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對應關系，這樣會大大降低滅菌效果。

a.不同的微生物或同種微生物的不同菌齡對高溫的敏感性不同。多數微生物的營養體和病毒在50～65℃，10分鍾就會被殺死；但各種孢子、特別是芽孢最能抗熱，其中抗熱性最強的是嗜熱脂肪芽孢桿菌，要在121℃，12分鍾才被殺死。對同種微生物來講，幼齡菌比老齡菌對熱更敏感。

b.微生物的數量多少顯然會影響滅菌的效果，數量越多，熱死時間越長。

c.培養基的成分與組成也會影響滅菌效果。一般地講，蛋白質、糖或脂肪存在，則提高抗熱性，pH在7附近，抗熱性最強，偏向兩極，則抗熱能力下降，而不同的鹽類可能對滅菌產生不同的影響；固體培養基要比液體培養基滅菌時間長。

a.pH值普遍下降。

b.產生混濁或沉澱，這主要是由於一些離子發生化學反應而產生混濁或沉澱。

例如，Ca2+與PO4-3化合，就會產生磷酸鈣沉澱。

c.不少培養基顏色加深。

d.體積和濃度有所變化。

e.營養成分有時受到破壞。

輻射

利用輻射進行滅菌消毒，可以避免高溫滅菌或化學葯劑消毒的缺點，所以應用越來越廣，目前主要應用在以下幾個方面：

1）接種室、手術室、食品、葯物包裝室常應用紫外線殺菌。

2）應用β射線作食品表面殺菌，γ射線用於食品內部殺菌。經輻射後的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使保存期延長。

過濾

採用機械方法，設計一種濾孔比細菌還小的篩子，做成各種過濾器。通過過濾，只讓液體培養基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在篩子上面，從而達到除菌的目的。這種滅菌方法適用於一些對熱不穩定的體積小的液體培養基的滅菌以及氣體的滅菌。它的最大優點是不破壞培養基中各種物質的化學成分。但是比細菌還小的病毒仍然能留在液體培養基內，有時會給實驗帶來一定的麻煩。

一般化學葯劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微生物，所以，是起消毒劑的作用，而不是滅菌劑。

能迅速殺滅病原微生物的葯物，稱為消毒劑。能抑制或阻止微生物生長繁殖的葯物，稱為防腐劑。但是一種化學葯物是殺菌還是抑菌，常不易嚴格區分。消毒劑在低濃度時也能殺菌（如，1：1000硫柳汞）。由於消毒防腐劑沒有選擇性，因此，對一切活細胞都有毒性，不僅能殺死或抑制病原微生物，而且對人體組織細胞也有損傷作用，所以只能用於體表、器械、排泄物和周圍環境的消毒。常用的化學消毒劑有：石碳酸、來蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。

10. 在微生物的培養過程中,實驗室對培養基滅菌常用的方法是________。為防止冷凝

（1）在微生物的培養過程中，實驗室對培養基滅菌常用的方法是高壓蒸汽滅菌．為防止冷凝水影響細菌的生長，需將培養皿倒置培養．
（2）接種時接種環需要灼燒滅菌；在第二次及以後劃線時，總是從上一次的末端開始劃線，這樣做的目的是通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌體的數目逐漸減少，以便得到單個菌落．每次劃線之前及接種之後都要對接種環進行滅菌，因而劃5個區域，則需要6次灼燒接種環．該培養基從物理狀態上看，屬於固體培養基．
（3）檢測自來水中大腸桿菌的數量，可選用伊紅美藍培養基，伊紅美藍培養基除了為大腸桿菌的生長繁殖提供水和碳源外，還可以提供氮源和無機鹽等基本營養成分．該研究小組在統計菌落數目時，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，這樣可以防止因培養時間不足而遺漏菌落的數目，圖中菌落分布不均勻，由此推測該同學接種時可能的操作失誤是塗布不均勻．
故答案為：
（1）高壓蒸汽滅菌 倒置
（2）6 固體
（3）氮源和無機鹽 培養時間不足 塗布不均勻