轉錄因子erg檢測方法

1. 氧化應激指標的常用檢測方法

氧化應激的定量評價方法大致分做三類：

1）測定由活性氧修飾的化合物；

2）測定活性氧消除系統酶和抗氧化物質的量；

3）測定含有轉錄因子的氧化應激指示物。

進一步尚有：

1）生物體內氧化應激的程度足以產生應答；

2）活體內難以蓄積；

3）在活體內不是被代謝，而是穩定存在，等等。理解這些要點對於臨床普及推廣都很有用。

但在臨床上，氧化應激的定量仍舊存在問題。因氧化應激與各種各樣疾病均密切相關，故缺乏特異性，其量化指標難以用於特別指定的疾病。所以目前認為，當用於「全身評價」，或者在已經明確疾病原因為氧化應激後的「嚴重程度及予後」的評價。

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抗氧化是預防衰老的重要步驟，因為自由基或氧化劑會將細胞和組織分解，影響代謝功能，並會引起不同的健康問題。如果能夠消除過多的氧化自由基，對於許多自由基引起的及老化相關疾病都能夠預防。例如常見的糖尿病、白內障、心血管病、老年痴獃等疾病都被認為與自由基相關。

抗氧化劑能在自然飲食中找到，是被稱為三大抗氧化物質的維生素E、維生素C、和β-胡蘿卜素。他們可以利用自身結構的特性來穩定自由基多餘的電子，防止對細胞造成老化。豆類富含大量的膳食纖維和抗氧化劑，其中紅豆和黑豆抗氧化劑最多。蘋果中含有多種基本維生素和強抗氧化劑。

2. 轉錄因子的研究思路

轉錄因子（Transcriptionfactor，TF)是一種能與特異DNA序列結合的蛋白，可以單獨或與其他蛋白形成復合體，提高或阻斷特定基因對RNA聚合酶的招募，調控基因的表達。轉錄因子的特點是它包含一個或多個DNA結合域（DNA-binding domain，DBDs），通過這些結合域與基因附近的DNA序列結合，從而完成調控。下面結合文章介紹轉錄因子的研究方法。

01   案例文章簡介

案例文章 ：

Ahr-Foxp3-RORt axis controls gut homing of CD4+T cells by regulating GPR15. Sci Immunol. 2020, 5(48). （IF=13.44）

GPR15是一種趨化因子受體，在T細胞向大腸歸巢的過程中發揮重要作用。這項研究發現小鼠大腸Treg中的GPR15表達水平最高，芳香烴受體（Ahr）可通過增加GPR15的表達促進Treg向大腸的歸巢，而Foxp3及RORγt在Ahr介導的GPR15表達上調中分別起到正向及負向調控作用。另外，在人結腸Treg中也可重復上述發現。該研究提示，Ahr-Foxp3-RORγt軸可通過調控GPR15的表達調節Treg的腸道歸巢，從而影響腸道免疫穩態。

02   案例文章的研究內容

GPR15在小鼠大腸Treg中表達量最高，並且受Ahr控制。GPR15是一種孤兒鳥嘌呤核苷酸結合蛋白（G蛋白）偶聯趨化劑受體（GPCR），最初是基於其與其它GPCR家族成員的相似性而被發現的，也被稱為HIV或猿猴免疫缺陷病毒共受體。最近有研究表明，GPR15對小鼠和人的調節性T細胞（Treg）和效應T細胞（Teff）的腸道歸巢至關重要。芳香烴受體（Ahr）是一種環境感測器，可檢測外源性配體，如環境毒素（如二惡英），以及宿主細胞、微生物群和飲食（如色氨酸代謝物）產生的內源性配體。通過流式細胞術檢測GPR15蛋白在各種T細胞中的表達水平，發現Treg中GPR15的表達水平最高。在Ahr缺陷小鼠的CD4+ T細胞中，GPR15的表達水平降低。而在在Ahr過量表達小鼠的CD4+ T細胞中，GPR15的表達水平升高。

Ahr通過直接與Gpr15基因座結合調節GPR15表達。利用ChIP-seq在iTreg 和TH17細胞中發現Gpr15基因是Ahr最重要的全基因組靶點之一。Ahr在Gpr15基因座具有兩個實質性的結合峰（在距轉錄起始點+15和+17 kb處）。

Foxp3與Ahr協同作用，正調節GPR15的表達。在CD4+ T 細胞中用shRNA干擾Foxp3，GPR15的表達水平降低。在來自Ahr+/+小鼠的iTregs細胞中強製表達Foxp3可顯著提高其GPR15的表達，在來自Ahr-/-（Ahr缺陷）小鼠的iTregs細胞中卻沒有這種效果。在TH0條件下培養的分選CD4+T細胞中同時表達Ahr和WT Foxp3或Foxp3△FKH可以增加GPR15的表達，而Foxp3單獨表達並不影響GPR15的表達。ChIP-qPCR表明Foxp3在Gpr15基因座的結合位點與Ahr相同（距轉錄起始點+15和+17 kb處）。Ahr缺陷不影響Foxp3在Gpr15位點的結合，但是在iTreg中敲低Foxp3後，Ahr向Gpr15基因座的招募減少。

RORγt負向調節GPR15表達。在RORγt缺陷Treg中，GPR15的表達增加。RORγt和GPR15表達的負相關系在Ahr充足和Ahr缺陷Treg中都很明顯。此外，與來自RORγt充足的CD4+ T細胞分化的iTregs和TH17細胞相比，來自RORγt缺陷的CD4+ T細胞具有更高的GPR15表達。

RORγt拮抗Ahr在Gpr15基因座的DNA結合。在從RORγt缺陷小鼠分化的iTregs或TH17細胞中，Gpr15基因座的Ahr募集顯著增強，而在沒有Ahr的情況下，Gpr15基因座的RORγt結合顯著增加，提示Ahr和RORγt與Gpr15基因座結合存在競爭。此外在RORγt缺陷iTregs中表達RORγt抑制GPR15表達。

Ahr通過調節GPR15促進Tregs向腸道歸巢。在大腸（LI）和小腸（SI）中，歸巢的Ahr缺陷iTreg相對於WT對照組減少了大約三倍。GPR15的強製表達顯著增強了Ahr缺陷Treg向LI的歸巢，但不增強到包括SI在內的其他器官的歸巢，這與GPR15在Treg大腸歸巢中的關鍵作用一致。此外， 在LI中WT-iTreg和GPR15恢復表達的Ahr缺陷iTreg的歸巢能力相當（而不是在SI中），這表明GPR15在Ahr缺陷iTregs中的表達受損是其向LI歸巢缺陷主要機制。在Ahr缺陷的iTregs中強製表達GPR15促進其在炎症期間歸巢至LI。此外，強製表達GPR15的Ahr缺陷iTreg的過繼性轉移顯著抑制了腸道炎症，表現為減輕了腸道組織學變化和降低了促炎細胞因子（即Tnf和Il1b）的表達。

Ahr信號促進GPR15在人Treg中表達。與之前的報告顯示GPR15在人類Treg中的低表達不同，本研究檢測到GPR15在所有患者樣本中的表達。與外周血單個核細胞（PBMCs）相比，結腸Treg的 GPR15表達顯著增高。人Treg中Ahr mRNA表達的增加與Gpr15表達的增加以及其他Ahr靶基因（Cyp1a1和Ahrr）的表達增加有關，這與Ahr促進Gpr15表達的作用相一致。此外，通過蛋白質染色分析GPR15和Foxp3的表達，發現Foxp3的表達與人CD127-CD25+ T細胞中GPR15的表達呈正相關。加入Ahr的配體FICZ顯著增強了iTreg中GPR15和其他Ahr靶基因的表達，但不增強Ahr的表達，而用一種特異性Ahr拮抗劑CH223191治療可消除人iTregs中GPR15的表達。

03   轉錄因子研究的技術手段

❶  雙熒光素酶實驗

某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現非共價結合，從而對基因的表達起增強或抑制的作用。雙螢光素酶報告實驗（al luciferase assay）是檢測轉錄因子和靶啟動子中的特異順序結合的重要手段，通過檢測轉錄因子表達水平的改變對熒光素酶基因表達水平的影響，分析轉錄因子能否作用於啟動子。

其原理簡述如下 ：

（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到螢光素酶編碼序列上游的報告基因質粒，如pGL3-basic等。

（2） 將要檢測的轉錄因子的表達質粒、干擾質粒或者siRNA與報告基因質粒共轉染293細胞或其它相關的細胞系。通常會用另一種螢光素酶作為內參，避免轉染效率對實驗結果的影響。

（3） 加入特定的螢光素酶底物，螢光素酶與底物反應，發光，通過檢測發光強度可以測定螢光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與靶啟動子片段有作用。

❷  染色質免疫共沉澱

染色質免疫沉澱技術 (chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)被廣泛用於研究體內轉錄因子與靶基因啟動子上特異性核苷酸序列的結合，並已成為研究染色質水平基因表達調控的最有效的方法。ChIP的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白-DNA復合物，並將其隨機切斷為一定長度的染色質小片段，然後通過免疫學方法沉澱此復合體，特異性地富集目的蛋白結合的 DNA 片段。通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。通過qPCR或二代測序，篩選與目的蛋白互作的DNA信息。ChIP-PCR用於鑒定轉錄因子結合到靶基因的啟動子上，而ChIP-seq用於篩選轉錄因子直接結合的靶基因，探究轉錄因子的作用元件。

❸  電泳遷移率改變試驗

電泳遷移率改變試驗 (electrophoretic mobility shift assay，EMSA ) 也稱凝膠阻滯試驗，DNA 在凝膠中的遷移率與相對分子質量及構型有關。裸露DNA與含有結合蛋白的DNA- 蛋白質復合物電泳時，裸露 DNA 遷移率主要取決於DNA本身，DNA-蛋白質復合物由於體積較大而滯留在較後位置。電泳遷移率改變試驗用於體外分析轉錄因子與靶基因啟動子的結合。將一系列序列不同的DNA片段與轉錄因子進行電泳遷移率改變試驗，可以探究轉錄因子的體外結合序列。

3. 鑒定轉錄因子與啟動子結合的方法和原理

一般有體外和體內兩種較為常用的方法：
體外：用EMSA
通常將純化的蛋白和32P同位素標記的DNA探針（取promoter部分）一同保溫,在非變性的聚丙烯凝膠電泳上,分離復合物和非結合的探針.DNA-復合物比非結合的探針移動得慢.然後再放射自顯影的儀器上就可以看到條帶,如果條帶移動得慢,就是有結合.
體內：報告基因方法
就是將你想要檢測的promoter裝在一個載體上,然後導入特定的細胞內.該細胞內有表達或者過表達你所想檢測的轉錄因子.如果轉錄因子可以結合在你的promoter上,就可以啟動下游的報告基因表達.報告基因可以是熒光蛋白,也可以是熒光素酶.
註：promoter--啟動子.其實enhancer也可以用來當promoter.

4. 如何檢測轉錄因子與啟動子的結合能力

查詢某一基因的啟動子區有無某轉錄因子的結合位點可嘗試用缺失分析，應先用Matinspector 預測有無轉錄因子結合位點的存在，然後將啟動子區域克隆，構建一系列區域突變克隆，與基因編碼轉錄因子的基因共表達，檢測報告基因的表達，來判斷轉錄因子同一個基因的啟動子都是可長可短的，只是不同長度可能啟動子的活性不一樣。真核生物一般都是認為在第一外顯子上游的2kb以內（也有2kb以外的）。轉錄因子不同的預測方法（除了PROMO，還可用Jaspar 、TFSEARCH、TRANSFAC等資料庫）結果都不一樣，最終只有實驗驗證的才准確。

5. 如何確定某個基因是否為轉錄因子

如果此轉錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，從而對基因的表達起抑制或增強的作用，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性：（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒，熒光素酶與底物反應，如pGL3-basic等。（3） 加入特定的熒光素酶底物轉錄因子是一種具有特殊結構，也稱為反式作用因子。熒光素酶報告基因實驗（luciferase assay）是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段，這些特異性的序列被稱為順式作用元件、行使調控基因表達功能的蛋白質分子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合。（2） 將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染293細胞或其它相關的細胞系，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現共價結合。其原理簡述如下，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比，產生熒光

6. 轉錄因子實驗研究方法有哪些

1.什麼是轉錄因子

轉錄因子（Transcription factor，TF）的調控決定著基因的調控網路以及表達水平。基因的表達驅動著一系列的細胞活動，這些表達的調控需要通過轉錄因子（蛋白）和轉錄因子結合位點（DNA元件）的相互作用實現。轉錄水平的調控不是一個簡單的獨立過程，它是由上百個轉錄因子，目標序列以及共調控因子所組成的高度互作的基因調控網路。

2.為什麼研究轉錄因子

一個課題最開始往往是研究某個基因的序列信息以及基因所行駛的功能作用，這些是屬於基因的下游研究。但在下游研究累積到一定經驗之後，老師往往開始著手於研究基因的上游調控機理，即不單關注基因A如何影響細胞活動，更關注哪些因素影響基因A的功能發揮。調控機理研究理論上會涉及多個層面的因素，例如：轉錄因子、蛋白激酶、miRNA、DNA甲基化、組蛋白修飾、lncRNA……

轉錄因子成為調控機理的研究大戶是最正常不過的事情。因為一個轉錄因子能同時控制多個基因的表達，同時轉錄因子的功能作用也可能受多個共作用因子的影響。如果能闡明如此復雜的調控網路，這可是很有科研成就感的。

3.研究方法

現有主流的轉錄因子鑒別方法可分為兩種：傳統實驗鑒別（experimental methods）以及通過計算機進行的生物信息學鑒別（computational methods）。簡單來說，實驗方法主要用於尋找不同類型目標，即通過已知TF尋找未知TFBS，或通過已知TFBS找出其對應TF。而生物信息學方法更多是用於同類型的預測，即通過序列保守性分析，通過已知TF預測未知TF，或通過已知TFBS預測未知TFBS。這些研究思路的關系如圖1.

圖1. 轉錄因子研究方式

3.1生物信息學預測（computational methods）

無論是TF還是TFBS的同類預測，生物信息的研究手段主要依賴於蛋白質或者DNA的序列保守性進行。具體演算法和軟體有隱馬爾可夫模型,Gibbs抽樣,貪婪演算法等，但這次重點在於介紹研究轉錄因子的實驗方法，因此不過於敘述這部分信息。

3.2實驗方法篩選（experimentalmethods）

實驗方法主要有兩種思路：1. 通過已知TF尋找未知TFBS；2.通過已知TFBS尋找未知TF。無論哪種手段，前提都是基於蛋白與DNA之間的結合關系尋找，即交叉尋找目標，這有別於計算機技術的同類型尋找。

3.2.1通過已知TF尋找未知TFBS

如果已經鎖定了一個感興趣的TF，那常用思路是確定其TFBS，然後得知道它控制的下游基因。從已知TF定位到未知TFBS的過程，主要的實驗方法包括ChIP-seq、DNaseI-seq、DamID-seq等體內實驗，以及DIP-seq、SELEX(-seq)、PBM等體外實驗。

這些研究的通量與應用范圍如圖2所示，其中，縱坐標表示可以從多大范圍檢測TFBS（檢測通量），橫坐標表示TF-TFBS的結合細節（檢測精細程度）。以ChIP-seq為例，它可以在全基因組水平一次發現超過20萬個結合位點信息，但只能確定到TFBS的序列信息（是ATTCG還是ACTCG），卻難以了解到目標TF與TFBS之間的結合程度（TFBS能與TF結合多久，結合多牢固等信息）。

圖2.多種轉錄因子研究方法的比較。 （CS：ConsensusSite，PWM: Position WeightMatrices）

3.2.1.1SELEX技術

Systematicevolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) 是其中最早的一種體外檢測轉錄因子結合位點技術，這項技術在20多年前已被科學家們利用，而且它不需要已知序列信息就可以檢測到新的結合位點。它的原理是（圖3a)：1.提取並純化轉錄因子；2.隨機打斷的DNA文庫與目標轉錄因子孵育；3.提取與TF結合的DNA，進一步PCR擴增片段；4.把PCR擴增的片段重復與TF孵育，最終篩選出高結合率的DNA。SELEX技術不需要已知的DNA片段信息就可以檢測新TFBS，但不足之處在於它只能找出結合率高的TFBS，因此鑒定效率較低。

為了解決鑒定效率較低的問題，高通量測序技術可以聯合SELEX篩選TFBS。關聯高通量技術後，SELEX-seq只需要一輪篩選而不像之前需要多輪篩選，但它的問題在需要大量的高質量純化蛋白以及前期實驗操作復雜。

3.2.1.2Protein-binding Microarrays （PBM）技術

PBM技術（圖3b）首先固定雙鏈dna列陣在晶元當中，然後加入感興趣的目標蛋白，孵育洗脫非結合蛋白後，加入帶有熒游標記的抗體靶向目標蛋白，最後通過熒光信號鑒別蛋白-DNA結合關系。熒光強度會最終換算為PositionWeight Matrices（PWM），從而計算DNA的結合序列。

3.2.1.3DIP-seq

DIP-seq（圖3c）是另外一種體外檢測轉錄因子與dna關系的技術。與PBM不同，這種技術不需要預先固定DNA，它是通過檢測染色質DNA來實現目標鑒定。大體的實驗流程可分為：1.利用甲醛交聯轉錄因子與DNA片段；2.切斷DNA為100到500bp的片段；3.通過轉錄因子特異性抗體，富集與TF結合的DNA；4.去交聯後，富集DNA進行晶元或高通量測序。

3.2.1.4ChIP-seq

ChIP-seq的實驗過程與之間介紹的DIP-seq非常類似，唯一不同是，ChIP-seq可以通過甲醛原位交聯TF與DNA，而DIP-seq只能在體外交聯。ChIP-seq的優點是更高的解析度，更低的噪音等。但它的弊端在於1.過於依賴蛋白數量，2.依賴於交聯效率，3.抗體特異性及獲取可能性。4.難以分辨直接結合還是間接結合的TF。

圖3. 多種主流TF鑒定技術的操作流程

3.2.1.5.mechanically inced trapping of molecular interactions（****MITOMI）

MITOMI是少數可以測量TF與DNA解離系數Kd的實驗技術，它具有中等通量，但卻不適合用於de novo的TFBS鑒定。MITOMI具體流程圖4：

1.將感興趣的tf固定在玻璃上，接通微流管，倒入DNA；

2.DNA結合到固定的tf上；

3.富集結合的DNA，並洗脫未結合的片段；

4.通過富集的DNA數量計算蛋白-DNA解離系數Kd。

圖4. MITOMI原理示意圖

3.2.2.通過已知TFBS尋找未知****TF

比較常見的實驗研究方法是酵母單雜交（Yeast one Hybrid，Y1H）及被稱為反向ChIP實驗 的PICh（Proteomicsof Isolated Chromatin segments）。

3.2.2.1酵母單雜交 （Y1H）

酵母單雜交能篩選到與DNA結合的蛋白質，並可直接從基因文庫中得到編碼該蛋白質的核苷酸序列，而無需復雜的蛋白質分離純化操作，故在蛋白研究中，具有一定的優勢；而且，酵母屬真核細胞，通過酵母系統得到的結果，比其他體外技術獲得的結果，更能體現真核細胞內基因表達調控的真實情況。

主要實驗過程為：

1.把感興趣的TFBS序列（Bait）插入報告基因上游，並將帶有TFBS與報告基因的質粒整合到酵母基因組中，構建含有報告基因的酵母；

2.提取mRNA構建轉錄因子cDNA文庫，並將文庫與酵母激活因子融合相連，構建「Prey」文庫。把帶有文庫的質粒轉入到步驟1的酵母中。

3.條件篩選生長酵母，如果TF與TFBS有結合，即報告基因可以順利表達。

圖5.酵母單雜交技術原理

3.2.2.2PICh實驗

PICh，又被稱為反向ChIP實驗，實際是通過分離的感興趣DNA片段富集轉錄因子，最終利用質譜技術鑒定所富集的蛋白質。PICh所分離的TF難以被識別為直接還是間接結合因子，同時，現階段來說，這項技術的通量相對較低，不適合大批量篩選TF。

注意事項

1.體外實驗雖然可以鑒別很多蛋白-DNA相互作用，但由於生物體復雜性（共調控因子，競爭性轉錄因子等），這些體外識別的相互作用難以在體內重復或發現。

2.體內實驗比較真實地還原轉錄因子-DNA之間的作用，卻難以鑒別出直接還是間接作用關系。

3.利用PBM方法可以完成de novo TFBS鑒別。

4.檢測通量一般受限於蛋白質的純化質量及數量。

5.大多數方法難以分析解離系數，因此對DNA或蛋白質的洗脫難以把握。

6.除了實驗方法，通過計算機技術鑒別結合位點的保守性從而預測新的轉錄因子目標區域已經被大量使用。但無論何種演算法，這些預測都過於簡單化TF-DNA之間的作用關系，從而造成極高的預測假陽性率。

7.(i)ChIP, HT-SELEX, 或PBM方法的目的在於發現結合序列或PWM。 (ii) MITOMI分析可用於進一步分析定量信息。(iii) ChIP實驗可用於分析體內結合信息。

附錄

多種體內外TF鑒定方法的對比：

method：方法；

synomyms：實驗名稱；

throughput：檢測通量；

materialsneeds：所需實驗材料，其中P代表protein，D代表DNA，「＋」到「＋＋＋＋」分別代表數據可用於定性，半定量，定量及動力學分析；

Datatype：實驗所產生的數據類型；

resolution：解析度（可檢測鹼基程度）。

7. 如何預測轉錄因子結合調控的靶基因

如何預測轉錄因子結合調控的靶基因
簡單的說法就是蛋白質和核酸結合的檢測方法，一般來說，在基因表達調控中，參與調控的轉長滬拜疚之狡瓣挾抱錨錄因子是各種蛋白質，因此研究轉錄因子的一個主要內容就是研究蛋白質與DNA之間的相互作用。主要的檢測方法有：
電泳遷移率改變分析
足跡法
染色質免疫沉澱
染色質免疫沉澱一DNA基因晶元
生物信息學方法
熒光素酶報告系統
基因表達譜晶元，經qPCR 和Western進一步驗證。
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