硅膠檢測含磷成分用什麼方法

A. 硅膠層析的注意事項

先根據TLC方法篩選好洗脫劑，使兩相鄰物質Rf值之差最大化 將柱子必須裝平整、均勻 考慮有限柱填料的吸附量 可考慮用剃度法分開並洗脫 柱層析分離的實驗方法和技巧1B= vrGq
常說的過柱子應該叫柱層析分離，也叫柱色譜。我們常用的是以硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱。由於柱分的經驗成分太多，所以下面我就幾年來過柱的體會寫些心得，希望能有所幫助。 壓力可以增加淋洗劑的流動速度，減少產品收集的時間，但是會減低柱子的塔板數。所以其他條件相同的時候，常壓柱是效率最高的，但是時間也最長，比如天然化合物的分離，一個柱子幾個月也是有的。
減壓柱能夠減少硅膠的使用量，感覺能夠節省一半甚至更多，但是由於大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發（有時在柱子外面有水汽凝結），以及有些比較易分解的東西可能得不到，而且還必須同時使用水泵抽氣（很大的噪音，而且時間長）。以前曾經大量的過減壓柱，對它有比較深厚的感情，但是自從嘗試了加壓後，就幾乎再也沒動過減壓的念頭了。
加壓柱是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗劑走的快些。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵（給魚缸供氣的就行）。特別是在容易分解的樣品的分離中適用。壓力不可過大，不然溶劑走的太快就會減低分離效果。個人覺得加壓柱在普通的有機化合物的分離中是比較適用的。 應該是粗長的最好。柱子長了，相應的塔板數就高。柱子粗了，上樣後樣品的原點就小（反映在柱子上就是樣品層比較薄），這樣相對的減小了分離的難度。試想如果柱子十厘米，而樣品就有二厘米，那麼分離的難度可想而知，恐怕要用很低極性的溶劑慢慢沖了。而如果樣品層只有0.5厘米，那麼各組分就比較容易得到完全分離了。當然採用粗大的柱子要犧牲比較多的硅膠和溶劑了，不過這些成本相對於產品來說也許就不算什麼了（有些不環保的說，不過溶劑回收重蒸後也就減小了部分浪費）。 En8-Hc#NC
現在見到的柱子徑高比一般在1：5～10，書中寫硅膠量是樣品量的30～40倍，具體的選擇要具體分析。如果所需組分和雜質分的比較開（是指在所需組分rf在0.2～0.4，雜質相差0.1以上），就可以少用硅膠，用小柱子（例如200毫克的樣品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我覺得可以增加柱子的直徑，比如用3cm的，也可以減小淋洗劑的極性等等。 適用於對氧，水敏感，易分解的產品，可以濕柱，也可以干柱。不過在樣品之前至少要用溶劑把柱子飽和一次，因為溶劑和硅膠飽和時放出的熱量有可能是產品分解，畢竟要分離的是敏感的東東，小心不為過。也是因為分離的東西比較敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至於是加壓、常壓、減壓，隨需而定。因為是schlenk操作，所以點板是個問題，如果樣品是顯色的，恭喜了，不用點板，直接看柱子上的色帶就行了。如果樣品無色，只好准備幾十個schlenk瓶，一瓶一瓶的點，不過幾次之後就知道樣品在哪，也就可以省些了。像我以前過一根無水無氧柱，需要六個schlenk，現在只一個就能把所要的全收集到。
無水無氧柱中用的比較多的是用氧化鋁作固定相。因為硅膠中有大量的羥基裸露在外，很容易是樣品分解，特別是金屬有機化合物和含磷化合物。而氧化鋁可以做成鹼性、中性和酸性的，選擇餘地比較大，但是比硅膠要貴些。聽說有個方法，就是用石英做柱子，然後用HF254做固定相，這樣在柱子外面用紫外燈一照就知道產品在哪裡了，沒有驗證過。哪位做過可以提出來大家參詳參詳。 濕法省事，一般用淋洗劑溶解樣品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶劑越少越好，不然溶劑就成了淋洗劑了。很多樣品在上柱前是粘乎乎的，一般沒關系。可是有的上樣後在硅膠上又會析出，這一般都是比較大量的樣品才會出現，是因為硅膠對樣品的吸附飽和，而樣品本身又是比較好的固體才會發生，這就應該先重結晶，得到大部分的產品後再柱分，如果不能重結晶，那就不管它了，直接過就是了，樣品隨著淋洗劑流動會溶解的。
有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑又不能上柱（比如DMF,DMSO等，會隨著溶劑一起走，顯色是一個很長的脫尾），這時就必須用干法上柱了。樣品和硅膠的量有一種說法是1：1，我覺得是越少越好，但是要保證在旋干後，不能看到明顯的固體顆粒（那說明有的樣品沒有吸附在硅膠上）。 當然是最便宜，最安全，最環保的了。所以大多選用石油醚，乙酸乙酯。文獻中有寫用正己烷的，太貴了，除非特別需要不要用不然銀子嘩嘩的，流的比淋洗劑還快，不過因為極性很小，有時還是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡覺，注意保持清醒別讓溶劑流幹了，那樣柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅膠的吸附是一個放熱過程，所以夏天的時候經常會在柱子里產生氣泡，天氣冷的時候會好一些。甲醇據說能溶解部分的硅膠，所以產品如果想過元素分析的話要留神，應該經過後繼處理，比如說重結晶等。其他的溶劑用的相對較少，要依個人的不同需要選擇了。
由於某些原因，用到的淋洗劑多是大包裝的（便宜嘛），我們這里是用10升或25升的塑料桶裝的，就要注意這些工業品的純度是較低的。經常能夠從送來的大桶底部看見有色的雜質，其他的雜質就可想而知了，所以在比較嚴格的柱分時就要對溶劑重蒸。當然過原料時就可以免去這一步了，反正下面還有提純的方法。
另外溶劑在過柱子後最好也回收使用，一方面環保，另一方面也能節省部分經費，缺點是要消耗一定的人工。這里要注意的是，一般在過柱同時進行的是減壓旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由於揮發度的不同會導致極性的變化，一般會使得極性變大，在梯度淋洗時比較合適，正好極性越來越大了。在過完柱子後，溶劑最後回收要採用常壓，因為在減壓旋蒸時會有部分低沸點的雜質一起出來，常壓時就會減少這種現象，如果雜質和你下面要過的樣品有反應那就慘了。 1、 裝柱
柱子下面的活塞一定不要塗潤滑劑，會被淋洗劑帶到產品中的，可以採用四氟節門的。干法和濕法裝柱覺得沒什麼區別，只要能把柱子裝實就行。裝完的柱子應該要適度的緊密（太密了淋洗劑走的太慢），一定要均勻（不然樣品就會從一側斜著下來）。書中寫的都是不能見到氣泡，我覺得在大多數情況下有些小氣泡沒太大的影響，一加壓氣泡就全下來了。當然如果你裝的柱子總是有氣泡就說明需要多練習了。但是柱子更忌諱的是開裂，甭管豎的還是橫的，都會影響分離效果，甚至作廢！
2、 加樣
用少量的溶劑溶樣品加樣，加完後將下面的活塞打開，待溶劑層下降至石英砂面時，再加少量的低極性溶劑，然後再打開活塞，如此兩三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑，一開始不要加壓，等溶樣品的溶劑和樣品層有一段距離（2～4cm就夠了），再加壓，這樣避免了溶劑（如二氯甲烷等）夾帶樣品快速下行。
3、 淋洗劑的選擇
感覺上要使所需點在rf0.2～0.3左右的比較好。要按照RF的比值來判斷是否效果好，而不是爬得高就好。
4、 樣品的收集
用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。所以如果樣品與硅膠的吸附比較強的話，就不容易流出。這樣就會發生，後面的點先出，而前面的點後出。這時可以採用氧化鋁作固定相。另外，收集的試管大小要以樣品量而定，特別是小量樣品，如果用大試管，可能一根就收到了三個樣品，wuwu。如果都用小試管那工作量又太大。
5、最後的處理
柱分後的產品，由於使用了大量的溶劑，其中的雜質也會累積到產品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶劑洗滌一下，因為大部分的雜質是溶在溶劑里的，一洗基本就沒了，必要時進行重結晶。
另外，再過柱的時候，有時會出現氣泡，一是和使用的溶劑有關，如果是易揮發的溶劑，如乙醚、二氯甲烷等，在室溫稍高的情況下，很容易出現這種現象，因此，在室溫高的時候，可以選擇沸點較高，揮發相對小的溶劑。還有，使用混合溶劑時，使用的兩種溶劑的沸點應該相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚(60~90),而乙醚卻要選擇30－60的石油醚。二是：不論是用帶砂板的還是塞棉花的，在裝柱之前，都要將空氣用加壓的方法將空氣排干，這樣就可避免柱中有空氣！

B. 色譜法 有什麼意義

由於現代色譜分析技術具有分離和分析兩種功能，即能排除復雜組分間的相互干擾，逐個將組分進行定性和定量分析，因此，現代色譜分析技術非常適合成分復雜的生葯的有效性評價。

色譜法根據其分離原理可分為：吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法與排阻色譜法等。吸附色譜法是利用被分離物質在吸附劑上吸附能力的不同，用溶劑或氣體洗脫使組分分離；常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚醯胺等有吸附活性的物質。分配色譜是利用被分離物質在兩相中分配系數的不同使組分分離；其中一相被塗布或鍵合在固體載體上，稱為固定相，另一相為液體或氣體，稱為流動相；常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。離子交換色譜是利用被分離物質在離子交換樹脂上交換能力的不同使組分分離；常用的樹脂有不同強度的陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂，流動相為水或含有機溶劑的緩沖液。分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，是利用被分離物質分子大小的不同導致在填料上滲透程度不同使組分分離；常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等，根據固定相和供試品的性質選用水或有機溶劑作為流動相。

常用色譜法又可根據分離方法分為：薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。採用薄層色譜法分離有色物質時，可根據其色帶進行區分；分離無色物質時，可在短波 (254nm) 或長波 (365nm) 紫外光燈下檢視，也可噴以顯色劑使之顯色，或在薄層色譜中用加有熒光物質的薄層硅膠，採用熒光猝滅法檢視。氣相色譜法和高效液相色譜法可用接於色譜柱出口處的各種檢測器檢測。

近年來隨著各種色譜儀器自動化程度的提高，特別是各種聯用技術的發展，使得用現代色譜分析技術進行生葯有效性評價和質量控制變得越來越快速、簡便和靈敏。

（一）薄層色譜法 (thin layer chromatography, TLC)

薄層色譜法系將供試品溶液點於薄層板上，在展開容器內用展開劑展開，使供試品所含成分分離，所得色譜圖與適宜的對照物按同法所得的色譜圖對比，並可用薄層掃描儀進行掃描，用於鑒別、檢查或含量測定。《中國葯典》 (2005 年版 ) 一部薄層色譜法用於定性鑒別的達 1 523 項，用於含量測定的為 45 項，其中有 4 種葯材採用薄層掃描法定量。

1. 操作方法

(1) 薄層板 有市售薄層板（普通或高效板）和自製薄層板，可根據需要選用。

(2) 點樣 通常在潔凈乾燥的環境，用專用毛細管或配合相應的半自動或自動點樣器械將樣品點樣於薄層板上，一般為圓點狀或窄細的條帶狀，點樣基線距底邊 10 ～ 15mm ，高效板一般基線距底邊 8 ～ 10mm 。圓點狀直徑一般不大於 3mm ，高效板一般不大於 2mm ；接觸點樣時注意勿損傷薄層板表面。條帶狀寬度一般為 5 ～ l0mm 。高效板條帶寬度一般為 4 ～ 8mm ，可用專用半自動或自動點樣器械噴霧法點樣。點間距離可視斑點擴散情況以相鄰斑點互不幹擾為宜，一般不少於 8mm ，高效板供試品間隔不少於 5mm 。

(3) 展開 將點好供試品的薄層板放入展開缸中，浸入展開劑的深度為距原點 5mm 為宜，密閉。除另有規定外，一般上行展開 8 ～ 15cm ，高效薄層板上行展開 5 ～ 8cm 。溶劑前沿達到規定的展距，取出薄層板，晾乾，待檢測。

展開前如需要溶劑蒸氣預平衡，可在展開缸中加入適量的展開劑，密閉，一般保持 15 ～ 30 分鍾。溶劑蒸氣預平衡後，應迅速放入載有供試品的薄層板，立即密閉，展開。如需使展開缸達到溶劑蒸氣飽和的狀態，則須在展開缸的內側放置與展開缸內徑同樣大小的濾紙，密閉一定時間，使達到飽和再如法展開。必要時，可進行二次展開或雙向展開。

(4) 顯色與檢視 供試品含有可見光下有顏色的成分可直接在日光下檢視，也可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色或加熱顯色，在日光下檢視。有熒光的物質或遇某些試劑可激發熒光的物質可在 365nm 紫外光燈下觀察熒光色譜。對於可見光下無色，但在紫外光下有吸收的成分可用帶有熒光劑的硅膠板 ( 如硅膠 GF 254 板 ) ，在 254nm 紫外光燈下觀察熒光板面上的熒光猝滅物質形成的色譜。

(5) 記錄 薄層色譜圖像一般可採用攝像設備拍攝，以光學照片或電子圖像的形式保存。也可用薄層掃描儀掃描記錄相應的色譜圖。

2. 系統適用性試驗

用供試品和對照品對實驗條件進行試驗和調整，使檢測靈敏度、分離度和重復性符合要求。

(1) 檢測靈敏度 用於限量檢查時，採用供試品溶液和對照品溶液與稀釋若干倍的對照品溶液在規定的色譜條件下，於同一薄層板上點樣、展開、檢視，後者應顯清晰的斑點。

(2) 分離度 用於鑒別時，對照品溶液與供試品溶液中相應的主斑點，應顯示兩個清晰分離的斑點。用於限量檢查和含量測定時，要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度，分離度 (R) 的計算公式為：

R ＝ 2(d 2 -d 1 ) ／ (W 1 +W 2 ) 式 (3-5)

式中， d 2 為相鄰兩峰中後一峰與原點的距離； d 1 為相鄰兩峰中前一峰與原點的距離； W 1 及 W 2 為相鄰兩峰各自的峰寬。通常分離度應大於 1.0 。

(3) 重復性 同一供試品溶液在同一薄層板上平行點樣的待測成分的峰面積測量值的相對標准偏差應不大於 3.0 ％；需顯色後測定的相對標准偏差應不大於 5.0 ％。

3. 測定法

(1) 鑒別 取適宜濃度的對照品溶液與供試品溶液，在同一薄層板上點樣、展開與檢視，供試品溶液所顯主斑點的顏色 ( 或熒光 ) 和位置應與對照溶液的斑點一致。

(2) 限度檢查 採用與定量配製的對照品對照或對照品稀釋對照。供試品溶液色譜中待檢查的斑點與相應的對照品溶液或系列對照品溶液的相應斑點比較，顏色 ( 或熒光 ) 不得更深；或照薄層色譜掃描法操作，峰面積值不得大於對照品的峰面積值。

(3) 含量測定 照薄層色譜掃描法，測定供試品中相應成分的含量。

4. 薄層色譜掃描法

系指用一定波長的光照射在薄層板上，對薄層色譜中可吸收紫外光或可見光的斑點，或經激發後能發射出熒光的斑點進行掃描，將掃描得到的圖譜及積分數據用於鑒別、檢查或含量測定。測定時可根據不同薄層掃描儀的結構特點，按照規定方式掃描測定，一般選擇反射方式，採用吸收法或熒光法。通常含量測定應使用市售薄層板。

掃描方法可採用單波長掃描或雙波長掃描。如採用雙波長掃描，應選用待測斑點無吸收或最小吸收的波長為參比波長，供試品色譜中待測斑點的比移值 (R f 值 ) 和光譜掃描得到的吸收光譜圖或測得的光譜最大吸收與最小吸收應與對照品相符，以保證測定結果的准確性。薄層掃描定量測定應保證供試品斑點的量在線性范圍內，必要時可適當調整供試品溶液的點樣量，供試品與對照品同板點樣、展開、測定和計算。

（二）高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography, HPLC)

高效液相色譜法系採用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內，各成分在柱內被分離，並依次進入檢測器，由記錄儀、積分儀或數據處理系統記錄色譜信號。

高效液相色譜法具有分離效能高、分析速度快、重現性好、准確度和靈敏度高等優點，其應用范圍之廣，是其它分析儀器所不能比擬的。隨著儀器的普及和蒸發光散射檢測器、質譜檢測器的商品化，本法已成為生葯含量測定的首選和主流方法。《中國葯典》 (2005 年版）一部應用高效液相色譜法測定含量的中葯品種達 479 種，涉及 518 項，其中葯材就有 98 種 。

1. 對儀器的一般要求

(1) 色譜柱 最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠。反相色譜系統使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠 ( 如氰基硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等 ) 也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用於離子交換色譜；凝膠或高分子多孔微球等填充劑用於分子排阻色譜等；手性鍵合填充劑用於對映異構體的拆分分析。

填充劑的性能 ( 如載體的形狀、粒徑、孔徑、比表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等 ) 以及色譜柱的填充，直接影響待測物的保留行為和分離效果。孔徑在 15nm(1nm=l0?) 以下的填充劑適合於分析分子量小於 2000 的化合物，分子量大於 2 000 的化合物則應選擇孔徑在 30nm 以上的填充劑。

以硅膠為載體的一般鍵合固定相填充劑適用 pH2 ～ 8 的流動相。當 pH 大於 8 時，載體硅膠會被溶解；當 pH 小於 2 時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用 pH 大於 8 的流動相時，應選用耐鹼的填充劑，如採用高純硅膠為載體並具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、包覆聚合物填充劑、有機 - 無機雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當需使用 pH 小於 2 的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠、有機 - 無機雜化填充劑等。這些特殊的色譜柱已有商品供應。

(2) 檢測器 最常用的檢測器為紫外檢測器 ( ultraviolet detector, UVD) ，其他常見的檢測器有二極體陣列檢測器 ( diode array detector, DAD) 、熒光檢測器 ( fluorescence detector, FLD) 、示差折光檢測器 ( refractive index detector, RID) 、蒸發光散射檢測器 (evaporative light-scattering detector, ELSD) 、電化學檢測器 (electrochemical detector, ECD) 和質譜檢測器 (mass spectrometrical detector, MSD) 等。

紫外、二極體陣列、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與待測溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關。示差折光檢測器和蒸發光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發光散射檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與待測物的質量有關。二極體陣列檢測器可以同時記錄待測物在規定波長范圍內的吸收光譜，故可用於待測物的光譜測定和色譜峰的純度檢查。

紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與待測溶液的濃度在一定范圍內呈線性關系，但蒸發光散射檢測器響應值與待測溶液的濃度通常並不呈線性關系，必要時需對響應值進行數學轉換後進行計算。

不同的檢測器，對流動相的要求不同。如採用紫外檢測器，所用流動相應至少符合紫外 - 可見分光光度法對溶劑的要求；採用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，並選用色譜級有機溶劑。蒸發光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發鹽組分的流動相。

(3) 流動相 可採用固定比例 ( 等度洗脫 ) 或按規定程序改變比例 ( 梯度洗脫 ) 的溶劑組成作為流動相系統。由於 C- 18 鏈在水相環境中不易保持伸展狀態，故對於十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統，流動相中有機溶劑的比例通常應不低於 5 ％，否則 C 18 鏈的隨機捲曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統不穩定。

2. 系統適用性試驗

色譜系統的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、重復性和拖尾因子等四個指標。其中，分離度和重復性是系統適用性試驗中更具實用意義的參數。

通常用規定的對照品對色譜系統進行系統適用性試驗。

(1) 色譜柱的理論板數 (n) 在規定的色譜條件下，注入供試品溶液或內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內標物質峰的保留時間 t R ( 以分鍾或長度計，下同，但應取相同單位 ) 和半高峰寬 (W h/2 ) ，按 n=5.54(t R ／ W h/2 ) 2 計算色譜柱的理論板數。

(2) 分離度 (R) 無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內標峰或特定的雜質對照峰之間有較好的分離度。分離度的計算公式為：

3) 重復性 取對照品溶液，連續進樣 5 次，除另有規定外，其峰面積測量值的相對標准偏差應不大於 2.0 ％。也可配製相當於 80 ％、 100 ％和 120 ％的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成 3 種不同濃度的溶液，分別至少進樣 2 次，計算平均校正因子。其相對標准偏差應不大於 2.0 ％。

(4) 拖尾因子 (T) 為保證分離效果和測量精度，應檢查待測峰的拖尾因子是否符合相關規定。

3. 測定法

(1) 內標法加校正因子測定供試品中某個成分含量 精密稱 ( 量 ) 取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照品溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：

校正因子 (f)= 式 (3-8)

式中 As 為內標物質的峰面積或峰高； A R 為對照品的峰面積或峰高； C S 為內標物質溶液的濃度； C R 為對照品溶液的濃度。

再取含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：

含量 (C x ) =f × 式 (3-9)

式中 A x 為供試品峰面積或峰高； C x 為供試品溶液的的濃度； A′ s 為內標物質的峰面積或峰高； C′ s 為內標物質的濃度。 f 為校正因子。

當配製校正因子測定用的對照品溶液和含有內標物質的供試品溶液，使用等量同一濃度的內標物質溶液時， C s =C′ s ，則配製內標物質溶液不必精密稱 ( 量 ) 取。

(2) 外標法測定供試品中某個成分含量 精密稱 ( 量 ) 取對照品和供試品，配製成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖。

由於微量注射器不易精確控制進樣量，當採用外標法測定供試品中某成分含量時，以定量環或自動進樣器進樣為好。

(3) 面積歸一化法 是測量色譜圖上某色譜峰和除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算某色譜峰占總面積的百分率。該法通常用於對照品純度的檢查。

高效液相色譜法樣品進樣前的溶液應澄清，通常需經微孔濾膜 (0.45μm) 濾過。

（三）氣相色譜法 (gas chromatography, GC)

氣相色譜法系採用氣體為流動相 ( 載氣 ) 流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質或其衍生物氣化後，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先後進入檢測器，用記錄儀、積分儀或數據處理系統記錄色譜信號。

氣相色譜法對含揮發性成分的生葯應用較廣，精密度高，分離效果比薄層色譜好，但所得數據只有保留時間，多數情況下是在高溫下進行，若成分不氣化，就不能進行分析，故應用范圍受到限制。雖可通過衍生化法或應用特殊色譜柱分析不易揮發的成分，但遠不如高效液相色譜方便、准確。《中國葯典》 (2005 年版 ) 氣相色譜法用於中葯分析的品種有 47 種，其中有 4 種葯材用此法定量。另外還有兩種葯材的農葯殘留也是用 GC 法分析。

1. 對儀器的一般要求

氣相色譜儀由載氣源、進樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數據處理系統組成。進樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均在控制狀態。

(1) 載氣源 氣相色譜法的流動相為氣體，稱為載氣，氦、氮和氫可用作載氣，可由高壓鋼瓶或高純度氣體發生器提供，經過適當的減壓裝置，以一定的流速經過進樣器和色譜柱；根據供試品的性質和檢測器種類選擇載氣，常用載氣為氮氣。

(2) 進樣部分 進樣方式一般可採用溶液直接進樣或頂空進樣。

溶液直接進樣採用微量注射器、微量進樣閥或有分流裝置的氣化室進樣；採用溶液直接進樣時，進樣口溫度應高於柱溫 30 ～ 50℃ ；進樣量一般不超過數微升；柱徑越細，進樣量應越少，採用毛細管柱時，一般應分流以免過載。

頂空進樣適用於固體和液體供試品中揮發性組分的分離和測定。將固態或液態的供試品製成供試液後置於密閉小瓶中，在恆溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發性組分在非氣態和氣態達至平衡後，由進樣器自動吸取一定體積的頂空氣注入色譜柱中。

(3) 色譜柱 色譜柱為填充柱或毛細管柱。填充柱的材質為不銹鋼或玻璃，內徑為 2~4mm ，柱長為 2~4m ，內裝吸附劑、高分子多孔小球或塗漬固定液的載體，粒徑為 0.25~0.18mm 、 0.18~0.15mm 或 0.15~0.125mm 。常用載體為經酸洗並硅烷化處理的硅藻土或高分子多孔小球，常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛細管柱的材質為玻璃或石英，內壁或載體經塗漬或交聯固定液，內徑一般為 0.25mm 、 0.32mm 或 0.53mm ，柱長 5~60m ，固定液膜厚 0.1~5.0μm ，常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

新填充柱和毛細管柱在使用前需老化以除去殘留溶劑及低分子量的聚合物，色譜柱如長期未用，使用前應老化處理，使基線穩定。

(4) 柱溫箱 由於柱溫箱溫度的波動會影響色譜分析結果的重現性，因此柱溫箱控溫精度應在 ±l℃ ，且溫度波動小於每小時 0.1℃ 。溫度控制系統分為恆溫和程序升溫兩種。

(5) 檢測器 適合氣相色譜法的檢測器有火焰離子化檢測器 ( flame ionization detector , FID) 、熱導檢測器 ( thermal conctivity detector, TCD ) 、氮磷檢測器 (nitrogen-phosphorus detector, NPD) 、火焰光度檢測器 ( flame photometric detector , FPD) 、電子捕獲檢測器 ( electron capture detector , ECD) 、質譜檢測器 (mass spectrometric detector, MSD) 等。火焰離子化檢測器對碳氫化合物響應良好，適合檢測大多數的化合物；氮磷檢測器對含氮、磷元素的化合物靈敏度高；火焰光度檢測器對含磷、硫元素的化合物靈敏度高；電子捕獲檢測器適於含鹵素的化合物；質譜檢測器能給出供試品某個成分相應的結構信息，可用於結構確證。常用檢測器為火焰離子化檢測器，用氫氣作為燃氣，空氣作為助燃氣，在使用火焰離子化檢測器時，檢測器溫度一般應高於柱溫，並不得低於 150℃ ，以免水汽凝結，通常為 250 ～ 350℃ 。

(6) 數據處理系統 可分為記錄儀、積分儀以及色譜工作站等。

2. 系統適用性試驗

同高效液相色譜法。

3. 測定法

(1) 內標法加校正因子測定供試品中某成分含量。

(2) 外標法測定供試品中某成分含量。

(3) 面積歸一化法。

上述 (1)~(3) 法的具體內容均同於高效液相色譜的相應方法。

(4) 標准溶液加入法測定供試品中某成分含量 精密稱 ( 量 ) 取某待測成分對照品適量，配製成適當濃度的對照品溶液，取一定量，精密加入到供試品溶液中，根據外標法或內標法測定待測成分含量，再扣除加入的對照品溶液含量，即得供試液溶液中某待測成分含量。

氣相色譜法定量分析，當採用手工進樣時，由於留針時間和室溫等對進樣量的影響，使進樣量不易精確控制，故最好採用內標法定量；而採用自動進樣器時，由於進樣重復性的提高，在保證進樣誤差的前提下，也可採用外標法定量。當採用頂空進樣技術時，由於供試品和對照品處於不完全相同的基質中，故可採用標准溶液加入法以消除基質效應的影響；當標准溶液加入法與其他定量方法結果不一致時，應以標准加入法結果為准。

（四）其它色譜分析方法

1. 高效毛細管電泳 (high performance capillary electrophoresis, HPCE)

高效毛細管電泳是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力，在毛細管中按其淌度或分配系數的不同進行高效、快速分離的新型 「 液相色譜 」 技術，它是經典電泳技術和現代微柱分離相結合的產物。它使分析科學得以從微升水平進入納升水平，並使單細胞分析，乃至單分子分析成為了可能，成為生物化學和分析化學中最受矚目的、發展最快的一種分離分析技術，它在復雜樣品的分離分析中將扮演越來越重要的角色。

2. 毛細管電色譜 (capillary electrochromatography ， CEC ）

毛細管電色譜是綜合了毛細管電泳 (capillary electrophoresis ， CE) 和高效液相色譜 (HPLC) 的優勢而發展起來的新型高效電分離微柱液相色譜技術。 CEC 一般採用熔融的石英毛細管柱，在柱內填充或管壁鍵合固定相，用高壓直流電源 ( 或外加一定的壓力）代替高壓泵，產生電滲流 (electroosmotic flow ， EOF) 代替壓力驅動流動相，溶質依據它們在流動相與固定相中的分配系數的不同和自身電泳淌度的差異得到分離，因而既能分離中性物質又能分離帶電組分。

近年來高效毛細管電泳和毛細管電色譜在生葯化學成分的分析中有許多嘗試，取得顯著進展。