apoe基因血漿樣本檢測方法

『壹』 載脂蛋白E的電泳檢測

年齡相關性黃斑變性（age related macular degeneration， AMD)是西方國家首要的不可逆的致盲眼病，雖然目前病因尚不明確，但已發現許多與之相關的危險因素，最近研究結果關於ApoE基因與AMD發病的報道頗多，各持己見。實驗發現，ApoE在視網膜組織，特別是RPE和Bruch』s膜上有表達，此位置正是AMD的病變區域。Dithmar等發現膜結合物質在ApoE缺乏鼠的玻璃膜中明顯增多，測量玻璃膜厚度，顯著高於正常對照組，認為ApoE缺乏或血漿脂質水平增加或RPE水平效應是玻璃膜超微結構改變的直接原因。膜結合物質是基底線沉積物（basal line deposition，BLD）和大玻璃膜疣的主要成分。光鏡、電鏡檢查發現ApoE缺乏鼠的視網膜內、外核層細胞數量明顯降低，外核層細胞核染色質濃縮，核周空泡形成，玻璃膜增厚，彈力層不連續甚至結構不清，從而發生AMD的眼底損害。Kliffen等證實攜帶ApoE3鼠的高脂飲食組，其BLD有不同程度增加；正常飲食組，BLD也有少量沉積；ApoE基因敲除組則未發現BLD存在，證實ApoE功能障礙參與AMD細胞外沉積物形成，對AMD發病起一定作用。
臨床上多數研究傾向於ε 4等位基因對AMD有保護作用，而ε 2則可加速疾病發展。Baird等在研究中調整了年齡和性別後，晚期AMD的ε 3/4基因型與ε 3/3基因型患者相比，前者患病率降低近一半；將晚期AMD分成萎縮型和新生血管型，則ε 3/4基因型對萎縮型AMD保護作用最強；晚期AMD的男性ε 3/4基因型者患病危險性降低近3倍。而在疾病診斷年齡上，晚期AMD的ε 2/3基因型較ε 3/3基因型者明顯提前（3.4a），以女性和新生血管型AMD最明顯（分別是3.9a和4.7a）。當將有家族史的萎縮型患者再分類，發現這些患者ApoE ε 4等位基因全部缺失，認為ε 4等位基因在萎縮型AMD的保護作用優於新生血管型，提出ApoE等位基因是AMD發病的一個因素，ε 4等位基因起保護作用，至少可延遲AMD診斷時間，ε 2等位基因在加速疾病進程上起修飾基因的作用。
Zareparsi，Schmidt等也有相關報道。Thakkinstian等對1966/2005年MEDLINE的所有有關基因的報道綜合分析表明，ε 2、ε 4等位基因在高加索人群的出現頻率為8%和15%。基礎等位基因和基礎表型相關檢測表明ε 2危險作用達20%，ε 4的保護作用達到40%。雖然要排除生存偏倚的可能性，但ε 2和ε 4等位基因在AMD中確實表現出不同的作用。還有研究認為有吸煙史的ε 2等位基因攜帶者患濕性AMD的危險性高於ApoE4和 ApoE3/3型攜帶者。而Asensio?Sánchez等的研究卻得出相反結論，他對西班牙95例AMD患者檢測後發現ε 4等位基因使AMD患病風險增加5倍多，且在70～75歲患者中表現明顯。 Pang等對研究了98例中國AMD患者後發現在滲出型AMD患者中ApoE4基因產物雖有所下降，但下降趨勢不明顯，分析中國人ApoE4等位基因分布頻率較歐洲人低，因故還不能認為ApoE4與AMD有直接關系。Gotoh等分析了日本82例健康人、58例息肉狀脈絡膜血管病變（polypoidal choroidal vasculopathy， PCV）及85例AMD患者的ApoE基因型及等位基因頻率，發現PCV患者和AMD患者存在ApoE2和ApoE4多態性的較少，其基因型和等位基因頻率與正常人比較亦無顯著差異。因此考慮可能存在種族、地域、篩查的人群等因素，使ApoE基因與AMD的關系尚存爭議，仍待臨床長期大量研究。 有研究發現1型單純皰疹病毒（herpes simplex virus 1，HSV 1）潛伏在ApoEε4攜帶者的顱神經內更易損傷神經系統，促使阿爾茨海默病(alzheimer s disease，AD)發生，被視為AD發病的一個危險因素，那麼由HSV引起的HSK是否與ApoE有關呢？Lin等對46個HSK患者和238個正常對照組進行ApoE基因檢測，結果HSK患者ε 4基因頻率佔15%，與對照組頻率相等，而ε 2基因頻率佔13%，雖然高於正常對照組（7%），但無統計學意義（P=0.06）。分析認為ApoE2和其它亞型相比與角膜細胞結合能力較弱，因此病毒易於侵入角膜，使ApoE2攜帶者角膜損傷更重。或者，角膜細胞膜受體與ApoE和HSV1的結合方式與神經元細胞受體有所不同。
此後臨床上未見關於HSV與ApoE基因關系的報道。最近Bhattacharjee等展開了一系列關於ApoE與HSV1的實驗研究，並首次報道ApoE4是HSK發病的一個危險因素。起初，Bhattacharjee等採用角膜劃痕法對ApoE基因敲除(ApoE/)雌鼠和年齡等大的C57BL/6(ApoE+/+)雌鼠接種HSV1菌株17Syn+，接種5d後發現兩組鼠角膜均感染了HSV1病毒，實時PCR數據顯示，ApoE（/）鼠的HSV1 DNA數量明顯低於ApoE（+/+）對照組，且對照組14隻鼠中有7隻因感染17Syn+而死亡，ApoE（/）鼠則無一死亡，說明攜帶ApoE基因的鼠更易感染HSV 1病毒，而ApoE（/）鼠對病毒抵抗力更強，病毒的潛伏時間更短。推測ApoE基因可影響HSV1病毒的活性。隨後另一項實驗又以10g/L ApoE二聚體肽（ApoEdp）對C57BL/6雌鼠角膜成功接種HSV1菌株KOS GFP 24h後進行治療，發現與安慰劑組相比，ApoEdp可顯著降低HSK的發病率，抑制病情發展，認為ApoEdp通過大幅下調鼠促炎細胞因子表達，達到抗HSV1和抗炎效果。並在轉基因鼠模型實驗中發現，ApoE4可上調角膜中VEGF表達，增強蛋白酶解作用，使ApoE4鼠眼部病毒迅速復制，角膜較早就發生混濁，且新生血管化程度高，在三叉神經節和腦中的HSV1 DNA含量亦較ApoE3鼠多。此系列實驗使人們對ApoE基因在 HSK的作用機制的方面有了新的認識。 白點狀視網膜變性臨床較少見，也是一種遺傳性視網膜色素變性。有研究對一患有白點狀視網膜變性的家族進行基因檢測，發現此家族中所有患者均發生視紫紅質基因Arg135Trp突變，且均攜有ApoE4等位基因，外周/RDS或ROM1基因未發現變異，提示本病發生不只與外周/RDS基因突變有關，ApoE基因也可能起著作用。
ApoE基因與眼病的關系遠不止上述，相信在不遠的將來會有更多關於ApoE基因與眼病的研究成果呈現在眼科學者面前，為眼病的發病機制及治療提供依據。

『貳』 艾滋病檢測方法，艾滋病檢測方法都有哪些

常用，通過免疫的方法檢測，即通過一個機器來自動檢測這種抗體；通過尿液、唾液、口腔粘膜等分泌液檢測（一）抗體檢測主要有酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和免疫熒光試驗（IFA）。ELISA用去污劑裂解HⅣ或感染細胞液提取物作抗原，IFA用感染細胞塗片作抗原進行抗體檢測，如果發現陽性標本應重復一次。為防止假陽性，可做Westernblot（WB，蛋白印跡法）進一步確證。
WB法是用聚丙烯醯胺凝膠電泳將HⅣ蛋白進行分離，再經傳移電泳將不同蛋白條

帶轉移於硝酸纖維膜上，加入病人血清孵育後，用抗人球蛋白酶標抗體染色，就能測出針對不同結構蛋白抗體，如抗gp120、gp41、P24抗體，特異性較高。
快速檢測法，也稱為金標法，也是抗體檢測的一種方法，根據免疫層析法的原理，用於HⅣ抗體檢測的定性檢測。
（二）抗原檢測
用ELISA檢測P24抗原，在HⅣ感染早期尚未出現抗體時，血中就有該抗原存在.由於P24量太少，陽性率通常較低。現有用解離免疫復合物法或濃縮P24抗原，來提高敏感性。
（三）核酸檢測
用PCR法檢測HⅣ基因，具有快速、高效、敏感和特異等優點，目前該法已被應用於HⅣ感染早期診斷及艾滋病的研究中。
（四）病毒分離
常用方法為共培養法，即用正常人外周血液分離單個核細胞，加PHA刺激並培養後，加入病人單個核細胞診斷及艾滋病的研究中。
（五）檢測試紙檢測
艾滋病檢測試紙條是使用膠體金免疫層析科技研發的新一代檢測試劑。它可檢測血清或血漿標本中的HⅣ-1/2特有性抗體。所有操作時間若是15分鍾，動作簡便、迅速、准確、自帶質

控對照、無需所有附加葯劑。適合個人檢測，也適合各大醫院，疾控中心檢測。

『叄』 HIV核酸檢測的HIV核酸檢測方法及程序

1.1 方法和試劑
1.1.1 方法
（1）檢測方法為商品化試劑盒和實驗室自建方法，商品化試劑應嚴格按說明書操作。下面介紹的方法是實驗室自建方法，供參考。
（2）檢測血漿或血清樣品使用逆轉錄PCR（RT-PCR）方法，建議第一輪PCR擴增使用RT-PCR一步法；檢測血細胞或組織樣品使用PCR方法。一般使用擴增兩輪的套式PCR方法。
（3）設立陽性、陰性及空白對照。陽性對照為與待測樣品同質、含有目的基因的樣品；陰性對照為與待測樣品同質、不含有目的基因的樣品。陽性和陰性對照樣品應與待檢樣品處理程序一致。陰性對照的設置數量應根據實驗樣品的數量設置在不同的位置。
1.1.2 試劑
（1）PCR引物：一般使用擴增HIVgag和/或pol和/或env和/或LTR等引物。進行RNA逆轉錄時可使用下游特異性引物或隨機引物。引物設計可參考文獻或自行設計，應盡量涵蓋常見的HIV流行毒株，也可使用兼並性引物。
（2）主要試劑：包括核酸提取純化、逆轉錄、PCR所需的試劑。使用商品化核酸提取純化試劑、逆轉錄酶反應試劑和PCR擴增試劑。
（3）抗污染試劑：實驗室自建檢測方法可使用抗污染試劑，參考尿嘧啶DNA糖基化酶抗污染方法。
1.2 擴增目的基因片段
1.2.1 樣品的採集和處理
1.2.2 核酸提取
可使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動化儀器等商品化試劑或設備並按說明書操作。提取RNA時應注意防止RNA降解。DNA應置於-20℃保存，RNA和需長期保存的DNA應置於-80℃保存。
1.2.3 逆轉錄合成cDNA
使用商品化試劑並按說明書操作。逆轉錄cDNA合成反應需使用逆轉錄引物、dNTPs、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規定的溫度和時間下進行逆轉錄反應。建議使用商品化RT-PCR一步法試劑進行第一輪擴增反應。
1.2.4 PCR擴增反應
使用商品化試劑按說明書操作。PCR反應需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、緩沖液、和適量無RNA/DNA酶超純水、以及模板（DNA或cDNA）。在擴增儀中，按照設定的程序進行擴增。一般使用二次擴增的套式PCR擴增方法。
1.3 擴增產物分析及結果報告
1.3.1 擴增產物分析
擴增產物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標准比較，判斷擴增片段是否在預期的分子量范圍內。其它擴增產物分析方法還有限制性內切酶酶切分析、特異性探針雜交分析以及DNA序列分析等。自動化核酸擴增儀使用酶聯比色分析或熒光探針雜交等原理測定。
1.3.2 結果判定和報告
（1）實驗成立的條件：每一次檢測需同時做兩個陽性對照、兩個陰性對照，只有陽性對照擴增出預期的片段、陰性對照沒有擴增出任何片段、雙份平行樣品結果一致的情況下實驗才成立，可以作出核酸陽性或陰性反應結果的判定。
（2）HIV核酸檢測陽性：使用商品化檢測試劑，發現核酸陽性反應，應該重復採集樣品進行復測，復測結果呈核酸陽性反應則判定為核酸陽性，復測結果為核酸陰性反應則判為不確定結果，需進一步隨訪檢測。
（3）HIV核酸檢測陰性：只可報告本次實驗結果陰性。
（4）應在完成檢測後7個工作日內發出檢測報告。 2.1 方法
HIV核酸定量檢測主要基於靶核酸擴增RT-PCR和信號放大擴增兩種方法。國內常用的方法中，NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1採用國際單位（IU/ml），與NASBA的拷貝數關系基本為1:1；Amplicor Cobas 的拷貝數約為1.2～1.5國際單位；bDNA方法的拷貝數約為0.8～1.0國際單位。不同方法的關系與HIV的亞型有關。
2.2 試劑
必須使用經中國葯品生物製品監督管理局注冊批準的商品化試劑並嚴格按說明書操作。
2.2.1 靶核酸擴增試劑和性能
（1）RT-PCR擴增試劑
1）Amplicor HIV-1 Monitor v1.5（RT-PCR微孔板捕獲比色分析法），核酸手工提取（異丙醇沉澱），比色分析測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，可擴增HIV-1M組的A-H基因亞型。標准法的檢測線性范圍是400～750，000；超敏法的線性范圍是50～100，000 RNA拷貝/毫升。
2）COBAS Amplicor HIV-1 Monitor v1.5, 核酸手工提取（異丙醇沉澱），儀器測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，可擴增HIV-1M組的A-H基因亞型。標准法的檢測線性范圍是400～750，000；超敏法的線性范圍是50～100，000 RNA拷貝/毫升。
3）COBAS AmpliPrep/COBAS Amplicor HIV-1 Monitor v1.5 （COBAS Amplicor 分析儀）,儀器提取核酸，儀器測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，可擴增HIV-1M組的A-H基因亞型。標准方法的檢測線性范圍是400～1，000，000；超敏方法的線性范圍是50～100，000 RNA拷貝/毫升。
以上三種試劑均採用基於PCR擴增靶核酸檢測法，僅在設備的使用、自動化程度和樣品制備的方法有所不同。
4）COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test（實時熒光探針RT-PCR分析法）, 儀器提取核酸,實時熒光探針PCR擴增儀器測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，可擴增HIV-1M組的A-H基因亞型。檢測線性范圍是40～10，000，000 RNA拷貝/毫升，比上述三種方法的檢測線性范圍要寬，樣品可不經稀釋一次完成檢測。
以上四種試劑均使用一個內部定量標准品，1個陰性、1個弱陽性和1個強陽性外部外部質控品。均使用dUTP/UNG防污染試劑。
5）LCx HIV RNA Quantitative Assay（競爭性RT-PCR微顆粒酶免疫分析法）,手工或儀器提取核酸（活化硅膠柱純化），儀器測定。擴增靶核酸位置是pol（整合酶）基因區，可擴增HIV-1基因M組的A-G亞型和0組病毒，尤其可檢測M組C基因亞型和一些重組病毒。檢測線性范圍是50～1，000，000 RNA 拷貝/毫升；使用一個內部定量標准品和六個外部定量標准品。
6）RealTime HIV-1 Assay（實時熒光探針RT-PCR分析法）,使用獨特的雙鏈熒光探針。手工或儀器提取核酸（磁性顆粒純化），儀器測定。擴增靶核酸位置是pol（整合酶）基因區，擴增HIV-1基因亞型是M組的A-G亞型和0組以及N組病毒。檢測線性范圍是40～1，000，000 RNA 拷貝/毫升。使用一個內部定量標准品。檢測結果與LCx HIV RNA Quantitative Assay結果高度相關。
（2）基於核酸序列擴增試劑（NASBA擴增技術）：以等溫方式直接擴增HIV-1 RNA。
NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1（實時熒光探針分析法）, 使用熒游標記的分子信標探針技術檢測擴增子。手工或儀器提取核酸（硅膠純化，異丙醇沉澱）,儀器測定。擴增靶核酸位置是gag基因區，擴增HIV-1基因亞型是M組的A-G亞型。檢測線性范圍是50～3，000，000 RNA 國際單位/毫升；使用一個內部定量標准品，沒有陰陽性外部外部質控品。每次檢測8的整數倍樣品，直至48個。檢測結果與Versant HIV-1 RNA、和Amplicor HIV-1 Monitor v1.5 方法的結果有著高度的相關性。國際上已經推薦使用V2.0試劑盒。
2.2.2 信號放大擴增試劑和性能
Versant HIV-1 RNA 3.0.bDNA（分枝狀DNA探針雜交微孔板捕獲比色分析法）, 利用分枝狀DNA多級信號放大原理。無需RNA純化和PCR擴增步驟。離心濃縮病毒子並用去垢劑和蛋白酶K消化病毒釋放病毒RNA，儀器測定。擴增靶核酸位置是pol基因區，擴增HIV-1基因亞型是M組的A-H亞型，檢測線性范圍是50～500，000 RNA 拷貝/毫升；使用六個外部定量標准品，1個陰性、1個弱陽性和1個強陽性外部外部質控品。每次可檢測12的整數倍樣品。
以上試劑均可使用EDTA和ACD作為樣品的抗凝劑，NucliSens HIV-1 QT和NucliSens Esay Q HIV-1 v1.1以及Versant HIV-1 RNA 3.0.bDNA試劑還可以使用肝素作為抗凝劑。如果必須使用經肝素處理的血漿樣品進行RT-PCR擴增，則必須在樣品中直接加肝素酶消化肝素。
2.2.3 實時熒光定量PCR技術
實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標准曲線對未知模板進行定量分析的方法。每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系。利用已知起始拷貝數的標准品可作出標准曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標准曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
實時熒光定量PCR擴增的實驗檢測過程可分為：（1）樣品制備,抽提和濃縮目標RNA分子，並除去可能存在的抑制因子。（2）Real-time PCR，檢測PCR的產物使用熒游標記的寡核苷酸探針。檢測的原理基於熒光信號增長曲線與循環數相關。（3）RT-PCR反應，病毒RNA利用逆轉錄酶將RNA逆轉錄為cDNA，然後通過DNA聚合酶對特定片段進行擴增。（4）擴增產物的檢測，基於檢測閾值的設定，當病毒載量高時，低循環數即能檢測到熒光信號，當病毒載量低時，高循環數時才能檢測到熒光。循環數與樣品載量成線性關系。利用標准品製作循環數與載量的標准曲線就能對樣品載量進行定量檢測。 使用集合核酸擴增檢測技術和方法，利用核酸檢測方法的高度敏感性，對高度懷疑感染人群且抗體陰性的樣品進行集合核酸檢測，可及時發現窗口期感染者。該方法較單份樣品的核酸檢測具有更高的成本效益。
3.1 樣品集合程序
3.1.1 根據預處理樣品量，計算預形成一級和二級集合數量，在登記表格上記錄一級和二級集合及對應的原始樣品編號。
3.1.2 吸取130mL樣品，移入標記二級集合的離心管中；10份樣品形成一個1300mL的二級集合樣品，充分渦旋震盪混勻。
3.1.3 從5個二級集合管中分別吸取210mL樣品，移入標記有一級集合的離心管中，形成由50份樣品1050mL體積組成的一級集合樣品，充分渦旋震盪混勻。
3.1.4 從每個一、二級集合管中吸取500mL集合樣品，分裝至另一相應標記的離心管，用超敏感核酸檢測試劑進行檢測。
3.1.5 制備陰性集合外部質控品：使用50份HIV抗體和核酸陰性樣品，按上述步驟，分別集合成5個陰性二級集合外部質控品和1個一級集合外部質控品。
3.1.6 制備陽性集合外部質控品：從9份HIV抗體和核酸陰性樣品和一份至少含有HIV RNA10c/ml陽性樣品中，分別移取130mL加入離心管中，形成一個1300mL的陽性二級集合外部質控品。再分別從4個已制備好的陰性二級集合外部質控品和上述陽性二級集合外部質控品中，移取210mL至標記為一級陽性集合外部質控品的離心管中，形成一級陽性集合外部質控品。
3.1.7 一級和二級陰、陽性集合外部質控品分別用於RT-PCR中每一輪一級和二級集合樣品的檢測。
3.2 集合樣品的檢測和分解路線
使用商品化核酸檢測試劑，應嚴格按照試劑說明書操作。按照各商品化核酸試劑集合PCR的方案進行檢測，集合樣品的數量根據各試劑方案操作。方法簡述如下：
3.2.1 用HIV RNA RT-PCR超敏檢測方法對一級集合樣品進行檢測，陽性反應的一級集合樣品進入下一檢測步驟。
3.2.2 用HIV RNA RT-PCR超敏檢測方法對所有組成陽性一級集合的二級集合樣品進行檢測，陽性反應的二級集合樣品進入下一檢測步驟。
3.2.3 用HIV RNA RT-PCR標准檢測方法檢測所有組成陽性二級集合樣品的的10份單個樣品，確定核酸陽性的單個樣品。 HIV感染產婦所生嬰幼兒在出生後18個月內可應用HIV核酸（DNA或RNA）檢測進行早期HIV感染診斷。盡管HIV RNA檢測敏感性在感染早期較高（出生後1個月內），但是HIV DNA檢測不受母親圍產期抗逆轉錄病毒治療和人乳汁中抗逆轉錄病毒葯物以及嬰幼兒預防性抗逆轉錄病毒治療的干擾而影響早期診斷。另外，考慮母親血液污染因素，不推薦使用臍帶血進行HIV核酸檢測。嬰幼兒的抗體檢測流程和結果判斷見第二章（HIV抗體檢測）。
4.1 適用范圍
未滿18個月的HIV感染產婦所生嬰幼兒；未滿18個月的嬰幼兒，其母親HIV感染狀態不詳，兒童出現HIV相關臨床表現，臨床懷疑HIV感染者。
4.2 檢測程序及結果報告
4.2.1 於嬰兒出生後6周（42天）採集第一份血樣本（血樣本可制備成DBS或EDTA抗凝全血），送檢。
4.2.2 若第一份血樣本檢測呈陽性反應，盡快再次採集第二份血樣本進行檢測。若兩份血樣本檢測均呈陽性反應，報告「嬰兒HIV感染早期診斷檢測結果陽性」，診斷兒童HIV感染。及時對HIV感染兒童進行追蹤和病情監測，將其轉介到兒童抗病毒治療醫療服務機構，並為其提供機會性感染預防等服務措施；若第二份血樣本檢測呈陰性反應，待嬰兒滿3個月再次採集血樣本進行檢測。若第一份血樣本檢測呈陰性反應，繼續提供兒童保健和隨訪服務，待嬰兒滿3個月再次採集血樣本進行檢測。
4.2.3 若嬰兒滿3個月再次檢測呈陰性反應，報告「嬰兒HIV感染早期診斷檢測結果陰性」，按照未感染兒童處理，繼續提供兒童保健隨訪服務；於兒童滿12個月時，按照「HIV感染產婦所生兒童HIV抗體檢測流程」（圖4），開始HIV抗體檢測，最終確定兒童感染狀態。若嬰兒滿3個月再次檢測呈陽性反應，盡快再次採集血樣本進行檢測。第三份血樣本檢測呈陽性反應，報告「嬰兒HIV感染早期診斷檢測結果陽性」；若第三份血樣本檢測呈陰性反應，報告「嬰兒HIV感染早期診斷檢測結果陰性」；分別按照前述流程提供相應服務。
4.2.4 不同時間「嬰兒HIV感染早期診斷」檢測均呈陰性反應的喂哺母乳的兒童，應在完全停止喂哺母乳後的6周和3個月（若6周時檢測結果為陽性可盡快）再次采血進行核酸定性檢測，進行早期診斷。兒童滿18個月後則可直接進行抗體檢測。
4.2.5 如果嬰兒第一次采血時已滿3個月，但未滿12個月，則應盡快在不同時間採集兩份血樣本；同時將兩份血樣本送檢，按照前述流程進行檢測。如果兒童第一次采血時已滿12個月，則應首先按照「艾滋病感染產婦所生兒童HIV抗體檢測流程」（ 圖4）進行HIV抗體檢測。若兩種不同原理或廠家生產的HIV抗體檢測試劑檢測結果均為陰性，則排除兒童感染；若HIV抗體檢測試劑檢測結果呈陽性反應，不能通過抗體檢測確定兒童感染狀態，則可在不同時間採集兩份血樣本，按照前述流程進行「嬰兒HIV感染早期診斷」檢測。如果兒童第一次采血時已滿18個月，則應按照HIV抗體檢測流程（圖1）進行HIV抗體檢測，無需進行「嬰兒HIV感染早期診斷」檢測。