高效液相色譜法中的檢測方法

Ⅰ 苯並(a)芘的高效液相色譜法測定

方法提要

利用正己烷-液-液萃取、固相萃取C₁₈柱-二氯甲烷淋洗等提取水樣中苯並［a］芘，提取液經硅膠柱凈化、濃縮、定容後，高效液相色譜-紫外-熒光檢測器串聯分離檢測，外標法定量。

方法適用於地下水、地表水、飲用水及污水等水樣中苯並［a］芘的分析，其中固相萃取適用於潔凈水分析。方法檢出限隨儀器靈敏度和樣品基質而定。當取樣量為1.0L潔凈水時，本方法檢出限為0.50ng/L。

儀器與裝置

高效液相色譜儀帶紫外檢測器和熒光檢測器。

固相萃取裝置。

旋轉蒸發儀。

恆溫水浴氮吹儀。

振盪器。

帶聚四氟乙烯活塞的1L分液漏斗。

固相萃取C₁₈柱1000mg，6mL。

硅膠凈化柱1000mg，6mL。

分析柱WastersPAHsC₁₈液相色譜專用柱，250mm×4.6mm，粒徑5μm;或性質相似的液相色譜柱，250mm×4.6mm，粒徑5μm。

離心機。

試劑與材料

無水硫酸鈉、氯化鈉優級純，在600℃高溫爐中灼燒4h放置在乾燥器中備用。

正己烷、二氯甲烷、丙酮等均為農殘級。

甲醇HPLC級。

替代物標准p-三聯苯稱取固體三聯苯替代物標准，以甲醇溶液溶解、定容，並用甲醇逐級稀釋為10.0μg/mL儲備液。替代物標准1-氟萘100.0μg/mL，有證標准物質。替代物標准均在-18℃下保存備用。

標准儲備溶液苯並［a］芘，-18℃下避光保存，購自國家標准物質中心。

1L棕色樣品瓶。

針頭過濾器及注射器針頭過濾器型號孔徑0.45μm，直徑4mm，聚四氟乙烯濾膜。

樣品採集與保存

采樣前不能用水樣預洗采樣瓶，採集時樣品要充滿整個樣品瓶，不留氣泡。樣品采滿後迅速放置在低溫冷藏箱中並盡快送實驗室檢測，到達實驗室後樣品應盡快轉移至4℃冷藏設備中保存。7d天內完成樣品提取、40d內完成檢測。苯並(a)芘對光敏感。在樣品採集、運輸、儲存以及分析全過程應盡可能避光操作，防止光解。

分析步驟

1)試樣提取。

a.液-液萃取。將1.0L水樣倒入預先加有30gNaCl的1L分液漏斗中，待NaCl溶解後加入50mL正己烷、5μL10.0μg/mL的p-三聯苯替代物標准溶液;並用20mL丙酮淋洗樣品瓶，淋洗液轉入分液漏斗，振盪5min。靜置10～20min，將水相轉移至原樣品瓶，正己烷相轉入150mL平底燒瓶中。原樣品再進行第二次萃取，萃取方法同第一次，正己烷量減少為30mL。合並正己烷相，並加入3g無水硫酸鈉，稍稍搖動，觀察有無結塊現象，如有結塊，需補加無水硫酸鈉至沙狀，繼續放置20min，之後過濾至另一150mL平底燒瓶中，濾液旋轉蒸發濃縮至約3mL。如果是潔凈地下水，樣品可以不凈化，直接轉移至KD濃縮瓶中，氮氣吹掃至0.3mL，加入甲醇0.5mL，氮氣吹掃至0.3mL，再加甲醇0.50mL，氮氣吹掃至0.3mL，最後甲醇定容1.0mL，0.45μm濾膜過濾，HPLC測定。如污染較重，則需凈化。凈化方法見2)樣品凈化。

b.固相萃取(適用於潔凈水樣)。將固相萃取C₁₈柱(1000mg，6mL)，安放在固相萃取裝置上，用10mL二氯甲烷淋洗C₁₈柱，再用10mL甲醇分兩次淋洗C₁₈柱(第二次甲醇浸泡5min)，最後用10mL空白水分兩次淋洗，等待上樣。在活化過程中不要讓柱子流干。在要富集的1.0L水樣中加入5g氯化鈉、40ng替代物標准p-三聯苯、30mL甲醇等混勻後樣品以5mL/min的流速流過已活化的C₁₈柱。樣品流完後真空乾燥3min後取下C₁₈柱，以3000r/min離心10min除水。除水後的C₁₈柱安裝回固相萃取裝置，用5mL二氯甲烷浸泡C₁₈柱5min後自然流下，收集洗脫液。用4mL二氯甲烷洗滌樣品瓶並與樣品洗脫液合並。洗脫液中加入1g無水Na₂SO₄，振搖後放置15min，用滴管將洗脫液轉移至25mLKD濃縮瓶中，用2mL二氯甲烷洗滌Na₂SO₄相後並入KD濃縮瓶，加入0.5mL甲醇，氮氣吹掃至0.5mL，再入甲醇1.0mL，氮氣吹掃到0.5mL，最後甲醇定容至1.0mL，過濾HPLC測定。

2)試樣凈化。凈化硅膠柱預先用10mL10%丙酮-正己烷溶液、10mL正己烷活化後，待正己烷接近硅膠頂層時迅速將待凈化樣品提取液轉入柱中，先用5mL正己烷淋洗，棄之，再用25mL正己烷-二氯甲烷(1+1)混合溶液淋洗，淋洗液用KD濃縮瓶承接，氮氣濃縮，甲醇換相、最後定容至1.0mL，過濾HPLC測定。

3)校準曲線。用甲醇分別稀釋1.93μg/mL苯並［a］芘二級標准溶液，配製成0ng/mL、1.93ng/mL、9.65ng/mL、19.3ng/mL、28.9ng/mL、38.6ng/mL標准系列，每個標准系列點加入4μL的10.0μg/mL三聯苯替代物標准溶液。通過濃度與對應峰面積建立標准曲線。

4)高效液相色譜分析條件。流動相為甲醇溶液，流速1.2mL/min(恆流方式)，柱溫40℃。紫外檢測器(UV):波長254nm。熒光檢測器(FLD):0～6min，激發波長(Ex)250nm，發射波長(Em)370nm;6～15min，激發波長294nm，發射波長430nm.。

5)定性及定量分析。

a.定性分析。採用試樣中待測目標物保留時間與標准目標物保留時間相比較的方式進行定性分析。檢測方法採用熒光和紫外串聯檢測的方式。特別當有干擾存在時，應仔細分析熒光和紫外色譜圖排除干擾。如果試樣中待測目標物含量達到方法檢出限5倍以上，需GC-MS確證。

b.定量分析。採用熒光和紫外串聯檢測的方式進行定量分析。以熒光檢測定量為主，對有干擾存在應結合紫外檢測情況綜合確定。外標法定量。再根據試樣測定濃度、稱樣量計算出試樣中濃度。目標化合物峰面積和定量校準曲線可以由高效液相色譜儀工作站自動完成，定量校準曲線也可由EXCEL工作軟體完成。對自動積分的峰面積應逐一檢查各峰基線，對不合理基線進行必要修正。

對含量接近檢出限水平的試樣，可以採用與其濃度相近的標准單點校正。對於含量超過校準曲線上限的試樣應稀釋或減小取樣量，使其峰面積保持在校準曲線的線性范圍內，重新測定。

6)方法性能指標。分別配製質量濃度為19.3ng/L的苯並［a］芘、40ng/L三聯苯的空白加標試液1L，按試樣分析步驟進行分析，獲得方法精密度和加標回收率分別為2.07%和81.1%～93.0%(n=6)。

上述苯並［a］芘校準曲線的線性方程是y=55947x-5570.5，相關系數R²=0.9999。

將質量為3.86ng的苯並［a］芘標准分別加入到1.0L空白水樣中，餘下同試樣分析，以3倍信噪比對應濃度作為方法檢出限，其方法檢出限為1.00ng/L。

色譜圖的考察(圖82.9):

圖82.9苯並［a］芘標准高效液相色譜圖(熒光檢測)

質量控制

每批試樣或至多20個試樣必須至少進行一個全流程試劑空白、一個平行雙樣和基體加標分析，以監測分析流程中玻璃器皿、試劑、溶劑和其他硬體帶來的干擾和與之相關的試樣分析精度，加標濃度不得低於原始試樣的背景濃度。

當分析超過 8h 或每分析 10 個試樣後，應用標准曲線中等濃度的確證標准檢查儀器的工作狀態，確證標准與最初標准相比偏離大於 20%，需重新測定標准系列; 若偏離仍大於 20%，需重新配製標准曲線和分析試樣。

替代物標准三聯苯 (或 1-氟萘) 回收率: 應為 65%～130%; 若不在限值之內，需要重新檢查並確認計算、替代標物准、儀器是否問題。

注意事項

苯並 (a) 芘是強致癌物，提取液濃縮及凈化過程應在通風櫃中進行，必要時戴防毒面具、手套以減少對人體的危害。

Ⅱ 高效液相色譜儀可以測定重金屬含量嗎 怎麼測

一般情況下高效液相色譜主要測定有機物和一些無機離子，測定重金屬一般可測定有機金屬，比如甲基汞，但方法都是些文獻方法，沒有廣泛使用。
多數情況下，測定重金屬含量都不用液相色譜檢測，而用原子熒光法（AFS）、電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS),原子吸收光譜法(AAS)，分光光度法（UV），電化學法（陽極溶出伏安法），X射線熒光光譜法（XRF）等 。下面是成本最低的目視比色法：
1 原理：重金屬離子與負二價硫離子在乙酸介質中生成有色硫化物沉澱。重金屬含量較低時，形成穩定的暗色懸浮液，可用於重金屬的目視比色法測定。
2 適用范圍：本方法適用於所有無機物中重金屬的測定。檢測范圍為1～20ppm。
3 試劑與溶液：
3.1 鉛標准貯備液的配製：稱取硝酸鉛159.8mg於100ml水中，加1ml濃硝酸溶解，稀釋至1000ml。此溶液應貯存在無鉛玻璃容器中。
3.2 鉛標准液的配製：使用當天現配製，取10ml鉛標准貯備液，稀釋至100ml。該溶液中每毫升中含10µg鉛。
3.3 PH=3.5醋酸鹽緩沖溶液：溶解25.0g NH4AC於25ml水中，加38.0ml（6N）HCl，用6N NH4OH或6N HCl調至PH=3.5，以PH計為指示。然後將溶液稀釋至100ml。
3.4 硫代乙醯胺溶液的配製：稱取4g硫代乙醯胺，溶解於100ml水中。
3.5 甘油-鹼溶液：將200g甘油與135g水混合，加142.5ml 1N NaOH及47.5ml水。
3.6 硫代乙醯胺-甘油溶液：取0.2ml硫代乙醯胺溶液和1ml甘油-鹼溶液，於沸水浴上加熱20秒，配好後立即使用。
3.7 對照品制備：取2ml鉛標准溶液於50ml比色管中，用水稀釋至25ml，用1N醋酸或6N NH3H2O調至PH=3.0～4.0（用精密試紙測驗），稀釋至40ml。
4 操作步驟
按產品標準的規定取樣，並加適量水制備試液，加入適量鹽酸，煮沸，冷卻。滴加1：1氨水呈鹼性，用水稀釋至25ml，以精密試紙作指示，用1mol/L醋酸調PH=3.0~4.0，如需過濾，用10ml水沖冼坩堝和濾紙，將試液和沖洗水收集於50ml比色管中，稀釋至40ml，混勻。
分別向樣品、對照品試管中加入2ml PH=3.5緩沖液及1.2ml硫代乙醯胺甘油鹼溶液，用水稀至50ml，混勻，2分鍾後在白色表面上自上而下觀測，對照品相對於樣品為20PPm。

Ⅲ 如何建立高效液相色譜法測定有關物質的方法

摘要 本文就如何建立TLC法測定有關物質的方法進行論述，系統地闡述了薄層色譜法各條件確定的原理，並列舉了質量標准制訂中存在的某些問題。
關鍵詞 薄層色譜法（TLC法） 有關物質 方法建立
有關物質是研究葯品中除主成分以外的雜質，它可能是原料葯合成過程中帶入的原料、中間體、試劑、降解物、副產物、聚合體、異構體以及不同晶型、旋光異構的物質，也可能是制劑過程中產生的降解物，或是在貯藏、運輸、使用過程中產生的降解物等[1]。這些雜質的存在直接反映葯品的有效性和安全性，故要對其進行研究，特別是在葯品申報的質量研究資料中需建立其檢測方法，並根據生產、穩定性考核等實際情況考慮是否在質量標准中制訂該檢查項，規定其限度。目前，有關物質的常用測定方法有高效液相色譜法(HPLC法)和薄層色譜法(TLC法)。
TLC的特點是快速、簡便，尤其是對無紫外吸收的雜質測定，更具有其應用價值。如能將TLC法與HPLC法有機地結合、或彼此間進行比對研究，便可得到更多、更為准確的有關雜質信息，做到兩方法間的相輔相成，相益得彰！本文將著重討論如何建立薄層色譜法測定有關物質的方法。
1．測定方法類型
常用的方法有雜質對照品法（適用於已知雜質）和自身（稀釋）對照法（適用於一般雜質檢查，雜質成分少且尚不能取得雜質對照品）。目前國內由於難以獲得雜質對照品、故一般均採用自身對照法。
2．展開劑的確定（即專屬性試驗）
專屬性的研究是提供被分析物在雜質和輔料存在時能被區分的證明，該點是色譜條件建立的關鍵。通常採用在被分析物的對照品或精製品中加入一定量的雜質或輔料，證明色譜條件可將各雜質與被分析物分離[1]。這里的關鍵是：將多少量的雜質加入到多少量的主成分中。正確的作法是將1%(w/w)濃度量的各雜質加入到100%濃度的主成分中，配製這樣的溶液來
驗證系統適用性。之所以如此配製，目的是模仿樣品中有可能存在的狀態，即有少量（1%左右）雜質存在時是否能與主成分達到完全分離，只有這樣才能比較客觀、科學地反映樣品中實際存在情況的（見圖1）；而不應把該溶液配製成：主成分與中間體相同濃度的。因為一者實際檢測時樣品中不可能存在此種情況；二者該濃度不易確定，目前國內申報資料中一般的作法均是配製成較低的一致濃度，這樣各斑點當然易於完全分離了（見圖2），但在實際測定時，由於主斑點急劇增大，很易將相鄰雜質包含於主成分斑點中。同樣，質量標准中的系統適用性試驗用溶液的配製方法亦如此。

（1，3，4為雜質，2為主成分）
圖1 圖2 （雜質濃度均為供試品溶液濃度的1%）
3．檢出條件的確定
其基本出發點是：主成分與相關雜質均應在該條件下顯色，且在相同濃度下，斑點大小應基本一致。薄層板的類型根據被測物質的性質來選用，測定有紫外吸收的物質通常選用GF254或GF365板；測定無紫外吸收、需噴顯色劑的，常選用硅膠G板或H板，選用該類薄層板時，顯色方法根據被測物質的結構式選取，但當有多個顯色方法時，應分別進行試驗，選取靈敏度最高的顯色方法。如醋酸氫化可的松有關物質的測定，中國葯典2000年版採用鹼性四氮唑藍試液顯色，美國葯典26版採用硫酸-乙醇(10:90)溶液顯色，兩者均為激素類葯物的顯色方法。醋酸氫化可的松屬於激素類中的腎上腺皮質激素，四氮唑法是腎上腺皮質激素的重要顯色方法；而硫酸-乙醇顯色法則主要是針對激素類中的雌激素的顯色反應，對於屬於腎上腺皮質激素類的醋酸氫化可的松則反應活性不強，結果兩法的靈敏度相差10倍以上。因此，檢出條件的確定，一定要在查閱文獻的基礎上，並根據試驗結果進行綜合考慮。
4．供試品溶液濃度的確定（靈敏度試驗——最低檢出限的測定）
供試品溶液濃度的設定在有關物質檢測中是至關重要的，濃度越高、越能反映樣品中雜質存在的情況，但若設定得過高，則會產生主斑點嚴重拖尾、「斷腰」等超載現象的發生，產生錯誤結論；若設定太低，又將達不到檢測雜質的目的，觀測不到雜質量的變化。其設定是根據最低點樣量和最大點樣量來綜合考慮的。
最低檢出限雖然是個絕對值，但真正的意義卻是其相對值，即相對於供試品溶液的濃度多少而言，所以測定結果不僅要羅列出其絕對值又應列出其相對值，這樣最低檢出限才有意義！最大點樣量則是通過不斷加大供試品溶液濃度，直至主斑點嚴重拖尾、「斷腰」等情況出現時來得到的。然後根據最低檢出限，採用「上推法」來確定：如一般設定雜質斑點小於1.0%對照斑點，對照溶液的濃度至少應為最低檢出濃度（即最低檢出限）的20~50倍，則供試品溶液濃度是最低檢出濃度的2000~5000倍；反過來，最低檢出濃度應至少達到供試品溶液濃度的0.02%~0.05%。應注意的是：由於最低檢出量和最大點樣量因試驗環境、薄層板質量以及即時試驗時其他各因素的不同而改變（即耐受性因數），故供試品溶液的濃度在保證小於最大進樣量的情況下，可在此基礎上設定得再高一些，以保證該濃度可適用於各種條件下。舉例說明見表1（規定雜質限度為1.0%）。

表1 最低檢出量、最大點樣量、供試品溶液和對照溶液濃度之間的比例關系

最大點樣量
供試品溶液
對照溶液
最低檢出量 濃 度 8mg/ml 3mg/ml 30μg/ml 1μg/ml 點樣量 10μl 10μl 10μl 10μl 絕對量 30μg 0.3μg 10ng 相對於樣品測定濃度的 100% 1.0% 0.02% 倍 數 關 系 5000倍 30倍 「基準點」
供試品溶液濃度也可設定得再高些，但不可超過最大點樣量。
5．加樣回收試驗（即准確性試驗）
准確性試驗可採用在預經有關物質測定後的樣品中，加入已知量雜質的方法來評價。准確稱取各雜質，將含有1%(w/w)濃度的各雜質加入到樣品溶液中，以驗證所採用的薄層測定條件是否可分離檢測出相應的各雜質以及樣品中已存在的雜質是否累加，斑點是否加深。該原理同前面所述的專屬性研究是一致的。
6．強力破壞試驗
該項研究是為了揭示原料葯內在穩定性的特性，它是開發研究的一部分。這些試驗是在比加速試驗更劇烈的條件下進行的，其能夠包含葯品在銷售過程中所遇到的劇烈條件。可取一批樣品通過強光、高溫、高濕、氧化破壞、以及酸鹼破壞來證明該展開條件能分離檢測出雜質。
7．展開距離
測定時一定要採用25cm、長薄層板，展開距離應盡可能長一些，以使雜質與主成分盡量分離。如用短板，易造成臨近主斑點的雜質斑點「躲進」主斑點中。但同時又應注意，距離拉大，斑點分散，會損失最低檢出限，降低靈敏度，故應綜合考慮。
8．其它的因素
展開溫度應盡量控制在20~25℃之間，尤其在冬季，應注意環境的溫度，如太低，將嚴重影響展開效果。另層析缸的蓋兒，應塗抹凡士林油，以保證整個試驗過程中，層析缸的密封，避免展開劑揮發；並應在展開前，預先傾入展開劑，以使層析缸內的空氣飽和，達到最佳的展開效果。薄層板由於有自製、市售，質量不一也應注意。
二．討論
1． 質量標准中的系統適用性試驗，最好能將最難分離的雜質訂入系統適用性試驗用溶液的配製，將此雜質的濃度配製為主成分濃度的1%，或0.5%，或0.2%（依據雜質限度而定）進行試驗，驗證分離度後，再進行樣品的測定，以確保試驗的准確進行。
2． 質量標准中，應配製系列濃度的對照溶液（即梯度對照），以對雜質有「半定量」的概念，這可更好地評價雜質存在的情況；並應規定雜質的個數及最大雜質斑點的限度，使質量標准更完善、科學。經查閱，中國葯典薄層色譜法測定有關物質的有70個品種，僅有2個品種採用了梯度對照，絕大部分品種僅是制定了對照溶液，均未規定雜質個數，和最大雜質斑點限度，如有若干個雜質斑點也無法判定；而英國葯典和美國葯典則幾乎每個品種均採用梯度對照，並規定雜質個數和最大雜質斑點限度，這一點值得學習和推廣。
3． 錯誤的一種誤區，認為HPLC法完全替代了TLC法，這是不正確的，一定要做到相互補充、相互論證、相互參考才是最客觀、最科學的！
本文是在參閱了日本《分析方法驗證》一書和大量日本國內新葯申報資料中質量研究部
分的內容所寫而成。

Ⅳ 如何建立高效液相色譜法測定含量的方法

1 色譜條件的確定
專屬性是色譜條件建立的關鍵通常是採用
在被測物對照品(或供試品)中加入適量的雜質或輔
料以驗證所選色譜條件能否將各雜質與被測物
分離檢出
[2]
。應按1(w/w)被測物濃度的各雜質量
添加至被測物中模擬被測物中可能存在雜質的
狀態即有少量(約1)雜質存在時能否與被測物
達到完全分離(分離度大於1.5)以驗證系統適用
性。只有這樣才能較為客觀、科學地反映被測物的
實際情況。而不應將被測物與各雜質配製成相同濃
度的溶液因為實際檢測中不可能存在這種情況
且該濃度也不易確定。在實際檢測時由於被測物
濃度較大很易將相鄰雜質峰包含其中。另外還需
測定溶劑和輔料(檢測制劑時)是否有干擾。目前
美國葯典(USP)、英國葯典(BP)及許多進口產品的
質量標准中有關物質測定方法學的專屬性驗證均
採用此法。還須說明的是雜質與雜質峰間的分離
度達1.2即可而被測物與其相鄰雜質峰的分離度
必須大於1.5。
2 檢測波長的選擇
有關物質檢測的研究對象是雜質而非被測
物。但測定則是通過各自的峰面積來表達故波長
的選擇必須考慮被測物和各雜質在檢測波長下的校
正因子(f)是否相同。應分別制備相同濃度的被測
物與各雜質溶液經紫外掃描後以吸光度相近的波
長為檢測波長。在該檢測波長下分別進樣測定
由各峰面積計算校正因子。若f為0.81.2則表明
被測物與各雜質的f相同可消除f的影響。若f≤0.8
或f ≥1.2則應在計算時加入f。目前通常以被測物
的最大吸收波長為檢測波長、不加校正因子的計算
方法而未綜合考慮各雜質的f。
3 供試品溶液濃度的確定
供試品溶液濃度的確定也非常重要。雖然濃度
越高越能反映被測物中雜質存在的情況但若設定
過高會產生主峰嚴重拖尾、裂峰、柱超載和檢測器超載等情況若設定過低則靈敏度不夠無法
檢測雜質及其含量變化。
最低檢出濃度的測定可分為信噪比法和直接評
價法兩種
[3]
。後法是目前較為科學的做法即將儀
器的靈敏度調至較適宜的值(僅對靈敏度可調節的
儀器而言目前市場上主流品牌的液相色譜儀均已
設定了一個恆定、較為靈敏的值)然後將被測物
溶液不斷稀釋後進樣測定直至被測物峰面積無法
檢出為止此時的濃度即為最低檢出濃度。
最大進樣量則是採用不斷增加被測物溶液濃
度直至峰嚴重拖尾、裂峰、柱超載和檢測器超載
等情況出現。
根據最低檢出濃度採用「上推法」來確定
供試品溶液濃度如一般設定雜質總量小於1.0
對照液對照溶液的濃度至少應為最低檢出濃度的
2050倍供試品溶液濃度則應是最低檢出濃度的
20005000倍。同時還應考慮儀器、色譜柱等因
素對最低檢出濃度和最大進樣濃度的影響(即耐用
性因素)所以供試品溶液的濃度應在保證小於最
大進樣量的情況下適當設定得高些以保證該濃
度在任何試驗條件下均有足夠的檢測靈敏度。表
1為最低檢出濃度、最大進樣量、供試品溶液和對
照溶液間的比例關系(進樣量10µl規定雜質限度
1.0)。
4 線性試驗
在穩定性考察中如某雜質含量不斷增加
則說明被測物降解的途徑穩定、可循則有必要對
該雜質進行針對性地監控即採用該雜質對照品
(經確證結構後由人工合成獲得)以外標法准確測
定。此時與含量測定相似應進行線性試驗。
通常將雜質限度設定為該雜質的100濃度線性
驗證范圍10150(即相當於被測物測定濃度
表1 最低檢出量、最大進樣量、供試品溶液和對照
溶液間的比例關系
參數濃度/µg·ml
–
1
絕對量/ng相當於供試品
溶液濃度/與最低檢出
濃度的倍數
最大進樣量3000
最低檢出濃度0.110.02
供

Ⅳ 高效液相色譜法測定中葯含量採用的方法有哪些

遵照下面的要求選擇合適的方法,HPLC法外標、內標兩種,檢測器一般UV即可.
含量測定分析方法驗證的可接受標准簡介
摘要：本文介紹了在對含量測定所用的分析方法進行方法學驗證時,各項指標的可接受標准,以利於判斷該分析方法的可行性.
關鍵詞：含量測定 分析方法驗證 可接收標准
在進行質量研究的過程中,一項重要的工作就是要對質量標准中所涉及到的分析方法進行方法學驗證,以保證所用的分析方法確實能夠用於在研葯品的質量控制.為規范對各種分析方法的驗證要求,我國已於2005年頒布了分析方法驗證的指導原則.該指導原則對需要驗證的分析方法及驗證的具體指標做了比較詳細的闡述.但是文中未涉及各具體指標在驗證時的可接受標准,國際上已頒布的指導原則中也未發現相關的要求.另一方面,大多數葯品研發單位在進行質量研究時,已逐步認識到分析方法驗證的必要性與重要性,大都也在按照指導原則的要求進行分析方法驗證,但驗證完後卻因沒有一個明確的可接受標准,而難以判斷該分析方法是否符合要求.本文結合國外一些大型葯品研發企業在此方面的要求,提出了在對含量測定方法進行驗證時的可接受標准,供國內的葯品研發單位在進行研究時參考.
1．准確度
該指標主要是通過回收率來反映.驗證時一般要求分別配製濃度為80％、100％和120％的供試品溶液各三份,分別測定其含量,將實測值與理論值比較,計算回收率.
可接受的標准為：各濃度下的平均回收率均應在98.0%-102.0%之間,9個回收率數據的相對標准差（RSD）應不大於2.0%.
2．線性
線性一般通過線性回歸方程的形式來表示.具體的驗證方法為：
在80％至120％的濃度范圍內配製6份濃度不同的供試液,分別測定其主峰的面積,計算相應的含量.以含量為橫坐標（X）,峰面積為縱坐標（Y）,進行線性回歸分析.
可接受的標准為：回歸線的相關系數（R）不得小於0.998,Y軸截距應在100％響應值的2％以內,響應因子的相對標准差應不大於2.0%.
3．精密度
1）重復性
配製6份相同濃度的供試品溶液,由一個分析人員在盡可能相同的條件下進行測試,所得6份供試液含量的相對標准差應不大於2.0%.
2）中間精密度
配製6份相同濃度的供試品溶液,分別由兩個分析人員使用不同的儀器與試劑進行測試,所得12個含量數據的相對標准差應不大於2.0%.
4．專屬性
可接受的標准為：空白對照應無干擾,主成分與各有關物質應能完全分離,分離度不得小於2.0.以二極體陣列檢測器進行純度分析時,主峰的純度因子應大於980.
5．檢測限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於3.
6．定量限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於10.另外,配製6份最低定量限濃度的溶液,所測6份溶液主峰的保留時間的相對標准差應不大於2.0%.
7．耐用性
分別考察流動相比例變化±5％、流動相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、流速相對值變化±20％時,儀器色譜行為的變化,每個條件下各測試兩次.可接受的標准為：主峰的拖尾因子不得大於2.0,主峰與雜質峰必須達到基線分離；各條件下的含量數據（n=6）的相對標准差應不大於2.0%.
8、系統適應性
配製6份相同濃度的供試品溶液進行分析,主峰峰面積的相對標准差應不大於2.0%,主峰保留時間的相對標准差應不大於1.0%.另外,主峰的拖尾因子不得大於2.0,主峰與雜質峰必須達到基線分離,主峰的理論塔板數應符合質量標準的規定.
望採納，謝謝

Ⅵ 第二十章：高效液相色譜法

與經典色譜比較優點：

與氣相色譜比較：

按固定相聚集狀態：液液色譜法、液固色譜法

按分離機制：分配、吸附、離子交換、分子排阻四類基本機制

其他分離機制：親和色譜法、手性色譜法、膠束色譜法、電色譜法、生物色譜法

目前最常用固定相是化學鍵和相，稱為化學鍵和色譜法

鍵合相：通過化學反應將有機基團鍵合在載體表面構成的固定相

正相NP、反相RP

採用氰基、氨基等作為固定相，非極性或弱極性溶劑為流動相。

分離極性至中等極性分子行化合物

分離機制一般認為是分配，也有認為是吸附如形成氫鍵的

一般規律：劑型強的組分容量因子k大，後出。流動相極性增強洗脫能力增強

十八烷基硅烷、辛烷基硅烷等，有時也用弱極性或中等極性

流動相以水作為基礎溶劑再加一定量極性調整劑

分離機制有爭論，多種理論模型

影響組分保留行為的主要因素：

分離非極性至中等極性組分

離子對色譜法（IPC）分正相和反相，正相已經少用。

反相離子對色譜法（RP-IPC）是把離子對試劑加入到含水流動相中，使被分析組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子生成不帶電荷的中性離子，使組分k增加，用於分離可離子化或離子型化合物

用於生物鹼類、兒茶酚胺類、有機酸類、維生素類、抗生素類葯物分析

離子色譜法：將離子交換色譜與電導檢測器相結合分析各種離子的方法

可以分析無機和有機陰陽離子，氨基酸、糖類、DNA和RNA的降解產物

分為抑制型（雙柱型）、非抑制型（單柱型）

對於X ^- 離子：

雙柱型使用兩根離子交換柱，一根為分離柱，填有低交換容量的陰離子交換劑，另一根為抑制住，填有高交換容量的陽離子交換劑，兩者串聯。進入分離柱的組分X ^- 按正常離子交換色譜分離，在進入抑制柱，除去組分中的OH ^- 從而使本底電導率降低，利於較大電導率HX的檢測。

非抑制型可使用更低交換容量的固定相，濃度很低、電導率很低的流動相，這樣本底電導率低，試樣離子被洗脫後可直接被電導檢測器檢測

利用手性固定相（CSP）、手性流動相添加劑（CMPA）分離分析手性化合物的對映異構體的色譜方法。還有間接法（加入手性試劑使一對對映體轉變為非對映體用常規方法分離）。

環糊精（CD）也是一種手性選擇劑，分離機制主要是由於分子內熟睡空腔的動銷和多手性中心的作用，如果對映體能被空腔緊密包絡，而且與CD分子外沿的仲醇基作用，則被固定相保留，兩對映體與CD作用程度不同從而分離。

親和色譜法（AC）利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從復雜試樣中分離和分析能產生轉移性親和作用的物質的一種色譜方法。選擇性最高。

要求：顆粒細且均勻、傳質快、機械強度高、耐高壓，化學穩定性好

液固：全多空硅膠、高庚子多空微球

應用最多的是化學鍵和相

要求：化學穩定性好；適宜溶解度；與檢測器相適應；純度高；粘度低

使用前經微孔濾膜過濾，除去固體顆粒，還要脫氣處理

分離方程式：

選擇合適的溶劑強度使組分k在最佳范圍內，選擇合適種類的溶劑改善選擇性使α增大獲得良好分離度R>1.5

在化學鍵和色譜中溶劑洗脫能力即溶劑強度直接與它的極性相關。

溶劑極性用溶劑極性參數表示 ，用以表示正相色譜中洗脫能力

反相鍵合相色譜溶劑強度用另一強度因子S表示

混合溶劑可以用P或S的加權平均表示

HPLC速率理論方程：

盡可能減小柱外死體積

（349頁圖）

高效液相色譜儀一般由高壓輸液系統、進樣系統、色譜柱分離系統、檢測系統和數據處理系統組成

分類：

要求：靈敏度高、雜訊低、線性范圍寬、重復性好、適用范圍廣

紫外檢測器UVD：不破壞樣品，只能檢測有紫外吸收物質、對流動相有限制

熒光檢測器FD：靈敏度更高，只適用於產生熒光物質，體內葯物分析常用

電化學檢測器ECD：極譜、庫侖、安培、電導。電導用於離子檢測，安培應用廣泛，靈敏度高適用於痕量組分分析，凡是具有氧化還原活性的都能進行檢測

蒸發光散射檢測器ELSD：適用於揮發性低於流動相的組分，用於糖類、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、三醯甘油及甾體；對各種物質幾乎有相同響應；但是靈敏度低，流動相必須是揮發性不能含有緩沖鹽。

儀器自動化：

採集和分析色譜數據：

中心計算機控制系統：

超高效液相色譜法UPLC：藉助於HPLC理論及原理，利用小顆粒固定相，非常低的系統體積及快速檢測手段等技術，使分離度、分析速度、檢測靈敏度及色譜峰容量大大提高，從而全面提升了液相色譜的分離分析效能。

操作條件比較（355表）

優點：分析速度快；分離效能高；靈敏度高——小顆粒技術和整體化儀器設計

van Deemter方程，可以發現固定相粒度越小，分離度越大。同時粒度越小，最佳流動相線速度越大，並有更寬優化范圍，因此降低粒度可以提高分析速度。但是會增加系統柱壓差，受到固定相機械強度和色譜儀系統耐壓性限制

常用外標和內標，少用歸一化。對葯品中雜質含量測定常用主成分自身對照法

主成分對照法分為不加校正因子和加校正因子兩種：

注意進行色譜系統適用性試驗：理論塔板數、分離度、拖尾因子和重復性

Ⅶ 高效液相色譜有幾種定量方法其中那種是比較精確的定量方法並簡述

峰面積法、峰高法、歸一法、外標法。峰面積法是比較精確的定量方法

Ⅷ 高效液相色譜的原理及分析方法

原理主要有這幾種：
液—液分配色譜法
(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從於高效液相色譜計算公式： 高效液相色譜計算公式
式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。 a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性。 b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性。 c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。
液—固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm 式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。 當吸附競爭反應達平衡時： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]
離子交換色譜法
(Ion-exchange Chromatography) IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流 離子交換色譜柱
動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下： X-(溶劑中) (樹脂-R4N Cl-)=== (樹脂-R4N X-) Cl- (溶劑中) 當交換達平衡時： KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-] 分配系數為： DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-] [討論：DX與保留值的關系] 凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。
離子對色譜法
(Ion Pair Chromatography) 離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原 離子色譜儀流程示意
理可用下式表示：X 水相 Y-水相 === X Y-有機相 式中：X 水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X Y---形成的離子對化合物。 當達平衡時： KXY = [X Y-]有機相/[ X ]水相[Y-]水相 根據定義，分配系數為： DX= [X Y-]有機相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相 [討論：DX與保留值的關系] 離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及葯物等分離。
離子色譜法
(Ion Chromatography) 用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。 以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）： 擔體圖示
抑制柱上發生的反應： R-H Na OH- === R-Na H2O R-H Na Br- === R-Na H Br- 可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H Br-，可用電導法靈敏的檢測。 離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
空間排阻色譜法
(Steric Exclusion Chromatography) 空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。
分析方法：
綜述
色譜柱的填料和流動相的組分應按各品種項下的規定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠。後者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用,辛基鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料,用於離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用於分子排阻色譜等。注樣量一般為數微升。除另有規定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。 在用紫外吸收檢測器時,所用流動相應符合紫外分光光度法項下對溶劑的要求。 正文中各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其餘如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進化學鍵合固定相反應
樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變, 以適應具體品種並達到系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約於20分鍾內記錄完畢。 2.系統適用性試驗 按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規定的對照品對儀器進行試驗和調整,應達到規定的要求；或規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數、分離度和拖尾因子.
色譜柱的理論板數
在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖化學鍵合固定相應用
，量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n＝5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計算色譜柱的理論板數，如果測得理論板數低於各品種項下規定的最小理論板數，應改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優劣等），使理論板數達到要求。
分離度
定量分析時，為便於准確測量，要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計算公式為： 2[t(R2)-t(R1)] ，R＝ -W1＋W2 式中 t(R2)為相鄰兩峰中後一峰的保留時間； t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另外有規定外，分離度應大於1.5。
拖尾因子
為保證測量精度，特別當採用峰高法測量時，應檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項下的規定,或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為： W(0.05h) T＝-2d1 式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬； d1為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規定外，T應在0.95～1.05間。 也可按各品種校正因子測定項下，配製相當於80％、100％和120％的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次,計算平均校正因子，其相對標准偏差應不大於2.0％。