單核苷酸突變的檢測方法

A. 在醫學遺傳學中常用什麼方法檢測基因突變

SNP檢測，
樓上答的挺多一看就是網上摘的，但有點錯誤，我更正和補充一下。 主觀填空題 1.干係 2.基因組DNA 3.遺傳物質 4.染色體（或DNA）復制一次 5.交叉遺傳 6.細胞癌基因 7.點突變 8.完全顯性遺傳 9.羅伯遜易位 10.重排 四、名詞解釋 聚合酶鏈式反應(PC...
11多重PCR 12正確 13正確 14正確 15正確 16正確 17錯誤 18正確 19正確 20錯誤
1.減數分裂是指生殖細胞成熟過程中(DNA復制一次 )後，細胞連續分裂二次。 2.發生於近端著絲粒染色體間的易位稱為(著絲粒融合 )。 3.在一個腫瘤細胞群體中，佔主導地位的克隆就構成其(干係 ) 4.結構異常是指由於染色體斷裂、重接後，形成結構改變...
醫學遺傳學英文名稱：medical genetics定義：應用遺傳學的理論與方法研究遺傳因素在疾病的發生、流行、診斷、預防、治療和遺傳咨詢等中的作用機制及其規律的遺傳學分支學科。 遺傳學在醫學中的應用，包括，生理、病理和葯理的遺傳學分析。遺傳學...
遺傳學是研究生物的遺傳和變異，即研究親子間的異同的生物學分支學科。 遺傳學的研究范圍包括遺傳物質的本質、遺傳物質的傳遞和遺傳信息的實現三個方面。遺傳物質的本質包括它的化學本質、它所包含的遺傳信息、它的結構、組織和變化等；遺傳物質...

B. snp檢測是什麼原理

SNP基因分型技術原理。

首先通過PCR擴增含有SNP的基因組片段，然後通過序列特異性引物實現單鹼基延伸，隨後樣品分析物與晶元基質共結晶後在真空管中受瞬時納秒 (10-9s) 強激光激發。

核酸分子因此解吸附成為單電荷離子，由於電場中離子飛行時間與離子質量成反比，通過檢測核酸分子在真空管中的飛行時間而獲得樣品分析物的精確分子量，從而檢測出SNP位點信息。

(2)單核苷酸突變的檢測方法擴展閱讀

特點：

時間飛行質譜（MALDI-TOF）完成的SNP檢測准確率可達99.9%，除了准確性高、靈活性強、通量大、檢測周期短等優勢外，最有吸引力的應該還是它的性價比。

飛行時間質譜平台（MALDI-TOF）是國際通用的基因單核苷酸多態性（SNP）的研究平台，該方法憑借其科學性和准確性已經成為該領域的新標准。

C. 核酸檢測的檢測方式 怎麼才能檢測出來

1、核酸序列依賴性擴增法，NASBA是由一對引物介導的、連續均一的、體外特異性核苷酸序列等溫擴增RNA的新技術。反應在 42 ℃進行 ,可在2h內將RNA模板擴增約109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆轉錄酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物進行擴增。整個反應分非循環相和循環相:在非循環相中,引物I與模板RNA退火後在AMV逆轉錄酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA雜合體,隨即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ與cDNA 退火, 在反轉錄酶作用下合成第2條DNA互補鏈。雙鏈DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,經其啟動子序列起動而轉錄RNA，RNA又可在反轉錄酶的作用下反轉錄成DNA，進入循環相,對模板進行大量擴增。

2、轉錄介導的擴增技術，TMA技術原理與NASBA基本一致，略有不同之處是TMA利用的是MMLV逆轉錄酶及T7 RNA聚合酶兩種酶，MMLV逆轉錄酶既有逆轉錄酶的活性又具有RNA酶H活性。反應在41.5 ℃進行,可在1h內將RNA模板擴增約109倍。

3、連接酶酶促鏈式反應(LCR)，LCR是基於靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種探針擴增技術，是繼PCR後新發展的一種較有前景的體外擴增技術。它的原理就是由2段寡核苷酸單鏈DNA探針與目標序列雜交,當該2段DNA探針與沒有發生突變的模板褪火後,如果2探針是緊鄰的,中間沒有核苷酸間隔,則可在連接酶作用下連接起來,連接以後的新鏈又可以作為模板,引導下一周期的連接產生新的子鏈。若連接區段發生核苷酸的鹼基突變,則連接反應不能發生,擴增反應終止。

D. MSI 檢測方法概述

微衛星（ Microsatellite ）序列是遍布於人類基因組上數百萬個基因座（ loci ）中的短串聯重復（ short tandem repeats ， STR ）序列。

通常由 1-6 個重復（如單核苷酸、雙核苷酸重復等）的鹼基串聯重復排列 10-50 次。

微衛星不穩定（ MSI/MSI-H ），由於在 DNA 復制時錯配修復 ( MMR ) 基因的功能缺陷，導致串聯序列發生插入和缺失突變，引起 MS 序列長度改變的現象。

這種類型的體細胞突變會導致抑癌基因失活或破壞其他非編碼調控序列，從而起到致癌作用。

MSI 作為可作為一種獨特的分子表型，存在於多種癌症中，包括結直腸癌，子宮內膜癌，胃癌，前列腺癌，卵巢癌和成膠質細胞瘤等。

並且 MSI 能夠預測免疫檢查點封鎖療法在實體瘤中的療效。因此，檢測 MSI 狀態在腫瘤臨床診斷和預後治療上具有重要意義

目前， MSI 檢測方法主要有三種：

IHC 方法使用相應的抗體，通過對 4 種 DNA 錯配修復蛋白（ MLH1 ， PMS2 ， MSH2 ， MSH6 ）在細胞核內的表達情況，來確定細胞內是否存在錯配修復功能缺陷。

如果其中任何一個蛋白出現表達缺失，則會被判定為錯配修復缺陷（ dMMR ），相當於 MSI-H ；如果四個蛋白全部表達，則判斷為錯配修復功能正常（ pMMR ），即 MSI-L 或 MSS 。

其優勢在於應用性廣泛，並且能確定哪些 MMR 蛋白在腫瘤中細胞中表達缺失。

但是， IHC 本身存在主觀性，同時受抗體質量和實驗因素等影響，有時無法檢出某些定性蛋白的變化，導致 MMR 結果偶有報錯。

主要採用多重熒光 PCR 結合毛細管電泳的方法，通過 PCR 擴增特定的微衛星序列，然後通過毛細管電泳比較腫瘤組織與正常組織微衛星序列長度的差異來判斷該位點是否存在 MSI 現象。

這種檢測方法是公認的 MSI 檢測的金標准，也是使用最廣泛的方法。

最開始使用的是 National Cancer Institute （ NCI ）推薦的 5 個位點：

通過如下方式來判斷結直腸癌的 MSI 狀態：

有研究表明， MSS 和 MSI-L 之間沒有明顯的腫瘤生物學特徵差異，因此，臨床上將 MSI-L 也歸類為 MSS 。

後來有研究指出，二核苷酸重復較單核苷酸重復的位點敏感性更低，且存在高度的個體多態性，需要配對的腫瘤和正常樣本對照才能得出結果。因此，降低了檢測的靈敏度。

因此，有人提出 pentaplex panel ，包含五個單核苷酸重復的位點：

無需配對正常的樣本，且性能更高，但是在 MSH6 缺陷型腫瘤中性能不高

目前使用更多的是 Promega 系統，包含：

PCR 檢測方法不僅彌補了 IHC 在因非截斷式錯義突變導致的 MSI 無法檢出的漏洞，同時還具備良好的可重復性。

但是，其檢測的基因（ panel ）的位點較少、通量較低、無法提供具體的基因突變信息，而且實驗周期較長。

隨著高通量測序技術的發展，使用全基因組測序（ WGS ）、全外顯子測序（ WES ）或靶向基因測序（ TGS ）進行 MSI 檢測的已經越來越普遍了。

與 PCR 相比， NGS 方法通量大，涉及基因范圍廣、靈敏度和特異性更高，可與靶點的突變檢測、腫瘤突變負荷( TMB )等檢測共用一份測序數據。

在目前已發表的 NGS 方法中，一般都是以 PCR 檢測結果作為金標准，通過比較二者結果一致性作為評價 NGS 檢測性能的標准。

NGS 檢測方法種類繁多，且大多數需要配對正常樣本，我們可以將這些方法分為兩大類

在這里，可能需要講解一下何為 repeat count

在上面的圖中，我們假設微衛星位點為 10 個連續的 A ，且該位點比對上了 10 條 reads ，每條 read 比對上的長度長短不一。由此，我們可以計算出 repeat count

repeat 為所有 reads 的長度， count 為各長度對應的 reads 支持數

其分析流程與原理大致可以用如下流程圖來描述

包括 MSIsensor 、 mSINGs 、 MANTIS 、 Cortes-Ciriano 、 MSI-ColonCore 等

其分析流程與上面類似

包括 MSIseq Index 、 MSIseq/NGS classifier 、 Nowak 等

MSIsensor 是通過 MS 位點兩端各 5bp 的側翼序列來定位的，演算法原理為

mSINGs 方法也是通過計算每個位點的不穩定性，並以不穩定位點的比例作為樣本的 score 值，大於閾值的認為是不穩定狀態。

MANTIS 也是根據腫瘤及其配對正常樣本的 repeat count 的分布計算樣本的不穩定狀態。

它將每個位點在樣本中的 repeat count 分布看成是一個向量，通過對這兩個向量計算歐氏距離、餘弦相似度等度量分數，並將所有位點的均值作為樣本的不穩定分數。

具體計算方式如下：

可以看到，該方法進行了比較嚴格的質控

該方法是基於 RNA-seq 數據，通過計算兩個指標的比值 PI/PD ，如果該比值小於 0.9 則認為該樣本為 MSI

其中， PI 表示微衛星位點區域發生插入突變占所有插入突變的比例， PD 表示微衛星位點區域發生缺失突變占所有缺失突變的比例。

該方法通過計算樣本中單核苷酸替換率和小片段的鹼基插入刪失率等突變信息構建特徵，然後應用機器學習演算法構建分類器。

具體的特徵包括：

該方法使用的是 WES 數據，且選擇了線性回歸，決策樹，隨機森林和樸素貝葉斯四種演算法。其中最優的演算法是決策樹，該方法不需要配對的正常樣本。

from： 生信學習手冊

E. dna點突變常用的檢測方法有哪些

基因突變檢測方法：
（1） PCR-SSCP法是在非這性聚丙烯醯胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同構象，一個鹼基的改變將影響其構象而導致其在凝膠上的移動速度改變。其基本原理為單鏈DNA在中性條件下會形成二級結構，這種二級結構依賴於其鹼基組成，即使一個鹼基的不同，也會形成不同的二級結構而出刺同的遷移率。由於該法簡單快速，因而被廣泛用於未知基因突變的檢測。
（2）異源雙鏈分析法（HA） HA法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由於突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成一突起，在非變性凝膠中電泳時，會產生與相應的同源雙DNA不同的遷移率。該法與SSCP相似，所不同的是SSCP分離的是單鏈DNA，HA法分離的是雙鏈DNA，也只適合於小片段的分析。
（3）突變體富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某個密碼子部位存在已知的限制性內切酶位點，如K-ras基因第12密碼子的BstNI位點，第13密古巴子有BgⅠⅡ位點。用鏈續二次的巢式PCR來擴增包括K-ras第12、13密碼子的DNA片段，在兩次擴增反應之間用相應的內切酶消化擴增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進入第二次PCR擴增，而突變型則能完整進入第二次PCR擴增並得到產物的富集。

F. 常用的基因突變檢測方法有哪些

1、焦磷酸測序法

測序法的基本原理是雙脫氧終止法，是進行基因突變檢測的可靠方法，也是使用最多的方法。

但其過程繁瑣、耗時長，靈敏度不高，對環境和操作者有危害，故在臨床應用中存在一定的限制。

焦磷酸測序法適於對已知的短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美，而速度卻大大的提高。

焦磷酸測序技術產品具備同時對大量樣品進行測序分析的能力。

為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態性研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平台。

2、微數字聚合酶鏈反應

該方法為將樣品作大倍數稀釋和細分，直至每個細分試樣中所含有的待測分子數不超過1個，再將每個細分試樣同時在相同條件下聚合酶鏈反應後，通過基因晶元逐個計數。

該方法為絕對定量的方法。

3、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析技術

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。

該法一般用於檢測已知的突變位點。

因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。

這也是「微量證據」的威力之所在。

由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。

到如今2013年，PCR已發展到第三代技術。

1976年，台灣科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。

PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右）。

DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。

基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

4、高效液相色譜法

該方法是基於發生錯配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特徵的差異而進行檢測的，可檢測出含有單個鹼基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段。

與測序法相比，該法簡單、快速，不僅可用於已知突變的檢測，還可用於未知突變的掃描。

但只能檢查有無突變，不能檢測出突變類型，結果判斷容易出錯。

5、單鏈構象異構多態分析技術

依據單鏈DNA在某一種非變性環境中具有其特定的第二構象，構象不同導致電泳的遷移率不同，從而將正常鏈與突變鏈分離出來。

與測序法相比，靈敏性更高。

G. 什麼是SNP、SNV（單核苷酸位點變異）

單核苷酸多態性，SNP或單核苷酸位點變異SNV。個體間基因組DNA序列同一位置單個核苷酸變異（替代、插入或缺失）所引起的多態性。

人基因組上平均約每1000個核苷酸即可能出現1個單核苷酸多態性的變化，其中有些單核苷酸多態性可能與疾病有關，但可能大多數與疾病無關。

單核苷酸多態性是研究人類家族和動植物品系遺傳變異的重要依據。在研究癌症基因組變異時，相對於正常組織，癌症中特異的單核苷酸變異是一種體細胞突變，稱做SNV。

SNP在基因組內的形式

一是遍布於基因組的大量單鹼基變異；

二是分布在基因編碼區（codingregion），稱其為cSNP，屬功能性突變。

SNP在單個基因或整個基因組的分布是不均勻的：

（1）非轉錄序列要多於轉錄序列

（2）在轉錄區非同義突變的頻率，比其他方式突變的頻率低得多。

以上內容參考：網路-單核苷酸多態性