對pcr產物檢測的方法

❶ qPCR檢測，你需要知道這些

生物學劃分為兩個時代：PCR前時代和PCR後時代，這是《紐約時報》對穆利斯先生發明PCR技術的評價。1983年，Kary B. Mullis提出了PCR技術的構想， 1985年，他們在Science發表了遲蠢握相關的論文。論文由Mullis的同事Randall K. Saiki領銜發表，1988年Saiki等分離純化了Taq DNA聚合酶，並將其應用於PCR反應，使PCR變得更加簡單、易行和穩定，隨後PCR技術迎來了蓬勃發展的時期。PCR根據其分析精度，大致經歷了以下三個階段：（I）終點PCR：定性分析（II）定量PCR：相對定量（III）數字PCR：絕對定量

早期PCR主要用於定性分析，根據反應終點產物的有或無檢測靶標序列存在與否，這種PCR可以稱為終點PCR，在基因鑒定、病原核酸檢測等領域具有廣泛應用。

1990年，Simmonds等就通過對終點產物的梯度稀釋對HCV、HIV等病原體進行了粗略的拷貝數鑒定，這可能是最早的定量PCR研究。不過需要澄清一下，這里所說的定量PCR還不是指熒光定量PCR，那時還沒有將熒光物質用於PCR產物的監控。直到1992年，羅氏公司的R Higuchi等在Nature發表論文，介紹了將溴化乙錠（EB）用於PCR產物動態監控的方法，這可能是最早的熒光定量PCR技術了。1996年，ABi公司公布了基於Taqman探針的qPCR技術。1997年，Wittwer等比較了（i）基於雙鏈特異性染料SYBR Green I（ii）基於5』-核酸酶和雙標探針（iii）基於Cy5的分子信標的qPCR的特點。這些研究為後來qPCR的廣泛應用奠定了基礎。

一般，人們習慣把qPCR分為相對定量和絕對定量，不過本質上來說，qPCR只能用於相對定量，絕對定量的實現往往需要藉助「外力」。 PCR擴增是一種指數擴增，理想狀態下，產物濃度與起始濃度存在如下關系：N T = N 0 ×2 n （N 0 代表起始濃度，N T 代表終點濃度，n代表循環數），對公式兩邊取以對數可得：log N T = logN 0 + n×log2（log代表以自然常數e為底的對數），如果我們把PCR終點的判斷信號固定成一個統一的值（即qPCR中的熒光閾值），那麼循環數與起始濃度的對數就成了線性關系，這就是qPCR相對定量的基本原理。不過有兩個因素：（1）人的肉眼無法准確的判斷PCR終點信號，於是出現了特殊的設備—熒光PCR儀；（2）不同的靶標基因的擴增效率不同，因此無法直接比較，因此催生了 ∆∆ Ct法。

真正的絕對定量PCR稱為數字PCR（dPCR，1999年Kinzler等首次提出數字PCR的概念），它是在終點PCR和極限稀釋的基礎上通過泊松分布計算得出拷貝數的絕對定量方法。在Simmonds等的研究中，他們通過將DNA分子稀釋到單拷貝，然後根據PCR的終點信號和泊松分布規律，計算了靶標基因的分子數目，不過他們沒有進一步發展該技術，很長一段時間內該技術都是以分子計數的特點應用的。dPCR一方面因受到qPCR的長期壓制，另一方面受到檢測儀器的限制，直到2006年以後才逐漸顯示出技術復甦的景象。

1993年，Zachar等在《核酸研究》上介紹了利用PCR對靶標基因進行相對定量的數學原理；2001年，Livak KJ等介紹了2 - ∆∆ Ct 法的推導過程，局限性及應用。

當然這些原理很簡單，即使不看論文也很容易理解。因為PCR的指數擴增，當我們把終點的判斷標准固定時，起始模板量高的樣本最先到達，起始模板量低碼慶的樣本消耗更多的循環數，並且每相差一個循環，代表起始濃度相差2倍，即N1/N2 = 2 -(Ct1-Ct2) 。檢測不同樣本時， ∆ Ct可能受樣本量差異的影響，因此引入了內參基因的校正。內參基因，也叫管家基因或者看家基因，一般認為他們在生物體不同時空組織中保持恆定表達，那麼兩個樣本內參基因的 ∆ Ct就代表了樣本量的差異，靶標基因的 ∆ Ct – 內參基因的 ∆ Ct即為靶標基因的真實表達量差異，這就是2 - ∆∆ Ct 法。

但檔皮是有幾個問題需要注意：（1）PCR並非全程都是指數增長期，比較必須在對數擴增期進行（2）一般默認對數增長期擴增效率是100%，這並不嚴謹，尤其是一些擴增困難的模板，效率可能與100%差異很大，縱向分析某基因的表達量（如基因A在不同生產階段/不同組織的表達量）時，仍使用2 - ∆∆ Ct 可能並不太准確（3）不同靶標基因的擴增效率是不同的，因此橫向比較不同靶標基因時，可能造成較大的誤差。

鑒於此，我們在設計引物時，應該盡可能使靶標的長度、GC%、Tm保持接近，從而保證相近的擴增效率。 PrimerBank 和 qPrimerDB 分別是國外和國內比較優秀的qPCR引物檢索網站，收錄了大量物種的qPCR引物數據，具有一定參考價值。此外，Pfaffl等(2001)，Rao(2013)等對2 - ∆∆ Ct 法進行了一些校正，採用的方法主要就是通過對同一模板梯度稀釋進行擴增效率校正，具有一定參考意義。

qPCR絕對定量有兩種方法：（1）先獲得一個拷貝數已知的參照基因，再獲得靶標基因與該參照的比值，然後根據已知值獲得檢測樣本的確切數目，從這個角度看絕對定量就是藉助了「拷貝數已知」這一外力的相對定量。1990年，Gilliland等就描述了這一原理。（2）Simmonds等報道的方法，將DNA模板做極限稀釋，一直到PCR體系中僅含有一個模板分子，此時只需要乘以稀釋倍數就可以得到樣本中靶標基因的拷貝數。這一方法是dPCR的技術原型，在實際操作中很有困難，首先需要很多稀釋梯度，其次普通的10-20uL體系中僅含有一個模板分子經常很難擴增成功。

絕對定量最廣泛的應用是分子計數，如RNA分子數的精確測定，DNA基因組上的基因拷貝數鑒定等。Southern雜交法是外源基因拷貝數鑒定使用最廣泛的方法，但隨著qPCR技術的不斷發展，基於qPCR絕對定量的拷貝數鑒定的報道逐漸增多，並且大量研究表明qPCR方法與Southern雜交得到的結果基本一致甚至更加精確。Song等(2002)利用qRT-PCR估計了轉基因玉米愈傷組織和植物中的轉基因拷貝數，該研究還使用Southern雜交重新測量了玉米愈傷組織和植物中的「精確」轉基因拷貝數，結果qRT-PCR的測量結果與「精確」結果有較高相關性，因此，他們認為 qRT-PCR可以作為一種評估轉基因玉米拷貝數的有效手段。

拷貝數鑒定的關鍵是獲得一個拷貝數已知的標准品，質粒容易提取和純化，因此常用於構建絕對定量的標准品。把攜帶靶標基因的重組質粒提純到極高的純度，精確測定其核酸濃度，根據公式：N = 6.02 × 10 23 (/mol) × M DNA (g) / (DNA length(bp) × 650(g/mol/bp)) 即可計算出標准品拷貝數，式中N代表分子數目，M DNA 代表質粒重量。以此標准品繪制logN與Ct的標准曲線，然後根據靶標基因的Ct值即可反推出靶標基因的精確個數。同時我們要從基因組上選擇一個基因拷貝時已知的參照基因，按同樣方式繪制標准曲線、進行分子計數，然後測定統一樣本中把靶標基因與參照基因的分子數，帶入上述公式即可得到靶標基因的實際拷貝數。一般，應該選擇基因組上拷貝數較低，物種內保守性極高的基因作為參照基因。

拷貝數鑒定具有多種形式，雙標准曲線並不是必需的，如果能夠確認靶標基因與參照基因的擴增效率都接近100%，也可使用2 - ∆∆ Ct 法測量靶標基因的拷貝數，林維石等(2013)就通過該方法得到了與Southern雜交一致的拷貝數鑒定結果。

基因分型的方法有很多，Landegren等(1998)在報道中綜述了多種用於基因分型的技術方法，其中發展到現在應用最為廣泛的就是qPCR法和測序法。測序法最為准確，並且能夠發現新基因型，是基因分型或SNP檢測的金標准，但它比較慢，且操作比較繁瑣。qPCR檢測操作簡單且速度極快，目前有十分廣泛的應用。

qPCR法基因分型的基本原理是：3』-末端不匹配的引物無法正常擴增靶標基因。1989年，Wu等和Newton等先後報道了ASPCR法和法用於檢測等位基因，這種方法容易理解，假設已知SNP位點為A/T，如果3』-A引物PCR產物產生終點信號可判斷為A基因型，3』-T引物產生終點信號為T基因型，兩種引物均產生信號即為雜合型。1995年，Livak等報道了利用不同熒游標記的探針檢測SNP的方法，這種方法中，分別針對兩種基因型設計兩條不同熒游標記的探針，並設置純和基因型的對照，隨著PCR擴增如果熒光信號靠近A參照代表A基因型，靠近B參照代表B基因型，如果位於A和B之間則為雜合型（如下圖）。

2003年，Papp等報道了一種基於高解析度溶解曲線的SNP分型方法，這種方法也是基於3』-末端不匹配的引物，A基因型設計正常長度的引物，B基因型則在引物5』端添加10-15bp的高GC序列，經過PCR擴增後，不同基因型產物的Tm就會發生變化，依賴於qPCR儀的高解析度溶解曲線，可以快速區分基因型。

1995年以後，qPCR相關的研究論文數量呈指數式增長，成為分子生物學最熱門的領域之一。近年來，隨著分子診斷行業的崛起，qPCR在醫療領域發揮著越來越重要的作用。qPCR在快速發展的同時，也產生了一些問題，如判斷標准不一致，檢測精確度沒有統一標准，RNA檢測假陽性較嚴重等。2009年，多個科研院所及醫療單位合作發布了qPCR的 MIQE指南 ，該指南規范了qPCR的常用術語，如Ct應稱為Cq，RT-PCR應寫作RT-qPCR等，並對分析的敏感性、特異性、精度等進行了規范性要求，此外指南還對樣本處理、核酸提取、逆轉錄、qPCR甚至數據分析都作了詳盡的規范。該指南由9部分組成，共85個參數，以確保以qPCR實驗的實用性、准確性、正確性和可重復性。雖然該指南已經有些年份，但遵守這些規范能夠讓你的研究更易重復，也有助於審稿人和編輯快速評估你的稿件。

註：指南的內容和附表可以在這里獲取： http://rdml.org/miqe.html

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❷ 什麼是PCR檢測他的原理是什麼需要什麼材料

• 聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究 的目的基因或某一DNA片段於數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。

• PCR技術簡史

• PCR的最早設想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力於研究基因的體外分離技術，Korana於1971年最早提出核酸體外擴增的設想：「經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，並不斷重復該過程便可克隆tRNA基因」。

• PCR的實現 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似於DNA的體內復制，只是在試管中給 DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。

• PCR的改進與完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之 間的鹼基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點，但由於 Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得 PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h後其殘留活性大於原來的90%，在93℃下反應2h後其殘留活性是原來的 60%，在95℃下反應2h後其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應後再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效 率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由於提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發現使PCR廣泛的被應用。

• PCR技術基本原理

• PCR技術的基本原理 類似於DNA的 天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引 物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需 2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平台期(Plateau)所需循環次數取決於樣品中模板的拷貝。

• PCR的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增後的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%， 但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進 入線性增長期或靜止期，即出現「停滯效應」，這種效應稱平台期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情 況下，平台期的到來是不可避免的。

• PCR擴增產物 可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5』端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由於引物所 結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3』端開始延伸，其5』端是固定的，3』端則沒 有固定的止點，長短不一，這就是「長產物片段」。進入第二周期後，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即「長產物片段」)結合。引物在與新鏈結合 時，由於新鏈模板的5』端序列是固定的，這就等於這次延伸的片段3』端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定於引物擴增序列以內、形成長短一致的 「短產物片段」。不難看出「短產物片段」是按指數倍數增加，而「長產物片段」則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。

• PCR反應體系與反應條件

• 標準的PCR反應體系：

• 10×擴增緩沖液 10ul

• 4種dNTP混合物 各200umol/L

• 引物 各10～100pmol

• 模板DNA 0.1～2ug

• Taq DNA聚合酶 2.5u

• Mg2+ 1.5mmol/L

• 加雙或三蒸水至 100ul

• PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

• 引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

• 設計引物應遵循以下原則：

• ①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

• ②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

• ③引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

• ④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3』端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

• ⑤引物3』端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗。

• ⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

• ⑦引物的特異性：引物應與核酸序列資料庫的其它序列無明顯同源性。

• 引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

• 酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

• dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度後，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配製)，如其中任何一種濃度不同於其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

• 模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常採用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。 SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，並解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉澱；蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉澱 核酸。提取的核酸即可作為模板用於PCR反應。一般臨床檢測標本，可採用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接 用於PCR擴增。RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

• Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

• PCR反應條件的選擇

• PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

• 溫度與時間的設置： 基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標准反應中採用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火並結合到靶序列上，然後快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對於較短靶基因(長度為100～300bp時)可採用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般採用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

• ①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低於93℃則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。

• ②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由於模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度，還有靶基序列的長 度。對於20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

• Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

• 復性溫度=Tm值-(5～10℃)

• 在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

• ③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：

• 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

• 70℃ 60核苷酸/S/酶分子

• 55℃ 24核苷酸/S/酶分子

• 高於90℃時， DNA合成幾乎不能進行。

• PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。

• 循環次數 循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決於模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30～40次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。

• PCR反應特點

• 特異性強 PCR反應的特異性決定因素為：

• ①引物與模板DNA特異正確的結合；

• ②鹼基配對原則；

• ③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；

• ④靶基因的特異性與保守性。

• 其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循鹼基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。

• 靈敏度高 PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

• 簡便、快速 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好後，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

• 對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗製品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗製的DNA擴增檢測。 PCR擴增產物分析

• PCR產物是否為特異性擴增 ，其結果是否准確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論。PCR產物的分析，可依據研究對象和目的不同而採用不同的分析方法。

• 凝膠電泳分析：PCR產物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性。PCR產物片段的大小應與預計的一致，特別是多重PCR，應用多對引物，其產物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。

• 瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。

• 聚丙烯醯胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯醯胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用於科研及檢測分析。

• 酶切分析：根據PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離後，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。

• 分子雜交：分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據，也是檢測PCR 產物鹼基突變的有效方法。

• Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記後做探針，與PCR產物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用於科研。

• 斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用於PCR產物特異性鑒定及變異分析。

• 
  

❸ 熒光定量PCR的操作步驟

熒光定量PCR實驗步驟： ①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鍾使其完全溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振盪管體15秒後，15到30℃孵育2到3分鍾。4℃下12000rpm離心15分鍾。離心後混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配於水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉澱 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉澱其中的RNA，混勻後15到30℃孵育10分鍾後，於4℃下12000rpm 離心10分鍾。此時離心前不可見的RNA沉澱將在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配製），清洗RNA沉澱。混勻後，4℃下7000rpm離心5分鍾。
⑤RNA乾燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉澱在室溫空氣中乾燥5-10分鍾。
⑥溶解RNA沉澱 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存於-80℃待用。 1）紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然後取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）後，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 μg/ml。具體計算如下：
RNA溶於40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用來測量以後，剩餘樣品RNA為35 μl，剩餘RNA總量為：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制膠
1g瓊脂糖溶於72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS電泳緩沖液
濃度 成分
0.4M MOPS，pH 7.0
0.1M 乙酸鈉
0.01M EDTA
灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝後取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
②准備RNA樣品
取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB於甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鍾使樣品變性。
③電泳
上樣前凝膠須預電泳5min，隨後將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。
④紫外透射光下觀察並拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定於用於抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。 ①反應體系 序號 反應物 劑量 1 逆轉錄buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5 逆轉錄酶MMLV 0.5μl 6 DEPC水 5μl 7 RNA模版 2μl 8 總體積 10μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鍾，取出後立即冰水浴至管內外溫度一致，然後加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鍾。
③取出後立即95℃干浴3分鍾，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存於-80℃待用。 管家基因（β-actin）實時定量PCR
①β-actin陽性模板的標准梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl並充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應體系如下：
標准品反應體系 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 陽性模板上游引物F 0.5μl 3 陽性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 陽性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
管家基因反應體系： 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 內參照上游引物F 0.5μl 3 內參照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待測樣品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標准品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃2分鍾，然後93℃ 1分鍾，55℃ 2分鍾，共40個循環。 ①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。
反應體系： 序號 反應物 劑量 1 10×PCR緩沖液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至總體積為 25ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
35個PCR循環（94℃1分鍾；55℃1分鍾；72℃1分鍾）； 72℃延伸5分鍾。
②PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。
③將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。 ①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。
體系配置如下： 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dNTP 1ul 5 Taq聚合酶 2ul 6 待測樣品cDNA 5ul 7 ddH2O 30ul 8 總體積 50 ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②將配製好的PCR反應溶液置於Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃2分鍾預變性，然後按93℃ 1分鍾，55℃1分鍾，72℃1分鍾，共40做個循環，最後72℃7分鍾延伸。 各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

❹ 如何通過電泳對PCR的產物大小進行檢測

通過電泳進行產物定量只是相對的大概估算，一般的marker都有這樣的功能，比如你的產物小辯歷衫於2000bp的話，你在泳道加入5ul
的TAKARA的DL2000marker，爛橋其中最亮的一條帶750bp含量約為150ng，其他的條帶約攜腔為50ng，根據你的條帶的明暗和marker進行比較，即可粗略的估算你的產物的量。

❺ PCR產物的檢測方法有哪些都有什麼原理

1.瓊脂糖凝膠電泳
同時點分子量marker，根據marker條帶判斷產物分子量大小，從而大致判斷是不是你要的
2.酶切
已知你產物的序列，看上面有什麼酶切位點，用一個酶或者兩個酶切斷，看與理論預測的條帶數目和大小是否一致。一般檢測有以上兩步就行了，如果需要知道確切的需要進行3
3.測序
連接到pMD-18t
載體上，轉到大腸桿菌中。拿到公司去測序，測序結果通過gene
bank比對看與哪個基因一致，這種方法最准確
4.表達
pcr產物連到真核或者原核表達載體上，適宜條件表達出來以後的蛋白做質譜分析，看與理論產物表達的蛋白是否有一致的片段

❻ RT-PCR檢測方法的具體步驟

RT-PCR檢測方法的具體步驟如下：

（一）RNA提取
1、根據標本數量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500μL（在體系配製區操作）。
2、在生物安全櫃內將采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養物（雞胚尿囊液或細胞培養液）取100μL加入RLT液管中，充分混勻。 3、每管分別加入5μL β-巰基乙醇，混勻後依次加入600μL 70%的乙醇，充分混勻。
4、從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，打開包裝將其做好標記。取步驟（3）中的混合液600μL加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。
5、濾柱仍放回收集管上，將步驟（3）剩餘的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。
6、於濾柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，離心15s。
7、從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支幹凈的2mL收集管，將離心後的濾柱移到新的收集管上，於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，離心15s。
8、棄收集管中的離心液，再於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，離心2min。
9、將濾柱移到一個干凈的1.5mL eppendorf管上，向濾柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室溫靜置1~3min。
10、12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實驗或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之間加44mL無水乙醇。
（二）反應體系配製
1、實驗設計： 檢測標本RNA
陰性對照：無菌水（標本RNA提取時，跟標本同時提取無菌水。） 陽性對照：已知病毒RNA

2、PCR反應體系配製（在體系配製區配反應液） 1）按下表加入試劑： PCR反應體系
對每一個建立的反應確定反應數（n=擬進行的PCR管數，包括陰性，陽性對）。考慮到陰性無模板對照，陽性對照，誤差，制備過量的反應混合物是必要的。具體如下：
（1）如果包括對照，樣品的數量（n）為1到14，那麼N=n+1；
（2）如果包括對照，樣品的數量（n）大於15，那麼N=n+2。
2）將上述反應液混勻，分裝到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分別做好標記。

3）加RNA模板（在核酸提取區）
將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對照管（5μL無菌水），然後分別加標本RNA（每管5μL），最後加入陽性對照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反應
將上述加好模板的反應管混勻，短暫離心後放入PCR儀進行RT-PCR 擴增。

4、RT-PCR產物檢測
1）2.0％瓊脂糖凝膠制備：稱取2.0g Agarose，倒入耐熱玻璃瓶內，再加入電泳液（1×TBE）100mL，輕輕混勻後加熱，使Agarose完全熔化。待Agarose膠溫度降至50～60℃左右，加入核酸染料，輕輕混勻（不要產生氣泡）。待膠溫度降至50℃左右時，將其倒入制膠板，插好電泳梳子。待膠完全凝固（約30～60min）之後，將梳子拔出。
2）將制備好的電泳膠放入電泳槽（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TBE）浸過膠面即可。
3）PCR產物各取10μL，加入2μL上樣緩沖液（6×Loading Buffer），混勻後加入電泳膠孔內（先加Marker（DL－2000）5μL，然後依次加標本PCR產物，再加陰性對照，最後加陽性對照產物）。 4）電泳電壓100V，約30～40min後看結果。 5）將電泳膠放入凝膠成像系統觀察結果並照相。
5、結果判斷。

❼ PCR產物的檢測方法有哪些

PCR產物的檢測方法：

1. 瓊脂糖凝膠電泳

   這是實驗室最常用的方法，簡便易行，只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時，由於泳動速度不同而被分離，經溴化乙錠（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子發出熒光而判定其分子的大小。

   用於電泳檢測PCR產物的瓊脂糖濃度常為1%—2%，應該使用純度高的電泳純級瓊脂糖，這種瓊脂糖已除去了熒光抑制劑及核酸酶等雜質。

   （1）制膠

   瓊脂糖凝膠厚度約為3~5mm。過薄則加樣孔樣品會溢出來，過厚觀察時熒光穿透不強以至有些小片段DNA帶型不易分辨。如配製2%凝膠100ml，稱取瓊脂糖2g於三角瓶中，加入100ml0.5×TBE液，微波爐加熱2-5min，使瓊脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室溫等溫度下降至60℃時，加入終濃度0.5μg/ml的EB液，充分混勻後倒板（注意排除氣體）。

   （2）加樣和電泳

   上樣時一般取PCR反應液5~10μl，加入3μl溴酚蘭液，充分混勻，加入凝膠加樣孔中。電泳儀可用一般穩壓可調中壓電泳儀，電泳工作液為0.5×TBE液，接通電源，使樣品由負極向正極移動。60-100V恆壓電泳約30-60分鍾。

   （3）檢測

   將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃台上進行檢測，DNA產物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復合物。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現，並與擴增時所設的陽性對照比較，判斷陽性或陰性結果。也可在電泳時以標準分子量作對照，判斷其擴增片段是否與設計的大小相一致。

2. 聚丙烯醯胺凝膠電泳

   聚丙烯醯胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳繁瑣，但在引物純化、PCR擴增指紋圖、多重PCR擴增、PCR擴增產物的酶切限制性長度多態性分析時常用到。

   聚丙烯醯胺凝膠電泳分辨DNA片段的有效范圍：

   (1)制膠
   

   在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片，放上制膠架，擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板。

   制備適量合適濃度的凝膠，使之略多於膠板。制備100μl體積凝膠的配製方法見下表。

   不同濃度（%）聚丙醯胺凝膠的製法：

   
   

   

   
   

   在加入TEMED和10%過硫酸銨後，立即混勻，倒入放置45℃角的玻璃板內，完全注滿（注意不要有氣泡），迅速將玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子於腔頂並夾緊，待30-60分鍾膠聚合後，取下膠板，放入電泳槽中固定。

   （2）加樣和電泳

   上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液，溢過加樣孔，拔出梳子，排出加樣孔中的氣泡，將PCR產物或限制性內切酶消化產物2與1上樣緩沖液混勻，用微量注射器加入加樣孔底部，使樣品在孔底成一層，兩側孔中加入標準分子量的DNAMarker。

   以2-10V/cm電壓電泳，電泳時間足夠長，使片斷足以分開，待指示劑走到適宜位置時關閉電源，將膠片取出。

   （3）銀染

   分開兩塊玻璃板，將凝膠片放入100ml銀染固定液中振盪15min，雙蒸水洗3次，每次2min，然後將凝膠片轉入100ml0.2%的AgNO3中於搖床上染色約10min，吸去AgNO3液，用雙蒸水洗3次，每次30s，加入100ml顯色液約7-10min，待DNA帶顯示清除時，吸去顯色液，加入固定液Na2CO3，靜置2-3min，取出凝膠觀察。

❽ 科普講堂|實時熒光定量PCR檢測方法

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。目前，PCR成為分子生物學研究必不可少的一部分。實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標准曲線對模板進行定量分析的方法。該項技術可以對DNA、RNA樣品進行相對定量、絕對定量和定性分析，提高了普通PCR技術的特異性和准確性，被廣泛應用於基礎研究、疾病診斷、農業檢測和法醫調查等領域。

一、常規PCR

利用DNA分子會在體外95°高溫時會發生變性解旋變成單鏈，然後降溫到60°C左右時引物會與單鏈DNA按鹼基互補配對原則結合，接著再升高溫度到72°C左右，即DNA聚合酶最適反應溫度，DNA聚合酶會沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成相應的互補鏈，如此循環往復以達到DNA分子擴增的目的，常規PCR技術無法實現精確定量。

二、實時熒光定量PCR

如要對DNA、RNA樣品進行精確定量研究，就需要採用實時熒光定量PCR，根據檢測實時熒光PCR產物的方式不同，實時熒光定量PCR主要有DNA結合染料法、基於探針的化學法、淬滅染料引物法等類型。

1.  DNA 結合染料法

原理 ：應用一種帶有熒光的、非特異的DNA結合染料檢測PCR過程中積累的擴增產物。

應用於核算定量和基因表達驗證。

優缺點： 它們的優點是可以對任何雙鏈DNA 進行定量，不需要探針，具有相對高的靈敏度和可靠性，並且成本低，簡單易用，缺點是它們能在反應中結合所有的DNA雙鏈，其中包括在PCR過程中產生的引物二聚體或其他非特異產物。

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，這是一種可以與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料，不會與單鏈DNA結合，並且在游離狀態下幾乎無熒光，只有與雙鏈DNA結合才會發出熒光，因此將PCR擴增產生的雙鏈DNA數量與熒光強度直接關聯，產生實時監測的效果。

2.  基於探針的化學法

原理： 應用一個或多個熒游標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產物；依賴熒光能量共振傳遞檢測特異性擴增產物。

應用於核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR。

優缺點： 探針法的鑒別能力遠遠大於DNA結合染料法，因為它們只與目的產物結合，從不與引物二聚體或其他非特異產物結合，缺點是它的合成價格高。

探針法中最常用的TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5』末端，而淬滅基團則在3』末端，PCR擴增時在加入引物的同時加入探針，探針完整時，熒光信號被淬滅基團吸收，PCR擴增時，5』→3』外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團和淬滅基團分離，從而檢測器可以接收到熒光信號。

3.  淬滅染料引物法

原理： 採用熒游標記引物擴增，從而使熒游標記基團直接摻入PCR擴增產物中，依賴熒光能量共振傳遞。

應用於核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR

優缺點：探針和目標片段的特異性結合產生熒光信號，因此減少了背景熒光和假陽性，還可進行多重PCR擴增，缺點是原料成本價格高

三、實時熒光PCR儀

實時熒光PCR系統包括熱循環儀，用於熒光激發的光學系統以及用於收集熒光數據和管理分析的計算機軟體，數據通過實時分析軟體以圖表的形式顯示。

❾ PCR產物的檢測方法有哪些

1.瓊脂糖凝膠電泳 同時點分子量marker,根據marker條帶判斷產物分子量大小,從而大致判斷是不是你讓燃要的
2.酶切 已知你產物的序列,看上面有什麼酶切位點,用一個酶或者兩個酶切斷,看與理論預測的條帶數目和大小是否一致.一般檢測有以上兩步就行了,如果需要知道確切的需要進行3
3.測序握余 連接到pMD-18t 載體上,轉到大腸桿菌中.拿到公司去測序,測序結坦皮虛果通過gene bank比對看與哪個基因一致,這種方法最准確
4.表達 pcr產物連到真核或者原核表達載體上,適宜條件表達出來以後的蛋白做質譜分析,看與理論產物表達的蛋白是否有一致的片段

❿ 如何用PCR方法檢測基因的多樣性

多態性（polymorphism）是指處於隨機婚配的群體中，同一基因位點可存在2種以上的基因型。在人群中，個體間基因的核苷酸序列存在著差異性稱為基因（DNA）的多態性(gene polymorphism)。這種多態性可以分為兩類，即DNA位點多態性(site polymorphism)和長度多態性 (longth polymorphism)。

基因多態性的主要檢測方法簡述如下：
1．限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多態性，致使DNA 分子的限制酶切位點及數目發生改變，用限制酶切割基因組時，���鈉�問�亢兔扛銎�蔚某ざ染筒煌��此�降南拗菩雲�緯ざ榷嗵�裕�賈孿拗破�緯ざ確⑸�謀淶拿蓋形壞悖�殖莆�嗵�暈壞恪W鈐縭怯肧outhern Blot/RFLP方法檢測，後來採用聚合酶鏈反應（PCR）與限制酶酶切相結合的方法。現在多採用PCR-RFLP法進行研究基因的限制性片段長度多態性。

2．單鏈構象多態性（SSCP）：是一種基於單鏈DNA構象差別的點突變檢測方法。相同長度的單鏈DNA如果順序不同，甚至單個鹼基不同，就會形成不同的構象。在電泳時泳動的速度不同。將PCR產物經變性後，進行單鏈DNA凝膠電泳時，靶DNA中若發生單個鹼基替換等改變時，就會出現泳動變位（mobility shift），多用於鑒定是否存在突變及診斷未知突變。

3．PCR-ASO探針法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特異性寡核苷酸探針法。在PCR擴增DNA片段後，直接與相應的寡核苷酸探雜交，即可明確診斷是否有突變及突變是純合子還是雜合子。其原理是：用PCR擴增後，產物進行斑點雜交或狹縫雜交，針對每種突變分別合成一對寡核苷酸片段作為探針，其中一個具有正常序列，另一個則具有突變鹼基。突變鹼基及對應的正常鹼 基勻位於寡核苷酸片段的中央，嚴格控制雜交及洗脫條件，使只有與探針序列完全互補的等位基因片段才顯示雜交信號，而與探針中央鹼基不同的等位基因片段不顯示雜交信號，如果正常和突變探針都可雜交，說明突變基因是雜合子，如只有突變探針可以雜交，說明突變基因為純合子，若不能與含有突變序列的寡核苷探針雜交，但能與相應的正常的寡核苷探針雜交，則表示受檢者不存在這種突變基因。若與已知的突變基因的寡核苷探針勻不能雜交，提示可能為一種新的突變類型。

4. PCR-SSO法：SSO技術即是順序特異寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段擴增後利用序列特異性寡核苷酸探針，通過雜交的方法進行擴增片段的分析鑒定。探針與PCR產物在一定條件下雜交具有高度的特異性，嚴格遵循鹼基互補的原則。探針可用放射性同位素標記，通過放射自顯影的方法檢測，也可以用非放射性標記如地高辛、生物素、過氧化物酶等進行相應的標記物檢測。

5. PCR-SSP法：序列特異性引物分析即根據各等位基因的核苷酸序列，設計出一套針對每一等位基因特異性的（allele-specific）、或組特異性 (group-specific)的引物，此即為序列特異性引物（SSP）。SSP只能與某一等位基因特異性片段的鹼基序列互補性結合，通過PCR特異性地擴增該基因片段，從而達到分析基因多態性的目的。

6. PCR-熒光法：用熒游標記PCR引物的5』端，熒光染料FAM和JOE呈綠色熒光，TAMRA呈紅色熒光，COUM 呈蘭色熒光，不同熒游標記的多種引物同時參加反應，PCR擴增待檢測的DNA，合成的產物分別帶有引物5』端的染料，很容易發現目的基因存在與否。

7. PCR-DNA測序：是診斷未知突變基因最直接的方法，由於PCR技術的應用，使得DNA 測序技術從過去的分子克隆後測序進入PCR直接測序。PCR產物在自動測序儀上電泳後測序。常用方法有：Sanger雙脫氧末端終止法;Maxam-Gilbert化學裂解法；DNA測序的自動化。目前DNA順序全自動激光測定法是最先進的方法。

8. PCR指紋圖法（PCR-fingerprints）：實用於快速的同種異型DR/Dw配型。在DR/DW純合子及雜合子個體中，每種DR單倍型及每種單倍型組合所產生的單鏈環狀結構的大小、數目和位置各異，由於同質雙鏈和異質雙鏈之間的分子構象不同。因此，在非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳時，它們的遷移率各不相同，從而獲得單倍型特異的電泳帶格局即PCR指紋。也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作為探針，同經過酶切的人體DNA作Southern blot，可以得出長度不等的雜交帶，雜交帶的數目和分子量的大小具有個體特異性，除非同卵雙生，幾乎沒有兩個人是完全相同的，就象人的 指紋一樣，人們把這種雜交帶圖形稱為基因指紋(gene finger-printing)。

9. 基因晶元法：又稱為DNA 微探針陣列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探針，通過與被標記的若干靶核酸序列互補匹配，與晶元特定位點上的探針雜交，利用基因晶元雜交圖象，確定雜交探針的位置，便可根據鹼基互補匹配的原理確定靶基因的序列。這一技術已用於基因多態性的檢測。對多態性和突變檢測型基因晶元採用多色熒光探針雜交技術可以大大提高晶元的准確性、定量及檢測范圍。應用高密度基因晶元檢測單鹼基多態性，為分析SNPs提供了便捷的方法。

10. AFLP（Amplication Fragment Length Polymorphism）法
AFLP技術是一項新的分子標記技術，是基於PCR技術擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內切酶切割，然後將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點。限制性片段用二種酶切割產生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。它結合了RFLP和PCR技術特點，具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性。由於AFLP擴增可使某一品種出現特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產生，因此，這種通過引物誘導及DNA擴增後得到的DNA多態性可做為一種分子標記。AFLP可在一次單個反應中檢測到大量的片段。以說AFLP技術是一種新的而且有很大功能的DNA指紋技術。

11. DGGE（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE）法
變性梯度凝膠電泳法（） DGGE法分析PCR產物，如果突變發生在最先解鏈的DNA區域，檢出率可達100％，檢測片段可達1kb，最適圍為100bp-500bp。基本原理基於當雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時，DNA發生部分解鏈，電泳適移率下降，當解鏈的DNA鏈中有一個鹼基改變時，會在不同的時間發生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。由於本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，需要一套專用的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利於檢測發生於高熔點區的突變。在DGGE的基礎上，又發展了用濕度梯度代替化學變性劑的TGGE法（溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的電泳裝置，該法一經建立，操作也較簡便，適合於大樣本的檢測篩選。
12. RAPD（Random amplified polymorphic DNA）法
運用隨機引物擴增尋找多態性DNA片段可作為分子標記。這種方法即為RAPD( Random amplified polymorphic DNA，隨機擴增的多態性DNA)。盡管RAPD技術誕生的時間很短, 但由於其獨特的檢測DNA多態性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術已滲透於基因組研究的各個方面。該RAPD技術建立於PCR技術基礎上,它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列鹼基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯醯胺或瓊脂糖電泳分離,經EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產物DNA片段的多態性,這些擴增產物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對於任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結合位點.這些特異的結合位點在基因組某些區域內的分布如符合PCR擴增反應的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補位置,且引物3'端相距在一定的長度范圍之內,就可擴增出DNA片段.因此如果基因組在這些區域發生DNA片段插入、缺失或鹼基突變就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化,而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。通過對PCR產物檢測即可檢出基因組DNA的多態性。分析時可用的引物數很大,雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。另外，RAPD片段克隆後可作為RFLP的分子標記進行作圖分析。