四環素實驗室檢測方法

㈠ 什麼方法能檢測出牛奶中抗生素的具體含量

牛奶中抗生素殘留的幾種常用檢測方法
隨著奶牛飼養業的發展，抗生素在預防和治療奶牛疾病方面得到廣泛的應用。生鮮牛奶中抗生素的來源主要是：第一，治療泌乳期病牛時使用的抗生素會從奶牛體內移行到乳腺殘留進入牛奶中，資料表明治療後的奶牛，其擠出的牛奶5天內都有抗生素殘留；其二，為了預防奶牛疾病並提高產量，在奶牛飼料中添加抗生素也會造成牛奶中抗生素的殘留；第三，由於牧場管理不善，擠奶、儲奶沒有嚴格的衛生制度和配套的設施，人為添加或造成牛奶抗生素的污染。
牛奶中含有抗生素，不僅對人的健康造成很大的危害，而且對乳品加工企業帶來經濟損失（因無法生成酸奶和乳酪）。因此必須嚴格控制牛奶中抗生素殘留，除了要做好科學飼養、精心管理；正確擠奶和預防疾病外，還要規范抗生素的使用，按國標中有關規定，用葯後的奶牛5天後所產的牛奶才可作為原料乳，並且要檢測其殘留。世界糧農組織（FAO）、世界衛生組織（WHO）、歐盟（EC）及美國的食品和葯品管理局（FDA）等對食品中抗生素最大殘留量都有明確的規定，我國也有鮮奶中抗生素殘留量檢驗標准（GB4689.27—94）。
目前，鮮奶中抗生素殘留的檢測方法大致分為三類：生物測定法（微生物測定法、放射受體測定法）、免疫法（放射免疫法、熒光免疫法、酶聯免疫法）、理化分析法（波譜法、色譜及聯用技術）。下面介紹幾種常用的牛奶中抗生素殘留檢測方法。
TTC法
TTC法是我國鮮奶中抗生素殘留量檢驗標准（GB4689.27—94）的檢測法，屬生物檢測法。其測定原理基於抗生素對微生物的抑製作用。如果牛奶中含有抗生素，則加入菌種（嗜熱鏈球菌）經培育2.5~3小時後,加入TTC指示劑(三苯基四氮唑)不發生還原反應,所以樣品呈無色狀態;如果牛奶中不含抗生素,則樣品呈紅色.這樣實驗後樣品顏色不變的為陽性,樣品染成紅色的為陰性。
TTC法的具體操作步驟:
1.菌液制備:將單菌種(嗜熱鏈球菌)以脫脂乳為培養基,在36±1℃培養箱中培養15小時後,再以脫脂乳以至於1:1稀釋待用;
2.取待檢樣液9mL,在80℃水浴加熱5分鍾後冷卻到37℃以下,加活菌液1mL,在36℃±1℃水浴2小時,加入4%的TTC指示劑0.3mL, 36℃±1℃水浴培養30分鍾;
3.若樣液顏色不變為陽性,呈紅色為陰性;若陽性的樣液,再置於水浴中培養30分鍾,不顯色的為陽性,呈紅色為陰性.
TTC法測定各種抗生素的靈敏度為:青黴素:4ppb,鏈黴素:500ppb,慶大黴素:400ppb,卡那黴素:5000ppb.它具有費用低,易開展的優點;缺點是耗時長，要求操作人員需有一定專業知識且實驗過程中菌液的制備、水浴過程式控制制都要求嚴格遵守操作規程，否則易出現假陽性，以致出現檢驗結果的不穩定性。
Delvotest? sp法（戴爾沃檢測法）
該法最早在香港傳到廣東的，其使用是基於20世紀80年代初香港要求廣東出口的生奶必須「無抗」且要求採用Delvotest法檢測。該方法也是生物測定法，其試劑是由荷蘭DSM公司生產並由AOAC認證。原理是利用微生物—嗜熱芽胞菌在64℃條件下培養2.5～3小時後會產酸,酸引起指示劑BCP(溴甲酚紫)變為黃色;若牛奶樣品中不含抗生素,培養後樣品呈黃色,如樣品中含有抗生素, 嗜熱芽胞菌生長受到抑制而無法產酸,指示劑將不變色.
Delvotest? sp 法的操作步驟:
1.以無菌操作將一片營養葯片夾放入小試管內;
2.用微量移液管將0.1mL牛奶樣品注入小試管內;
3.把小試管放入已預熱至64℃的水浴箱或恆溫器中培養;
4).定時3小時取出觀察顏色變化.如果底部2/3的固體介質是黃色,則為陰性, 如果底部2/3的固體介質是紫色,則為陽性.
Delvotest? sp 法具有廣譜性,可檢測到?-內醯胺類抗生素在內的更多抗生素,如磺胺類、四環素類、大環內酯類、氨基糖苷類、氯黴素等，其中對青黴素和磺胺類抗生素特別靈敏. 其靈敏度為：青黴素:3ppb,鏈黴素:300ppb,慶大黴素:400ppb,卡那黴素:2500ppb。Delvotest? sp 法集操作方便，嚴格實用，容易判斷，結果可靠，費用適中等優點；但也易出現假陽性，實驗證明：當牛奶樣品中添加微生物防腐劑（如乳酸鏈球菌素—Nisn）或樣品中有足夠的洗滌劑殘留時，便可影響嗜熱芽胞菌生長而使實驗為陽性。
Snap?法
該方法是酶聯免疫法，由美國IDEXX公司生產其檢測分析儀及其試劑盒，均獲得AOAC認證，它利用了竟爭酶聯免疫技術。其基本原理是用特異性抗體將固相載體激活，加入含待測抗原的溶液和一定量的酶標記抗原在45℃±5℃共同保溫，使樣品內的抗生素與內置抗生素標志物竟爭與固定的抗體結合，然後進行洗滌和顯色，內置抗生素標志物與固定的抗體結合形成的復合體，通過酶的作用分解可形成有色物質，通過測定色度並與參照物對照，就可以確定結果是陽性或陰性。
Snap?法操作步驟：
1.加入乳樣於樣品管中,搖勻,加熱樣品和檢測板5分鍾;
2.加入乳樣於樣品孔中,當激活圓環開始退卻時,按Snap鍵;
3.反應4分鍾,由Snap?讀數儀讀取並列印結果.檢測讀數小於1.05時判為陰性,大於1.05時判為陽性.
Snap?法是一種將酶化學反應的敏感性和抗原抗體免疫反應的特異性相結合的方法,其敏感性和特異性好,檢測的靈敏度以普遍使用的?-內醯胺類計：青黴素:5ppb,阿莫西林:10ppb,氨苄西林:10ppb,頭孢西林:8ppb.其他抗生素如四環素等的檢測,則需購買相應的試劑來檢測. Snap?法檢測結果快速准確, 9分鍾內即可檢測出牛奶中?-內醯胺類、四環素類、磺胺類等抗生素的殘留含量，且有半定量的讀數，可監控牧場用葯的情況；檢測儀器穩定性良好，結果重現性高，整個檢測過程簡單方便；但需購置專用儀器和試劑，成本較高。
高效液相色譜檢測法
它是一種理化檢測方法,是利用抗生素分子中的基團所具有的特殊反應來測定其含量.檢測的過程採用了氣相色譜理論,通過高壓液相和高靈敏度的檢測器,分離速度快、效率高和操作自動化。一般要經過樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟，能檢測抗生素的具體含量，敏感性較高，但檢測程序復雜，費用較高，需購買色譜儀等檢測設備，不適合小型檢驗室。
傳統的抗生素檢測方法不少,有的操作煩瑣,有的實驗條件要求高,有的檢驗時間太長;這些不僅會給乳製品生產企業造成經濟上和時間上的損失,而且檢測結果常常會被原輔材料和人為操作等因素所影響.鑒於牛奶中抗生素殘留是涉及人類健康的公共衛生問題,乳品企業及牧場應重視和加強檢測工作,應用一些簡單、快速和准確性高的方法來監控產品的質量，保證消費者的健康。
http://szddi.com/foodonline/newsdetail.asp?id=15933

反應原理
本產品主要是利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應的基本原理來進行的。在整個反應當中,樣品中氯黴素含量越多，反應呈色就越淡。反之，樣品中氯黴素含量越少，則呈色越深。
試劑盒組成
1、微量測試孔：每條8孔，每板12條
2、氯黴素標准溶液：
0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35 ppb、4.05 ppb，1.5ml/瓶
3、10倍濃縮萃取稀釋液：一瓶，30ml/瓶
4、10倍濃縮洗滌液：一瓶，30 ml /瓶
5、氯黴素酶標記物： 一瓶，8 ml/瓶
6、底物溶液：一瓶，12 ml/瓶
7、反應終止液：一瓶，13 ml/瓶
使用說明
A、注意事項
1、使用前先將氯黴素標准溶液6瓶，濃縮萃取稀釋液，濃縮洗滌液，酶標記物，底物溶液及微量測試孔條置於室溫下，回溫30分鍾。
2、原倍萃取稀釋液及洗滌液配製
用蒸餾水將10倍濃縮萃取稀釋液及濃縮洗滌液分別以1： 9的比例稀釋(即1mL濃縮液+9mL蒸餾水)，即可作為樣品萃取稀釋液與微孔板清洗液。
3、回溫後，取出所需微量測試孔條，將剩餘板條立即放回鋁箔袋中用膠帶封好，置於4oC保存。
B、樣品制備
1.待測物為生乳，則依以下方法進行處理 (5倍稀釋)
取100ul待測生乳加入400ul萃取稀釋液，振盪混合後備用。
2.待測物為蜂蜜，則依以下方法進行處理
a.取2g蜂蜜、4ml蒸餾水與2ml 乙酸乙酯置入離心管中，震盪約5分鍾，使其充分混合均勻。
b.離心10分鍾(3000rpm)，取0.5ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中，於50℃下氮氣吹乾(溫度請勿超過50oC)。
c.加入0.5ml萃取稀釋液，震盪約10秒鍾後備用。
3. 待測物為血清、則依以下方法進行處理
a.抽取待檢動物血液，離心或靜置取其較透明之上層液(血清層)使用，注意不要有溶血。
b.將3ml血清加入離心管中，再加入6ml乙酸乙酯，震盪混合約30秒。
c.離心10分鍾(3000rpm)，取2ml上層液(乙酸乙酯)至玻璃管中，於50oC下氮氣吹乾。
d.於此玻璃管中加入正己烷2ml，先將殘余物完全溶解後，再加入1 ml萃取稀釋液，震盪約30秒鍾。
e. 離心10分鍾(3000 rpm)，用吸管吸去上層液(正己烷) 及中間乳化層部分，棄掉。再吸取下層液(水層)備用。
f.若有乳化現象，請先將大部分上層液(正己烷)取出後，再將玻璃管置入80oC水中，隔水加熱約5~10分鍾，可改善乳化情形。
4. 待測物為雞肉或魚、蝦，則依以下方法進行處理
a.將3克樣品剪碎後放入50 ml離心管中，再加入6ml乙酸乙酯，並以均質機均質約1分鍾，再震盪約30秒。
b.離心10分鍾(3000rpm)，取2ml上清液(乙酸乙酯)至玻璃管中，於50oC下氮氣吹乾。
c.於此玻璃管中加入正己烷2 ml，先將殘余物完全溶解後(若未能完全溶解，可能會導致回收率降低)，再加入1 ml萃取稀釋液，震盪約30秒鍾。
d.離心10分鍾(3000 rpm)，用吸管吸去上層液(正己烷) 及中間乳化層部分，棄掉。再吸取下層液(水層)備用。
e.若有乳化現象，請先將大部分上層液(正己烷)取出後，再將玻璃管置入80oC水中，隔水加熱約5~10分鍾，可改善乳化情形。待測物為血清、則依以下方法進行處理
5.待測物為內臟(肝、心等)，則依以下方法進行處理(5倍稀釋)
同上述步驟a~d，但下層液吸出後，再以萃取稀釋液稀釋5倍(即下層液50ul加萃取稀釋液200ml)。
6.待測物為飼料，則依以下方法進行處理(10倍稀釋)
同上述步驟a~d，但下層液吸出後，再以萃取稀釋液稀釋10倍(即下層液30ul加萃取稀釋液270ml)。
C、操作步驟
本產品的酶標記物與氯黴素標准溶液均直接使用，無需再稀釋。
1、於適當微孔中分別加入100mL標准溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。
2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前處理的樣品溶液。
3、再於每一微孔中另再加入50mL酶標記物。
4、輕敲盤子四周，使其充分混合後於室溫下避光靜置溫育1小時。
5、將微孔中的反應液甩掉，再將洗液加滿每一微孔後甩掉，重復洗3次。
6、最後一次甩掉後，在吸水紙上拍干。
7、於每一微孔中加入底物溶液100mL後，輕敲盤子四周，使其充分混合。
8、於室溫下避光靜置溫育20分鍾。
9、於每一微孔中加入100mL反應終止液。
10、用酶標儀於波長450nm下判讀。
D、判定
1. 計算B/B0值。用樣品或標准液吸光度值(B)除以零標准吸光度值(B0)再乘以100%。
2. 以B/B0值為縱坐標，以標樣濃度的對數值為橫坐標，做標准半對數曲線。
3. 根據每個樣品的B/B0值就可從曲線上讀出相對應樣品的濃度。
4. 由於樣品經過了預先稀釋，因此根據標准曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數。
E、標准曲線

F、靈敏度
氯黴素試劑檢測盒的平均檢測下限為 0.05ppb，此濃度之吸光值與陰性標准溶液(0ppb)之吸光值有明顯的差異。
G、 特異性
針對以下抗生素進行交叉反應之測試，結果如下：
Chloramphenicol =100%
Chloramphenicol(free base) <0.1%
Gentamycin <0.1%
Tetracycline <0.1%
Penicillin G <0.1%
Sulfamethazine <0.1%
H、再現性
針對氯黴素檢測試劑盒精密度測試，重復6次，所得不同濃度標准溶液的吸光值變異系數(%CV)如圖2所示，顯示氯黴素試劑盒有很高的再現性:

I、回收率
生乳(添加1.0ppb)104~117%
蜂蜜(添加0.3ppb)90~110%
蝦及魚肉(添加0.5ppb)95~110%
雞肉(添加0.5ppb) 90~120%
血清(添加0.5ppb)100~120%
內臟(添加1.0ppb) 100~120%
飼料(添加2.0ppb)80~110%

氯黴素檢測試劑盒
簡介
氯黴素(Chloramphenicol)是一種廣譜抗生素。由於其具有效果好以及價格低廉等優點，目前已被普遍應用於各類家禽、家畜、水產品及蜂製品的各種傳染性疾病的治療。然而氯黴素有其嚴重的副作用,它會抑制人體骨髓的造血功能，從而引起再生障礙性貧血和粒細胞缺乏症。目前，我國已禁止其使用。
我公司採用國內外先進的工藝與技術，研發出氯黴素ELISA檢測試劑盒，簡化了樣品處理方式，使用簡便，省時省力省錢，整個操作過程不到90分鍾。本產品檢測范圍廣(雞肉、魚、蝦、蟹、牛奶、血清、肌肉、組織、飼料與蜂蜜等)，回收率為80%－120%，靈敏度可達到0.05ppb，是各類企業及各級政府檢測機構的理想產品。
簡單
1． 樣品提取方便快捷。
2． 90分鍾得到結果。
3． 只需基本的實驗室設備。
4． 操作人員只需最基本的實驗知識。
准確
1． 結果重現性高。
2． 精確至0.05ppb。
3． 與其它抗體的交叉反應率極低。
技術支持
我們為用戶提供最方便、快捷、周到的服務。
產品規格
包裝：每包96孔
靈敏度: 0.05ppb
測試區間：0.05ppb－4.05ppb
檢測時間：80分鍾(提取後)
儲存條件：2-8℃

㈡ 什麼是支原體和衣原體

支原體（mycoplast）：又稱霉形體，為目前發現的最小的最簡單的細胞，也是唯一一種沒有細胞壁的原核細胞。支原體細胞中唯一可見的細胞器是核糖體。 支原體是在1898年發現的，是一種簡單的原核細胞。其大小介於細菌和病毒之間。結構也比較簡單，多數成球形，沒有細胞壁，只有三層結構的細胞膜，故具有較大的...可變性。支原體可以在特殊的培養基上接種生長，用此法配合臨床進行診斷。與泌尿生殖道感染有關的主要是分解尿素支原體和人型支原體兩種，約有20－30％的非淋菌性尿道炎的病人，是由以上兩種支原體引起的，是非淋菌性尿道炎及宮頸炎的第二大致病菌。在成年人的泌尿生殖道中分解尿素支原體和人型支原體感染率主要與性活動有關，也就是說，與性交次數的多少、性交對象的數量有關，不管男女兩性都是如此。據統計女性的支原體感染率更高些，說明女性的生殖道比男性生殖道更易生長支原體。另外，分解尿素支原體的感染率要比人型支原體的感染率為高。 支原體是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態。它不同於細胞，也不同於病毒。支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細胞培養中生長，營養要求比細菌高。支原體的種類繁多、分布廣泛、造成的危害相當大，涉及人、動物、植物及昆蟲等多個領域，給人類健康和科研工作帶來不利影響。

㈢ 抗生素檢測的主要方法

由於抗生素在廢水中的濃度相對較低，所以抗生素的檢測一般都是微量或是痕量分析，常採用具有高靈敏度的儀器進行檢測。各研究機構對畜禽廢水中抗生素的檢測技術主要有色譜法和其聯用技術、酶免疫分析法、毛細管電泳法等。 液相色譜法（LC）在廢水抗生素的檢測中是最常見的，LC具有分離效能好，檢測速度快且重現性好的特點。LC法所用的檢測器有紫外檢測器(UV)，熒光檢測器，以及二級管陣列檢測器。
高效液相色譜-紫外檢測器
高效液相色譜-紫外檢測器聯用檢測技術是最早用於環境中抗生素的分離檢測，由於其操作簡便以及成本低，被用於畜禽廢水中抗生素的檢測。
液相色譜-熒光檢測器
液相色譜-熒光檢測器因為其檢測限低所以也被用於畜禽廢水中抗生素的檢測，通常對本身具有熒光性的抗生素液相色譜-熒光檢測器可以直接檢測出，但是對於本身不具有熒光性或熒光性差的抗生素，需要對其衍生化來提高目標物的熒光特性以便檢測。
液相色譜串聯質譜技術
色譜可以用於多組分混合物的分離和分析，可以對有機化合物進行定量分析，但是定性較困難，質譜儀能夠對單一組分提供高靈敏度和特徵的質譜圖，但對復雜化合物無分析能力。所以將色譜與質譜進行聯用（或是串聯質譜），對復雜化合物中微量和痕量組分的定性和定量分析具有重要的意義。
由於畜禽廢水中有多種類的抗生素同時存在，利用色譜和質譜的聯用技術可以提高抗生素的定性、定量分析的可靠性、准確性、靈敏度。 酶免疫分析方法具有操作簡單，前處理簡化，分析成本低、靈敏、特異性強、檢測快速，不需要昂貴的儀器等，而且可以同時測定幾個樣品，但是酶免疫分析方法對試劑的選擇性高，很難同時分析多種成分，對結構類似的化合物有一定程度的交叉，分析分子量很小的化合物和不穩定的化合物有一定的困難。
用酶免疫分析方法試劑盒檢測地表水、地下水中的四環素和泰勒菌素，檢測分別為0.05μg/L,0.1μg/L。其結果表明，該方法成本低、檢測快，可用於水中的四環素、氯四環素、泰勒菌素的初篩檢測。 經典的放射免疫測定基本原理和酶免疫分析是相同的，但所不同的是反應的放大指示系統不是酶和底物，而是放射性同位素。用於抗原或抗體標記的同位素通常是放射性較小的β放射原，最常用的是同位素是3H和14C，放射性不強、用量也極微小，比較安全。