檢測質粒載體在細胞表達的方法

A. 質粒載體的四個基本特徵

一、質粒載體的四個基本特徵

1、質粒載體具有獨立復制的能力。

2、質粒載體具有選擇標記。

3、質粒載體具有獨特的酶切位點。

4、質粒載體能夠轉化但是不擴散。

二、質粒的結構及性質

質粒是細菌染色體外的DNA分子，存在於細胞質中，具有自主復制能力，使其在子代細胞中能保持恆定的拷貝數，並表達所攜帶的遺傳信息。質粒不是細菌生長繁殖所必需的物質，可自行丟失或人工處理而消除，如高溫、紫外線等。

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質粒載體的使用：

1、基因過表達

一般是將目的片段整合到病毒或者質粒載體上，在目的基因上游加入調控元件，轉染到宿主細胞中表達，使基因在人為控制的條件下實現大量轉錄和翻譯，從而實現基因產物的過表達，可以獲取大量的目的基因產物，一般是蛋白質，用於研究或生產。

2、用作報告基因

質粒載體廣泛應用於轉錄調控研究領域，包括啟動子活性分析、miRNA與靶標鑒定、轉錄調控因子鑒定及轉錄調控因子結合位點等實驗，將轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染到宿主細胞，通過檢測報告基因產物表達量，判斷啟動子和轉錄因子的結合情況。

B. 導入真核生物細胞內的質粒如何表達

導入真核的質粒表達方式有兩種，一種是瞬時表達。這種瞬時表達是由一些強啟動子控制，使目的基因在真核細胞內瞬時強行表達，表達的過程無非還是轉錄翻譯。不過這種以環形質粒導入細胞的瞬時轉染質粒很容易在復制時丟失，所以叫瞬時轉染。另一種叫穩定表達，這種一般是腺病毒載體或其他穩定轉染載體，他們是以線性方式整合到真核細胞基因當中，和真核基因一樣的表達，並擁有自己的啟動子，這種表達方式比較溫和，也會隨真核細胞的分裂而遺傳，所以叫穩定轉染。

C. 列舉3種研究基因在體內表達方式的試驗方法

目的比較不同途徑遞送質粒DNA至Balb/c小鼠體內所誘導的報告基因表達效果。方法將編碼熒光素酶(luc+)蛋白的重組質粒(pGL-3-CMV)或空載體質粒pGL-3-basic以肌肉注射或電脈沖方法將10μg或100μg上述質粒注入小鼠股四頭肌,基因槍法以三槍接種質粒於小鼠腹部(2μg質粒DNA/4.5Mpa/槍)。於質粒注入後24~144h,檢測小鼠體內的熒光素酶活性。結果肌肉注射10μg的小鼠未檢測到熒光素酶的表達;肌肉注射100μg、電脈沖法遞送10μg和100μg質粒的小鼠,接種後48h體內熒光素酶活性達到峰值,遞送100μg的小鼠體內表達量明顯高於10μg的小鼠。基因槍免疫小鼠在接種24h達到峰值。結論電脈沖和基因槍介導的基因遞送方式基因表達水平遠遠高於傳統注射方法,是基因疫苗免疫遞送的可靠方法

D. 檢測受體細胞中的目的基因是否表達的方法是什麼

首先要確認目的基因已經傳入受體細胞。然後再檢測其表達情況，一般有兩種方法：一個是通過特定性狀來判斷目的基因是否表達，比如導入的目的基因是編碼某種酶的，那麼最簡便有效的方法就是經過表達後檢測有沒有相應酶的活力，同時跑蛋白膠，看有沒有預期的目的條帶，因為對於酶來說，有時候目的基因雖然表達了，但是酶沒有活力，這時就不是表達的問題了。另外一個就是利用抗原-抗體特異性結合原理，檢測目的基因是否翻譯成蛋白。