蘆丁分光光度計檢測方法

1. 以蘆丁標准品做標准曲線為什麼要用亞硝酸鈉溶液,硝酸鋁溶液,氫氧化鈉溶液

這些構成顯色劑，按順序依次加入5%亞硝酸鈉溶液，10%硝酸鋁溶液，5%氫氧化鈉溶液可以使蘆丁顯色（橙紅色）。通常用於總黃酮的含量測定，其原理是：黃酮中的處於相鄰羰基、羥基可以共同絡合金屬而顯色。根據顯色之深淺（即吸光度A值之大小），判斷的總黃酮含量之高低。常用的顯色劑是亞硝酸鈉-硝酸鋁，檢測波長是508nm。步驟:
樣品液 0.5mL（具體的用量視樣品液的濃度而定）→加5%亞硝酸鈉溶液0.15mL
靜置6min→加10%硝酸鋁溶液0.15mL
靜置6min→加4%氫氧化鈉溶液2mL
→加蒸餾水2.2mL（蒸餾水用於稀釋和調總體積，要使待測混合液的總體稱為5mL，2.2mL是暫定的）→待測混合液總體積5mL
→振盪，混勻→靜置3min→分光光度計測A值（測定波長508nm）。

望對您有幫助。

2. 分光光度中採用標准曲線法測定過程及數據處理的方法分別是什麼

儀器與試劑

1．儀器紫外-可見分光光度計；量瓶、移液管、吸量管。

2．試劑亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，乙醇(均為分析純)，5％亞硝酸鈉溶液，10％硝酸鋁溶液，1mol／L氫氧化鈉溶液，30％乙醇溶液，蘆丁對照品，蘆丁(原料葯)。

實驗內容與步驟

1．對照品溶液的制備精密稱取在120℃減壓乾燥至恆重的蘆丁對照品100mg，置100mL量瓶中，加甲醇70mL，置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精密吸取10mL，置100mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得(每1mL中含無水蘆丁0．1mg)。

2．標准曲線的制備精密量取對照品溶液(o．1mg／ml)o．0mL、1．0mL、2．0mL、3．0mL、4．0mL、5．0mL，分別置於10mL量瓶中，各加30％乙醇使成5．0mL，各精密加入5％亞硝酸鈉溶液0．3mL，充分搖勻，放置6分鍾。各精密加入10％硝酸鋁溶液0．3mL，充分搖勻，放置6分鍾。各加1lmol／L氫氧化鈉溶液4．0mL，用蒸餾水稀釋至刻度，充分搖勻，放置15分鍾，用分光光度計，在510nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標准曲線。

3．試樣測定精密量取蘆丁試樣溶液(0．1mg／ml)3.0mL，置10mL量瓶中，按標准曲線制備項下自「各加30％乙醇使成5．0ml。「起依法操作直至測定出樣品的吸光度。

數據處理

1．根據測得的對照品的數據，繪制A—C標准曲線或計算回歸方程。

2．根據測得的試樣的數據，從標准曲線上讀出或由回歸方程計算出試樣溶液中蘆丁的重量(rag)，按下式計算：

3. 測定總黃酮含量方法

一 樣品溶液的制備
70%乙醇溶液，料液比1﹕8 ，80度下迴流2h。 取10g樣品放入圓底燒
瓶中加入80ml 70%乙醇溶液迴流2h,抽濾定容至100ml備用。使用時先
離心再用70%乙醇稀釋10倍做樣品溶液。
二 蘆丁標准品的配置
精密稱取蘆丁2mg，加無水乙醇定容至10ml。製得濃度為0.2mg/ml蘆
丁標准品溶液。
三 顯色方法的確定
1 掃描原液 分別取蘆丁溶液和樣品溶液各1ml，加無水乙醇定容至 25ml，空白對照，全波掃描。
2 硝酸鋁顯色法 分別取蘆丁對照品溶液和樣品溶液各5ml，加5%亞硝酸鈉 溶液（1.25g亞硝酸溶於無水乙醇中定容到25ml容量瓶中) 1ml, 搖勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液(4,4014g硝酸鋁.九水溶於無水乙醇中定容到25ml容量瓶中) 1ml， 搖勻，放置6min，加4%氫氧化鈉試液(2g氫氧化鈉溶於無水乙醇中定容到50ml容量瓶中）10ml, 再加無水乙醇定容至25ml，搖勻，放置15min， 空白對照，全波掃描 bb 。
3 氯化鋁顯色法 分別取蘆丁對照溶液和樣品溶液各5ml ,加1%的氯化鋁溶液（1g氯化鋁溶於無水乙醇中定容到100ml容量瓶中)10ml，搖勻放置10min，空白對照，全波掃描。
4 氫氧化鉀顯色法 分別取蘆丁對照品溶液和樣品溶液各5ml，加3ml10%氫氧化鉀溶液（2.5g氫氧化鉀溶於無水乙醇中定容到25ml容量瓶中），充分搖勻顯色5min後，用無水乙醇定容至25ml, 搖勻，空白對照，全波掃描。
四 顯色條件的確定
五 標准曲線的繪制
分別取1ml,2ml,3ml,4ml,5ml,6ml蘆丁對照品溶液，按所選的顯色方法測定
吸光度，繪制標准曲線。

4. 分光光度計如何測量樣品急急急急急急

分光光度計要測量的樣品必須是均一的溶液，不能有沉澱，如果有沉澱的話就要搖勻。之於為什麼這樣做和可以做哪些測量、如何測量，下面詳述:
分光光度計就是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器。
而分光光度法則是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析。 常用的波長范圍為：(1)200～400nm的紫外光區,(2)400～760nm的可見光區,(3)2.5～25μm（按波數計為4000cm<-1>～400cm<-1>）的紅外光區。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計（或比色計）、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和准確度，所有儀器應按照國家計量檢定規程或本附錄規定，定期進行校正檢定。 單色光輻射穿過被測物質溶液時，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關系如下式： 1 A=log — =ECL T 式中 A 為吸收度； T 為透光率； E 為吸收系數，採用的表示方法是(E1％ 1cm),即吸收度換算成溶液濃度為1％(g/ml)，液層厚度為1cm的數值； C 為100ml溶液中所含被測物質的重量，g(按乾燥品或無水物計算）； L 為液層厚度 ，cm。 物質對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。當已知某純物質在一定條件下的吸收系數後,可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區，除某些物質對光有吸收外，很多物質本身並沒有吸收,但可在一定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色後再測定,故又稱比色分析。由於顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應用標准品或對照品同時操作。
分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用於核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。
分光光度計的簡單原理
分光光度計計採用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光源透過測試的樣品後，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶於緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數。如：1OD 的吸光值分別相當於50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試後的吸光值經過上述系數的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾後測試空白液和樣品液。然而，實驗並非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現出的吸光值漂移越大。
事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內變化，即儀器有一定的准確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的准確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由於樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大於0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。最後是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數和樣品濃度單位選擇一致；不能採用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。
除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用於評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大於1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低於1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大於2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。
蛋白質的直接定量（UV法）
這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然後直接測試蛋白質。由於緩沖液中存在一些雜質，一般要消除320nm 的「背景」信息，設定此功能「開」。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大於0.1A，最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發現讀數「漂移」。這是一個正常的現象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對於比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質定量
蛋白質通常是多種蛋白質的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關，從而反應蛋白質濃度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。
Lowry 法：以最早期的Biuret 反應為基礎，並有所改進。蛋白質與Cu2 反應，產生藍色的反應物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質的蛋白不適合此種方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在鹼性溶液里與Cu2 反應產生Cu ，後者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系極強，反應後形成的化合物非常穩定。相對於Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。
Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，產生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應試劑；化合物可以穩定1小時，方便結果；而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對於去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標准品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。
某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果並不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由於各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結果Lowry，BCA 測出的濃度明顯高於Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標准樣品不一致，測試後的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質，以BSA作標准品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標准品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學構成，尋找化學構成類似的標准蛋白作標准品。另外，比色法定量蛋白質，經常出現的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是，反應後1011分光光度計的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品（包括標准樣品），都必須在此時間內測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質的比色杯，因為反應後的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。
細菌細胞密度（OD 600）
實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要採用分光光度計准確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標准方法。以未加菌液的培養液作為空白液，之後定量培養後的含菌培養液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每台儀器用顯微鏡進行細胞計數，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現菌液的OD值出現負值，原因是採用了顯色的培養基，即細菌培養一段時間後，與培養基反應，發生變色反應。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態。
分光光度計的重要配件—— 比色杯
比色杯按照材質大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據不同的測量體積，有比色杯和毛細比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白，均採用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定。因為反應中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須採用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用於在紫外范圍內測試樣品。
由於另外測試的樣品量不同，所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。目前市場已經存在一種既可用於核酸、紫外蛋白質定量，亦可用於蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50μl，比色杯單個無菌包裝，可以回收樣品。如Eppendorf UVette®塑料比色杯，是目前比色杯市場上一個革新。隨著生命科學以及相關學科發展，對此類科學的實驗研究提出更高的要求，分光光度計將是分子生物學實驗室不可缺少的儀器，也成為微生物、食品、制葯等相關實驗室的必備設備之一。
隨著科技的發展，現在比色杯已經不是使用分光光度計時的必備物品。目前國外Nanodrop公司（現已被Thermo Fisher公司收購）生產的ND1000分光光度計與舊式分光光度計相比，已經可以做到無需稀釋樣品，無需使用比色杯，每次測量僅需1-2μl樣品即可完成測量。