① 抗原抗體反應的基本方法有哪些
一）特異性
抗原抗體的結合實質上是抗原表位與抗體超變區中抗原結合點之間的結合。由於兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原與抗體的結合具有高度的特異性。這種特異性如同鑰匙和鎖的關系。例如白喉抗毒素只能與相應的外毒素結合，而不能與破傷風外毒素結合。但較大分子的蛋白質常含有多種抗原表位。如果兩種不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗體間構型部分相同，皆可出現交叉反應。
圖9-1沉澱反應中沒淀量與抗原抗體的比例關系
ag：抗原；ab：抗體
（二）按比例
在抗原抗體特異性反應時，生成結合物的量與反應物的濃度有關。無論在一定量的抗體中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗體，均可發現只有在兩者分子比例合適時才出生現最強的反應。以沉澱反應為例，若向一排試管中中入一定量的抗體，然後依次向各管中加入遞增量的相應可溶性抗原，根據所形成的沉澱物及抗原抗體的比例關系可繪制出反應曲線（圖9-1）。從圖中可見，曲線的高峰部分是抗原抗體分子比例合適的范圍，稱為抗原抗體反應的等價帶（zoneofequivalence）。在此范圍內，抗原抗體充分結合，沉澱物形成快而多。其中有一管反應最快，沉澱物形成最多，上清液中幾乎無游離抗原或抗體存在，表明抗原與抗體濃度的比例最為合適，稱為最適比（optimalratio）。在等價帶前後分別為抗體過剩則無沉澱物形成，這種現象稱為帶現象（zonephenomenon）。出現在抗體過量時，稱為前帶（prezone），出現在抗原過剩時，稱為後帶（postzone）。
關於抗原抗體結合後如何形成聚合物，曾經有過不少解釋。結合現代免疫學的成就呼電鏡觀察所見，仍可用marrack（1934）提出的網格學說（latticetheory）加以說明。因為大多數抗體的巨大網格狀聚集體，形成肉眼可見的沉澱物。但當抗原或抗體過量時，由於其結合價不能相互飽和，就只能形成較小的沉澱物或可溶性抗原抗體復合物。
在用沉澱反應對不同來源的抗血清進行比較後，發現抗體可按等價帶范圍大小分為兩種類型，即r型抗體和h型抗體。r型抗體以家兔免疫血清為代表，具有較寬的抗原抗體合適比例范圍，只在抗原過量時，才易出現溶性免疫復合物，大多數動物的免疫血均屬此型。h型抗體以馬免疫血清為代表，其抗原與抗體的合適比例范圍較窄，抗原或抗體過量，均可形成可溶性免疫復合物。人和許多大動物的抗血清皆屬h型。
（三）可逆性
抗原抗體反應遵循生物大分子熱動力學反應原則，其反應式為：
[ab-ag]／[ab].[ag]=k1/k2=k
式中各反應項的單位以mol表示，k1表示反應速度常數，k2為逆反應速度常數，k是反應平衡時的速度常數。由上式可知，k值是反映抗原抗體間結合能力的指示，所以抗體親和力通常以k值表示。
抗原抗體復合物解離取決於兩方面的因素，一是抗體對相應抗原的親和力；二是環境因素對復合物的影響。高親和性抗體的抗原結合點與抗原表位的空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不容易解離。反之，低親和性抗體與抗原形成的復合物較易解離。解離後的抗原結合牢固，不容易解離。反之，低親和性抗體與抗原形成的復合物較易解離。解離後的抗原或抗體均能保持未結合前的結構、活性及特異性。在環境因素中，凡是減弱或消除抗原抗體親和力的因素都會使逆向反應加快，復合物解離增加。如ph改變，過高或過低的ph值均可破壞離子間電引力消失。對親合力本身較弱的反應體系而言，僅增加離子強度即可解離抗原抗體復合物的目的；增加溫度可增加分子間的熱動能，加速已結合的復合物的解離，但由於溫度變化易致蛋白變性，所以實際工作中極少應用。改變ph和離子強度是最常用的促解離方法，免疫技術中的親和層析就是以此為根據純化抗原或抗體。
② 免疫學的抗體定量實驗
慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個困擾全球的健康問題，世界范圍內大約有3.5億人感染HBV，其中亞洲佔了3/4，僅中國就有近1.3億人攜帶HBV[1]. HBsAg攜帶率達9.75%，慢性乙型肝炎患者達3 000萬人，其中約10-20%發展成為肝硬變，1-5%可演變成為肝細胞癌(HCC). 近來國內外對慢性乙型肝炎治療已有了很大進展，主要採用抗病毒、免疫調節、改善肝功能和防止慢性化發展等綜合治療. 近些年來，肝病學界已達成共識，認為抗病毒治療是其中最主要、最根本的治療措施，目前用於病毒性肝炎抗病毒治療的葯物主要有二類，一類是抗病毒葯物，具有直接抑制及殺滅病毒的作用; 另一類是免疫調節劑，通過調節人體的免疫功能，從而抑制及清除肝炎病毒. 但是這些葯物的效果還不穩定，治療費用昂貴，所以不論是從療效的角度，還是從經濟角度，人們都在尋求一種有效的方法來預測葯物的效果及進一步指導用葯. 先前人們選用免疫學的方法來預測抗病毒葯物的療效，隨著現代分子生物學的快速發展，又為慢性乙型肝炎抗病毒治療相關研究提供了新的機遇與挑戰，人們通過監測治療前、治療時及治療後病毒載量的變化可更准確的，更量化的預測葯物的療效，並為治療措施的制定提供有力的依據.
1 乙型肝炎病毒在細胞內的復制與清除
在HBV復制循環過程中，一個重要的特徵是共價閉環(ccc)或超螺旋DNA分子的形成，作為一種病毒的微染色體而存在[2]. 雖然HBV僅在宿主細胞內復制，病毒本身不能引起肝細胞病變，但是HBV通過細胞內免疫引發的肝損害是慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌的主要原因[1].
乙型肝炎患者自體每日可清除外周血中大量HBV. 根據最近對HBV在人體內動力學研究，HBV的半衰期為26.4 h，病毒存活期為36.6 h，日更新率為48%，所以控制人體病毒感染的關鍵在於清除HBV cccDNA，抑制病毒復制[3-4]. Guidotti et al [5] 的研究得出在動物模型中，病毒第一階段的清除主要通過非細胞病理的作用清除或抑制cccDNA的產生，可能是通過細胞因子的作用. Whalley et al [6]在對人急性HBV感染的動力學研究中，得出病毒清除第一階段半衰期的平均數與動物模型中cccDNA半衰期相一致[7]. 該項研究提示病毒初始階段的清除機制或許與cccDNA的清除相關; 但是該實驗不能得出在病毒生活周期的下游階段可能受到的抑製作用，這些還需要大量直接的實驗加以驗證. 於是人們期望著能通過清除HBV的復制模板cccDNA來降低被感染細胞的產病毒的能力，由此可導致血清中相關病毒DNA的降低.
2 抗乙型肝炎病毒的治療
慢性HBV感染常常是由於早期暴露於HBV的結果，導致了病毒在缺乏強大抗體與細胞內免疫反應的情況下長期存在[8]. 如果人體的免疫機制不能及時清除HBV在體內的持續存在與活躍復制，必將導致肝組織損傷的不斷進展. 因此，要想阻止肝臟進行性損害，必須採取有效葯物清除或抑制HBV的復制，也就是說抗病毒治療是控制慢性乙型肝炎的最主要、最根本的治療措施.
目前用於抗病毒治療的葯物主要有兩類，一類為細胞因子，如干擾素，有a，b，g三種，a，b干擾素療效相似，臨床應用較廣泛，g-干擾素療效較差，應用受到限制. 他們一方面通過免疫調節發揮作用，另一方面也可直接抗病毒，然而IFNa的治療效果是有限的，長期應用才可抑制HBV復制，獲得持久性效應. IFNa治療慢性乙型肝炎的治療效果和療程有關，治療近期療效較高，遠期療效尚低，如果有針對的選擇病例，可以提高療效. 因為其不能清除cccDNA，停葯後可再次復制，也不能清除已整合入的細胞基因組的病毒基因，而且長期使用有很多的副作用，於是出現了另一類可大量直接抗病毒的葯物，即核苷類似物，通過抑制病毒聚合酶來阻止病毒的復制，如拉米夫定、泛昔洛韋、阿昔洛韋已用於臨床，阿德福韋、恩他卡韋和BMS-200475也正在進行臨床試驗. 其中拉米夫定是最具代表性的一個，在HBV復制循環過程中，病毒的逆轉錄酶是合成新的HBV DNA的前基因組mRNA模板所必需的，由此拉米夫定可阻止已被病毒感染的細胞生產新病毒[9]. 另外病毒的聚合酶是病毒進入細胞核之前形成雙鏈環狀DNA所必須的[10]，故拉米夫定還可阻止病毒感染新的細胞[11]. 他與IFNa的不同之處是其不影響機體的免疫系統，最早用於治療免疫缺陷型病毒，後來發現其對HBV也有明顯的抑製作用，而且作用迅速，可降低HBV DNA低度可達106, 7拷貝/L，已廣泛用於臨床. 但是其對HBV的抑製作用是可逆的，停用葯物後HBV DNA又反復出現，低於或相當於基礎水平，而且也不能完全清除cccDNA，更不能清除已與細胞基因組整合的病毒，使HBsAg消失. 只有長期使用，持續性抑制HBV復制直至消耗cccDNA，才可獲得持久性效應[12]，但是YMDD變異的存在，對其在臨床中的應用提出了挑戰，患者的選擇及停葯時機的選擇都是至關重要的. 近年來有效的抗病毒葯物的使用大大促進了人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒、HBV、丙型肝炎病毒(HCV)感染的動力學數學分析的發展[13]. 反過來，在抗病毒的治療過程中，對於這些病毒感染的動力學的深入理解不僅為病毒發生機制提供了動力學圖譜，而且也為設計合理的治療措施提供了有力的依據，使人們越來越意識到研究病毒動力學的重要性及其臨床意義.
3 乙型肝炎病毒載量
3.1 與抗原抗體的模式關系 早期人們多採用血清學方法進行乙型肝炎病原學診斷，預測其傳染性、疾病進程及預後. 在病毒復制過程中，也表達病毒特異蛋白，這些蛋白可激發機體的免疫系統，產成相應的抗體，故可通過檢測抗原抗體來間接反應病毒的復制水平. Gerken et al [14]用IFNa治療慢性活動性肝炎期間，發現抗-HBcIgM和病毒載量有很好的相關性; 隋雲華et al [15]通過對838例各型乙型肝炎患者血清HBV DNA定量，得出HBV DNA定量與HBsAg、HBeAg、HBcAb 陽性的符合率為94.4% ，顯示了極好的特異性. 但是免疫學檢測存在許多無法克服的問題，如抗原變異、免疫交叉反應、免疫復合物的形成[16]，這些都影響著血清學檢測方法的靈敏度和准確性的進一步提高，另外HBV的表達和機體的免疫反應的強弱受多種因素的影響，免疫學指標與臨床現象及病毒載量有可能不完全吻合. 隨著逆轉錄酶抑制劑的廣泛使用，病毒變異的廣泛存在，緊緊依靠免疫學指標已經不能完全解釋許多臨床現象. 血清學檢測不能准確地反應病毒的復制，故病毒載量的檢測被越來越廣泛地用於臨床診斷. 有學者在分析免疫學檢測與病毒載量檢測之間的關系時得出，HBsAg，HBcAb 陽性，HBsAg，HBeAb，HBcAb陽性組，HBV DNA的陽性率分別為38.6%和27.3%，顯示了HBV DNA定量的靈敏性[21]. 隨著一些抗病毒葯物的有效應用，臨床中發現某些HBeAg陽性的乙型肝炎患者的HBV DNA呈陰性結果，提示血清學標志反映HBV復制狀態存在局限性. 李文清et al [23]調查了20例乙型肝炎患者(16例HBeAg陽性和4例HBeAb陽性)在拉米夫定治療期間，經12 wk和24 wk治療後，其HBV DNA含量迅速下降，部分HBV DNA含量低於檢測范圍，而呈陰性結果，其陽性率分別僅為75.0%和55.0%，而血清學標志無1例發生變化. 表明在抗病毒治療期間，血清學標志的變化滯後於HBV DNA含量的變化，HBV DNA定量檢測是反映HBV復制和葯物療效的判斷最直接、可靠的指標[17].
既往一般認為，血清HBeAg陰轉或抗-HBe出現預示病毒復制水平降低或病變趨於恢復[18]，但有報道指出HBeAg陽性患者的病毒載量比HBeAg陰性患者的高[19]，在其調查的116例患者中有42例(36.1%)血清HBeAg陰性，但仍可檢出HBV DNA，部分病例HBV DNA水平還較高，提示HBeAg陰轉不能認為HBV復制減少或停止. 近年的研究發現，這些患者中多數伴有HBV前-C區的基因突變，特別是第1896位核苷酸的突變，致使前-C區第28位密碼子(TGG)轉變為翻譯終止密碼子(TAG)，導致HBeAg的合成、分泌障礙，但卻不影響HBV的復制[20]. 這種變異的HBV比野生型HBV更不易被機體清除，因而更易引起乙型肝炎慢性化、慢性肝炎惡化，且與重型肝炎和肝癌密切相關[21]. 因此，血清HBeAg陰性而HBV DAN含量高的患者應引起臨床上重視，慢性乙型肝炎(CHB)患者隨著肝損害程度的加重，血清HBV DNA含量卻逐漸下降，提示病情可能越重，病毒復制水平越低. 這可能與CHB患者機體的體液和細胞免疫應答在造成肝損害的同時，也中和和清除血循環中的病毒顆粒有關[22]，表現為免疫損傷越嚴重，肝損害程度也越嚴重，血清HBV DNA含量越低. 此外，隨著病程的延長，病情的加重，部分HBV DNA被整合到宿主肝細胞中，致使血清HBV DNA含量降低. 因此，CHB患者定量檢測血清HBV DNA含量對臨床判斷肝損害程度，指導抗病毒治療，估計其預後有重要意義.
3.2 病毒動力學 病毒的動力學研究主要通過假設的數學模型，結合抗病毒葯物作用下病毒載量的動態變化數據求解得到的病毒感染動力學特徵的基本參數. 了解病毒感染動力學過程，可以更清楚的理解病毒感染發生、發展、轉歸以及葯物治療效果. 最初的病毒動力學原理的研究是源於對HIV感染動力學分析，並促進了病毒動力學的發展. 在慢性病毒感染的患者中，病毒的水平通常被認為達到一個穩定或恆定水平，然後保持這一狀態很多年. 為了保持這一恆定的水平，機體必須以同樣的速率清除和生產病毒. 如果不保持清除與產出平衡的話，那麼病毒的數量就會慢慢地增加. 一旦恆定點建立，測量病毒載量將不能證實病毒的生產是減慢了，還是加速了. 因此為了獲得病毒生產與清除率的信息，不得不用抗病毒葯物打亂該系統. 例如，如果病毒生產能夠完全被阻止，那麼病毒載量將會下降，他下降的速率是清除的速率. 如果病毒的生產不能完全被阻止，那麼病毒載量下降的速率將不僅僅依賴於病毒清除的速率，而且也依賴於生產病毒的細胞的死亡率和抗病毒葯物的效果[23].
目前HBV動力學研究也有報道，獲得了一些重要參數[24]，該參數包括病毒感染，細胞的死亡及抗病毒葯物的療效. 其中基本的動力學模型可用於研究HBV的感染，計算慢性感染過程中平衡病毒學載量，也適於研究抗逆轉錄病毒的抗病毒治療. Whalley et al [6]通過檢測急性HBV感染者病毒潛伏後期和臨床期血清病毒載量的動態變化，研究了HBV感染動力學過程. HBV復制很快，在2.2-5.8(3.7±1.5 d)，經過一個峰值後，血清中病毒載量達到約1013拷貝/L. HBV DNA的清除經過2-3階段下降，第一階段為快速下降期，半衰期為3.7±1.2 d，接近於在其他嗜肝病毒中所觀察到的cccDNA通過非細胞病理機制清除時的半衰期. 最後的病毒清除階段半衰期范圍很廣泛，在4.8-284 d之間，這可能與感染肝細胞的清除率有關. 游離病毒的半衰期大多數為1.2±0.6 d. 他們估計在病毒復制高峰每天至少產生1013個病毒，平均一個感染肝細胞每天最多能產生200-1 000個病毒. Nowak et al [25]通過假設拉米夫定完全阻斷了病毒對細胞的感染，使感染細胞數量維持恆定，從而建立了一個數學模型，提出了病毒清除表現為雙期過程的理論. Tsiang et al [26]對Nowak數學模型作了修正，他們假設感染的細胞並不維持恆定，引入了病毒抑制效率參數. 應用修正後的模型評價了阿德福韋對病毒的抑制效率參數，得出30 mg/d 阿德福韋對病毒的抑制效率為0.993±0.008， 即治療期間每天仍有0.7%的病毒產生. Lowin et al [27]提出病毒的下降模式可能存在更復雜的多階段模式-階梯式. 通過對病毒動力學的研究了解病毒在清除過程中的特點，從而可指導臨床評估葯物療效，以及針對不同的患者設計合理的治療方案.
3.3 動態學檢測與抗病毒治療 病毒載量一般指每毫升血清中病毒拷貝數，也表示肝臟病毒含量. 血清中，病毒DNA水平與病毒含量一致，病毒載量和病毒DNA水平意義相同; 但肝臟中的病毒DNA水平包括已包裝和待包裝的病毒DNA，因此病毒載量和病毒DNA水平不完全等同. 感染細胞和血清中的病毒半衰期均很短，因此血清病毒水平反應了病毒的復制水平，但病毒載量並不完全反映病毒的復制水平，其反映的是檢測前感染細胞釋放的病毒與被清除體外的病毒的累積差值. 數值大小不直接與感染細胞生成速度(復制水平)有關，而是與感染細胞的破壞速度和機體清除游離病毒的速度有關. 病毒載量可以通過測定病毒基因組來確定[28]. 病毒載量在不同患者、不同發病階段和不同發病類型中，相同大小的病毒載量可能表示不同的臨床意義. 以前，病毒載量的檢測僅用於基礎研究，現在被廣泛用於常規的病毒學診斷，並且檢測試劑已大量商品化. 在臨床病毒學中，病毒載量的測試主要用於四個目的: 即病毒學診斷; 評估患者的預後; 作為檢測抗病毒治療效果的標志; 評估患者的傳染性，即傳播的危險性.
病毒載量定量檢測使人們能夠比較清楚地了解病毒在體內的致病作用，彌補了免疫學方面的不足. Nowak et al [3]對使用拉米夫定治療的患者進行了隨訪觀察，監測其病毒載量的變化，利用數學模型分析病毒載量下降的特點、治療的效果. 結果發現，在治療的第2-4 wk，血清中病毒DNA降低分兩階段進行. 第一階段主要是游離病毒的清除，第二階段主要是生產病毒的被感染細胞的清除. 當患者停止使用拉米夫定，病毒水平將會迅速增加至初始的穩定階段. Zeuzem et al [29]和Tsiang et al [26]也觀測到了病毒載量分兩階段下降這一特徵. 從這些研究中，按每天50%的反復率可估計游離HBV的半衰期約為24 h， 游離病毒的生產率約每天1012，被感染細胞的半衰期為10-100 d. Lowin et al [27]指出病毒的下降模式在一些患者中可能更加復雜，患者採用拉米夫定聯合泛昔洛韋，或聯合其他的核酸類似物，採用實時PCR法監測病毒的下降模式. 結果發現對部分患者而言，病毒水平不是按照前面所描述的典型的兩階段模型下降，其下降模式更像階梯式，提示HBV病毒動力學或許比先前提及的更為復雜，另外有兩例患者血清中的HBV DNA更加快速的被清除，提示先前估計的游離病毒的半衰期為24 h並不是普遍存在的. Tsiang et al [26] 在近來的阿德福韋Ⅱ期臨床研究過程中，有15例慢性HBV患者接受了每天使用30 mg阿德福韋，持續了12 wk，結果血漿中HBV水平下降了104.1. 雖然病毒清除的第一階段及第二階段的初始階段與先前的兩階段模式相符合，但是病毒載量實際上處於不穩定狀態，在第二階段中病毒DNA以更低的速率持續下降，病毒載量的變化甚微，在治療30 d Nowak et al [25] 的模型不再適用. 血漿中病毒水平迅速和持續的降低依賴於病毒生產有效的抑制，因為這些都是由抗病毒治療的劑量與效力所決定的. 病毒生產完全抑制的缺乏，病毒徹底清除與肝纖維化危險性的降低及肝細胞癌的發展將主要依靠被感染細胞降低的有效率[30-31]. 顯然還需要大量的研究來證實這些有意義的發現.
血清HBV DNA檢測對監測病毒載量的變化起到重要的作用，但是肝組織中的HBV DNA的檢測可更准確地反映病毒的復制情況. 張光曙 et al [32]通過肝活檢，檢測肝組織HBV DNA，結果發現在急慢性HBV感染中可提高確診率，尤其是慢性感染. 研究觀察證實血清內的HBV DNA檢出率和HBV DNA含量均明顯低於肝細胞，提示肝細胞內HBV DNA陰轉可能晚於血液，因而提示在抗病毒治療時，血內HBV DNA陰轉並不能說明肝細胞內亦已陰轉，在血液內HBV DNA陰轉不應隨即停止治療，應結合臨床表現及肝組織中HBV DNA是否陰轉來判定. 故除了監測血清中病毒載量的變化外，應該進一步檢測肝組織中的病毒DNA，因為其能更准確地反映病毒的復制狀況，但是由於取材較復雜，故臨床的應用受到限制.
病毒載量及其動態變化與臨床現象的關系比較復雜，需准確觀察低復制病毒的微量變化; 逆轉錄酶抑制劑的應用提高了乙型肝炎的治療效果，但這類葯物可引起HBV耐葯毒株的出現，從而引發停葯後反彈，是目前在乙型肝炎治療中比較棘手的一個問題[33-35]. 故應針對不同患者具體的發病階段和治療措施，適時、動態的測定多個時間段的病毒載量，在治療期間預測耐葯毒株，及時調整治療方案，這些都對HBV的治療有重要意義.
膠原蛋白實驗方法
中譯本序言
當今，國際上對結締組織尤其是膠原蛋白的研究相當活躍，其進展亦相當迅速，已引起我國生物學及醫學工作者的極大關注。
膠原蛋白是動物體內含量最多，分布最廣的蛋白質，與機體的生長、衰老及疾病有著極其密切的關系。長期以來，中醫對一些難治性結締組織病（如肝、肺、腎等臟器的纖維化、動脈硬化、硬皮病、粘連包塊、疤痕、類風濕性關節炎以及紅斑狼瘡等）的治療有一定獨到之處，全國中西醫結合研究會活血化瘀專業委員會已將結締組織增生性疾病作為血瘀研究的一個重要內容。因之深入開展膠原研究對發展中醫學有一定幫助。近年來，隨著膠原研究的進展，一些與膠原代謝有關的疑難雜症的病理現象正在逐步闡明，1985年日本對有關膠原研究的投資竟佔全國年度總醫療經費的10％。
由於膠原性狀的特殊性，所以有必要將國外有關膠原蛋白研究的實驗方法介紹給我國眾多的讀者，以便使我國這一領域的研究盡快地趕上世界先進水平。
《コぅへゲニ実驗法》一書是目前關於膠原蛋白實驗方法學較全面的一部著作。著者永井裕教授為膠原酶研究的創始人之一，藤本大三郎教授有關膠原蛋白架橋的研究則處於世界領先地位；本書的其他執筆者也都是長期直接從事膠原蛋白研究的人員，因而得以使本書具有先進性及較高的實用價值。譯者劉平博士將本書譯成中文出版，對我國從事有關膠原蛋白研究的科技工作者定會有所幫助，對我國的膠原研究亦將起一定的促進作用。
目 錄
1章：膠原蛋白的提取與精製
1.1膠原的性狀及提取過程中的注意事項
1.1.1可溶性膠原和不溶性膠原
1.1.2有關膠原的術語
1.1.3膠原溶液的性質
1.1.4沉澱溶液內膠原時的注意事項
1.1.5膠原溶液制備過程中的注意事項
1.1.6精製膠原的保存
1.1.7制備膠原用原材料的前處理
1.1.8試劑及器具
1.2前膠原的制備
1.2.1概述
1.2.2實驗方法
1.3硬組織中膠原的制備方法
1.3.1概述
1.3.2實驗方法
1.3.3注意事項和存在的問題
1.4各型膠原的制備
1.4.1I型、Ⅱ型、Ⅲ型膠原
1.4.2Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型膠原
1.4.3Ⅶ型（LC：LongChain）膠原
2章：膠原的分析
2.1羥脯氨酸的定量
2.1.1概述
2.1.2Woessner的方法（第I法）
2.1.3Kivirikko，Laitinen.Prockop等人的方法
2.1.4Inayama.Shibata，OhtsukiSaito的方法
2.1.5應用氨基酸分析儀的定量測定
2.2離子交換及層析方法
2.2.1概述
2.2.2實驗方法
2.3SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDs－PAGE）
2.3.1概述
2.3.2一維SDS－PAGE
2.3.3二維電泳
2.4熒光自顯影
2.4.1概述
2.4.2熒光自顯影的原理
2.4.3熒光自顯影的實際操作
2.4.4光密度檢測的定量方法
2.4.5熒光自顯影時諸條件的探討
2.4.6PPO的回收
2.5CB肽段的制備與分離
2.5.1CB肽段的制備
2.5.2CB肽段的分離
2.6羥賴氨酸－糖化合物的分析
2.6.1概述
2.6.2實驗方法
2.7架橋的分析
2.7.1還原性架橋的分析方法
2.7.2非還原性架橋的分析方法
3章：免疫學的實驗方法
3.1抗膠原抗體的制備方法
3.1.1概述
3.1.2實驗方法
3.2抗體的檢測方法
3.2.1概述
3.2.2實驗方法
3.3免疫組織化學的檢測方法
3.3.1概述
3.3.2實驗方法
3.4免疫電鏡的方法
3.4.1概述
3.4.2實驗方法
3.5遲發型過敏反應
3.5.1概述
3.5.2皮內試驗
3.5.3體外判斷法：細胞移動抑制試驗
4章：膠原代謝的研究方法
4.1應用細胞培養的膠原合成實驗
4.1.1組織（器官）細胞的分離
4.1.2生物合成實驗時培養系統的選擇
4.1.3放射性羥脯氨酸的定量
4.1.4用細菌性膠原酶檢測膠原合成率的方法
4.2脯氨酸羥化酶、賴氨酸羥化酶
4.2.1概述
4.2.2脯氨酸羥化酶的測定方法
4.2.3脯氨酸3－羥化酶活性的測定方法
4.2.4賴氨酸羥化酶活性的測定方法
4.3前膠原肽酶活性的測定
4.3.1概述
4.3.2實驗方法
4.4賴氨醯氧化酶
4.4.1概述
4.4.2實驗方法
4.4.3注意和存在的問題
4.5膠原酶及有關膠原分解酶活性的測定方法
4.5.1間質型膠原分解酶活性的檢測方法
4.5.2膜型（Ⅳ型及Ⅴ型）膠原分解酶活性的檢測方法
4.5.3明膠分解酶活性的測定方法
4.5.4酶的活化